Uno studio sulla tossicità subcronica di 13-settimana sull'2-(l-mentossi)etanolo nei ratti F344

introduzione

2-(1-mentossi)etanolo (n. CAS 38618-23-4) è un liquido limpido e incolore con un odore caratteristico ed è ampiamente utilizzato come agente aromatizzante. Il comitato congiunto di esperti FAO/OMS sugli additivi alimentari (JECFA) ha valutato 2-(l-metossi)etanolo come agente aromatizzante, classificato come sostanza strutturalmente affine al mentolo1. In base alla classe strutturale degli agenti aromatizzanti, 2-(l-metossi)l'etanolo è stato assegnato alla Classe I. Negli Stati Uniti e in Europa, i livelli di assunzione di 2-(l-metossi)l'etanolo da parte degli esseri umani è stato stimato rispettivamente a 12 ug/persona/giorno e 0,01 ug/persona/giorno, entrambi al di sotto della soglia di Classe I di 1.800 ug/persona/giorno. Sulla base di queste stime, si ritiene che 2-(1-mentossi)l'etanolo potrebbe non presentare problemi di sicurezza durante l'uso di routine come agente aromatizzante.

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As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(1-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 mg/kg di peso corporeo [peso corporeo])1. Nonostante l'uso dell'2-(1-mentossi)etanolo come agente aromatizzante, sono disponibili dati limitati riguardanti la tossicità a dosi ripetute di questo composto. Il nostro laboratorio ha studiato la tossicità di diversi additivi alimentari, inclusi agenti aromatizzanti rappresentativi di ciascuna categoria, in modelli di roditori2–7. Per chiarire il profilo tossicologico e stabilire un livello senza effetti avversi osservati (NOAEL), abbiamo condotto uno studio sulla tossicità subcronica di 13-settimane sull'2-(1-mentossi)etanolo, che è stato somministrato per via orale a ratti F344 mediante sonda gastrica.

Materiali e metodi

Prova la sostanza chimica

2-(1-mentossi)etanolo (lotto n. 5I0002, purezza 99,9%) prodotto da Takasago Int. Corp. (Tokyo, Giappone) è stato fornito dalla Divisione di standard e valutazione, Dipartimento di sicurezza alimentare, Ministero della salute, del lavoro e del welfare, Giappone, con il supporto della Japan Flavor & Fragrance Materials Association (Tokyo, Giappone). Sebbene la sostanza in esame sia stata fornita come miscela di isomeri ottici (n. CAS 38618-23-4), è stata confermata dal produttore come l-enantiomero (n. CAS 75443-64-0). La sonda gastrica con olio di mais (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Giappone) come veicolo è stata scelta come via di somministrazione a causa dell'insolubilità acquosa e della volatilità del 2-(1-mentossi)etanolo. Le soluzioni di 2-(1-mentossi)etanolo venivano preparate quotidianamente, immediatamente prima della somministrazione. Dopo la conservazione per 2 ore a temperatura ambiente, i rapporti residui di 2-(1-mentossi) etanolo in una soluzione da 4, 40 e 400 mg/ml sono stati confermati come 96,8%, 99,8% e 96,5% , rispettivamente, mediante gascromatografia (Japan Inspection Association of Food and Food Industry Environment, Tokyo, Giappone).

Animali sperimentali

In totale, 40 ratti maschi e 40 femmine esenti da agenti patogeni specifici (F344/DuCrlCrlj, 5 settimane) sono stati acquistati dai Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Giappone) e utilizzati dopo l'acclimatazione per una settimana. Durante lo studio, gli animali sono stati alloggiati in gabbie di policarbonato con lettiera morbida, mantenuti in una stanza con un sistema di barriera per controllare il ciclo luce/buio (12 h), ventilazione (tasso di ricambio d'aria di 18 volte/h), temperatura ( 24 ± 1 grado) e umidità relativa (55 ± 5%). Le gabbie e la lettiera in trucioli venivano sostituite due volte a settimana. Ogni animale aveva libero accesso all'acqua del rubinetto e ad una dieta basale (CRF-1; Oriental Yeast, Tokyo, Giappone). All'inizio dell'esperimento, gli animali sono stati assegnati in modo casuale a quattro gruppi di 10 ratti maschi e femmine ciascuno, sulla base del peso corporeo misurato immediatamente prima di iniziare il trattamento con la sostanza chimica in esame.

Progettazione dello studio

In uno studio preliminare di {{0}}giorni che valutava l'2-(1-mentossi) etanolo somministrato a dosi di 0, 200, 400 e 800 mg/ kg di peso corporeo/ giorno, il peso assoluto e relativo del fegato era significativamente aumentato in tutti i gruppi trattati di entrambi i sessi (dati non mostrati). Sulla base di questi risultati, abbiamo selezionato dosi di 2-(1-mentossi) etanolo di 0, 15, 60 e 250 mg/kg peso corporeo/giorno per la somministrazione a ratti sia maschi che femmine nel presente {{ Studio sulla tossicità di 13}}settimane.

Le condizioni generali e la mortalità sono state valutate quotidianamente. Il peso corporeo, così come la quantità della dieta fornita e quella residua, sono stati misurati una volta alla settimana durante il periodo sperimentale. Tutti i ratti sono stati tenuti a digiuno per una notte al termine del trattamento e sono stati raccolti campioni di sangue per l'ematologia e la biochimica del siero dall'aorta addominale sotto anestesia per inalazione profonda utilizzando isoflurano. Il disegno dello studio è stato basato sulle Linee guida per la designazione degli additivi alimentari e sulla revisione degli standard per l'uso degli additivi alimentari del Giappone (1996) e approvato dal Comitato per la cura e l'utilizzo degli animali dell'Istituto nazionale di scienze della salute, Giappone.

Ematologia e biochimica del siero

I seguenti parametri ematologici sono stati analizzati utilizzando gli analizzatori ematologici automatici ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA): conta dei globuli bianchi (WBC), conta dei globuli rossi (RBC), concentrazione di emoglobina (HGB), ematocrito (HCT), volume corpuscolare medio (MCV), emoglobina corpuscolare media (MCH), concentrazione corpuscolare media di emoglobina (MCHC), conta piastrinica (PLT) e cellule leucocitarie differenziali, inclusi neutrofili (Neut), linfociti (Lymph), monociti (Mono), eosinofili (Eosino) e basofili (Baso). L'analisi biochimica del siero è stata eseguita mediante Oriental Yeast per i seguenti parametri: proteine ​​totali (TP), albumina (Alb), rapporto albumina/globulina (A/G), bilirubina totale (Bil), glucosio, colesterolo totale (T-Chol), trigliceridi (TG), azoto ureico (BUN), creatinina (Cre), calcio (Ca), fosforo inorganico (IP), sodio (Na), potassio (K), cloro (Cl), aspartato aminotransferasi (AST), alanina aminotransferasi (ALT), fosfatasi alcalina (ALP) e -glutamil transpeptidasi (-GTP).

Pesi degli organi e valutazione istopatologica

È stata eseguita una necroscopia completa per tutti gli animali e sono stati pesati cervello, timo, polmoni, cuore, milza, fegato, ghiandole surrenali, reni, testicoli e ovaie. Questi organi, così come i tessuti del midollo spinale, del nervo trigemino, della ghiandola pituitaria, della cavità nasale, delle ghiandole salivari, della lingua, dell'esofago, della trachea, dell'aorta, della tiroide, delle paratiroidi, del pancreas, dello stomaco, dell'intestino tenue e crasso, dell'intestino sottomandibolare e mesenterico linfonodi, vagina, utero, vescica urinaria, ghiandola prostatica, vescicole seminali, epididimo, femore e sterno con midollo osseo, vertebre, muscoli scheletrici, nervo sciatico, pelle e ghiandola mammaria sono stati fissati in formalina tamponata neutra al 10%; quindi, sezioni incluse in paraffina sono state preparate e colorate con ematossilina ed eosina per l'esame istopatologico. I testicoli e gli occhi con le ghiandole di Harder sono stati fissati rispettivamente nel fissativo di Bouin e nella soluzione di Davidson. I tessuti ossei, compresa la cavità nasale, le vertebre, lo sterno e il femore, sono stati decalcificati utilizzando una miscela di acido formico al 10% e formalina tamponata al 10% per un massimo di 2 settimane. La valutazione istopatologica è stata eseguita per tutti i tessuti ottenuti dagli animali del gruppo di controllo e al gruppo a cui è stata somministrata la dose più alta, a meno che non siano state osservate lesioni correlate al trattamento.

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Immunoistochimica per la 2u-globulina

Nei ratti maschi, l'accumulo di 2u-globulina nel rene è stato esaminato mediante analisi immunoistochimica di sezioni incluse in paraffina. Per il recupero dell'antigene, le sezioni ottenute da 5 ratti in ciascun gruppo sono state incubate con proteinasi K (DAKO, Glostrup, Danimarca) per 1 minuto a temperatura ambiente. Tutte le sezioni sono state immerse in una soluzione al 3% di H2O2/metanolo per 10 minuti a temperatura ambiente per l'inattivazione dell'attività della perossidasi endogena. Dopo aver bloccato le reazioni non specifiche con siero di coniglio normale al 10%, le sezioni sono state incubate con un anticorpo primario per 2uglobulina (diluito 1:400; anticorpo anti-2u-globulina di ratto; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) durante la notte a 4 gradi 8. La visualizzazione del legame degli anticorpi è stata eseguita utilizzando un kit VectaStain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) e 3,3′-diaminobenzidina. Tutte le sezioni sono state controcolorate con ematossilina.

analisi statistica

Le varianze nei valori dei dati relativi al peso corporeo durante il periodo sperimentale, così come per l'ematologia, la biochimica del siero e il peso degli organi, sono state valutate per l'omogeneità utilizzando il test di Bartlett. L’analisi della varianza unidirezionale e il test di Kruskal-Wallis, rispettivamente, sono stati impiegati per dati omogenei ed eterogenei. Nel determinare le differenze statisticamente significative, è stato utilizzato il test di confronto multiplo di Dunnett per confrontare i gruppi di controllo e di trattamento. I confronti delle incidenze e dei gradi istopatologici sono stati analizzati utilizzando rispettivamente il test della probabilità esatta di Fisher e il test U di Mann-Whitney. Valori P di<0.05 were considered statistically significant.

Risultati

Parametri in vita, ematologia e biochimica del siero

Non sono stati osservati segni clinici significativi durante il periodo sperimentale e tutti gli animali sono sopravvissuti fino all'autopsia programmata. Inoltre, non sono state osservate differenze significative nel peso corporeo e nell'assunzione giornaliera di cibo nei ratti maschi e femmine (Fig. 1A e B).

I dati ematologici e biochimici del siero sono mostrati rispettivamente nelle Tabelle 1 e 2. Le analisi ematologiche hanno rivelato una diminuzione significativa di HGB, HCT, MCV e MCH e un aumento del PLT nei ratti maschi ai quali erano stati somministrati 250 mg/kg di peso corporeo/giorno di 2-(1-mentossi)etanolo (Tabella 1). Nella biochimica del siero, sono stati notati aumenti significativi di TP, T-Chol e Ca e diminuzioni di Bil e ALP nei maschi del gruppo da 250 mg/kg (Tabella 2). Un aumento significativo di Cre e una diminuzione di A/G sono stati notati nei maschi dei gruppi da 60 e 250 mg/kg. Nelle femmine, un aumento significativo di Ca e una diminuzione di ALP sono stati registrati nei gruppi da 60 e 250 mg/kg, mentre sono stati rilevati livelli elevati di T-Chol e riduzione di A/G, Bil, TG, AST e ALT nel gruppo da 250 mg. /kg gruppo. Sebbene nei maschi a cui sono stati somministrati 60 mg/kg siano stati osservati un aumento significativo dei TG e una diminuzione del Cl, l'assenza di qualsiasi relazione con la dose ha suggerito che queste differenze non erano associate all'esposizione alla sostanza in esame.

Pesi degli organi

I dati relativi al peso degli organi sono riepilogati nella Tabella 3. Il peso assoluto e relativo del fegato era significativamente aumentato in entrambi i sessi del gruppo da 250 mg/kg (Tabella 3). È stato osservato un aumento significativo del peso relativo del fegato nei maschi del gruppo trattato con 60 mg/kg. Nei maschi, il peso assoluto e relativo dei reni era significativamente aumentato nei gruppi da 60 e 250 mg/kg. Nel gruppo maschile trattato con 250 mg/kg, sono stati notati aumenti significativi del peso assoluto e relativo delle ghiandole surrenali e del peso relativo di milza e testicoli.

Istopatologia e immunoistochimica

I dati relativi ai risultati istopatologici e immunoistochimici sono riepilogati rispettivamente nelle Tabelle 4 e 5. I risultati istopatologici hanno rivelato che la frequenza di accumulo di granuli eosinofili (Fig. 2A-D), tubuli basofili e cast ialino, nonché l'infiammazione interstiziale focale nel rene, erano significativamente aumentati nei gruppi di trattamento composti esclusivamente da uomini rispetto al controllo gruppo (Tabella 4). Sulla base delle analisi immunoistochimiche, i ratti maschi trattati con la sostanza in esame hanno presentato un aumento dell'immunoreattività della 2u-globulina nelle cellule epiteliali dei tubuli prossimali, dimostrando una chiara dose-dipendenza (Fig. 2E–H) (Tabella 5).

All'esame necroscopico, un ratto maschio nel gruppo trattato con 250 mg/kg ha mostrato un grave ingrossamento del rene destro a causa di un nefroblastoma istologicamente caratteristico. Sebbene il nefroblastoma sia raro nella maggior parte dei ceppi di ratti9, questo caso è stato considerato incidentale, poiché nessun altro animale presentava lesioni simili. Inoltre, negli studi di cancerogenicità orale, l'incidenza del nefroblastoma spontaneo nei ratti maschi F344/DuCrlCrlj variava tra il 0–2,0%10. Sebbene diverse lesioni siano state rilevate sporadicamente in altri organi, non erano evidenti alterazioni significative dipendenti dal trattamento nell’incidenza di queste lesioni.

Discussione

Ad oggi, 24 agenti aromatizzanti, compreso l'2-(1-mentossi)etanolo, sono stati valutati dal JECFA come sostanze strutturalmente correlate al mentolo e sono tutti elencati come "nessun problema di sicurezza" agli attuali livelli stimati di assunzione1, 11. Il 2-(1-Mentossi)etanolo è classificato in un sottogruppo di alcoli o eteri aliciclici ed è considerato principalmente coniugato con l'acido glucuronico, seguito dall'escrezione urinaria1. Sebbene i valori LD50 orali di queste sostanze nei roditori siano relativamente elevati, i dati provenienti da studi sulla tossicità a dosi ripetute rimangono limitati. Uno studio sulla tossicità a dosi ripetute di 13-settimana ha rivelato che il mentilpirrolidone carbossilato (n. CAS 68127-22-0), un composto strutturalmente correlato al mentolo, può essere associato ad un aumento del peso relativo del fegato e dei reni negli uomini e nelle donne Ratti Wistar. L'accumulo di 2u-globulina nei tubuli prossimali dei ratti maschi è stato osservato anche alla dose di 1.111 mg/kg di peso corporeo/giorno e il NOAEL è stato determinato come 109 mg/kg di peso corporeo/giorno1.

Nel presente studio sulla tossicità subcronica di 13-settimana sull'2-(1-mentossi)etanolo, non sono stati osservati cambiamenti tossicologici nelle condizioni generali, nel peso corporeo e nell'assunzione di cibo. Dopo la valutazione ematologica, abbiamo osservato una diminuzione di HGB (96,6% rispetto ai valori medi di controllo), HCT (96,3%), MCV (98,4%) e MCH (98,2%) e un aumento di PLT (111%) nei maschi gruppo da 250 mg/kg, considerati effetti tossicologici del trattamento con 2-(1-mentossi)etanolo. Sia il peso assoluto del fegato (115% in entrambi i sessi) che relativo (119% nei maschi e 111% nelle femmine) era significativamente aumentato in entrambi i sessi nei gruppi da 250 mg/kg. Sebbene non siano stati riscontrati cambiamenti istopatologici nel fegato, sono stati riscontrati aumenti dei livelli sierici di T-Chol (110% nei maschi e 121% nelle femmine) e TP (105% nei maschi) e una riduzione dei TG (60,1% nelle femmine) nei 250 pazienti. I gruppi mg/kg indicano cambiamenti tossici associati al metabolismo dei lipidi e alla sintesi proteica nel fegato. Sono stati rilevati anche una riduzione di HGB e MCH e un aumento di PLT, T-Chol e TP nei maschi, una diminuzione dei TG e un aumento del peso assoluto e relativo del fegato in entrambi i sessi, con significatività statistica nello studio preliminare del 28-giorno (dati non mostrati ), confermando che questi parametri ematologici e biochimici sierici alterati, nonché il peso del fegato, non erano effetti accidentali ma correlati alla sostanza in esame. Al contrario, l’aumento significativo del peso relativo del fegato rilevato nel gruppo maschile 60 mg/kg nel presente studio non è stato accompagnato da un aumento del peso assoluto o da cambiamenti nei parametri biochimici correlati, suggerendo che questo aumento fosse un cambiamento adattativo.

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Si è ritenuto che un aumento significativo del peso assoluto (120%) e relativo (118%) delle ghiandole surrenali nel gruppo maschile trattato con 250 mg/kg fosse associato alla sostanza chimica in esame. Inoltre, l'aumento del peso assoluto e relativo delle ghiandole surrenali in entrambi i sessi ha mostrato una chiara dipendenza dalla dose nello studio preliminare del 28-giorno (dati non mostrati), indicando l'associazione con il trattamento con la sostanza chimica in esame. Sebbene l’ipertrofia surrenale possa derivare dallo stress, non sono stati riscontrati risultati suggestivi di stress, come un ridotto aumento di peso corporeo o atrofia del timo e di altri organi linfoidi, sia negli studi attuali che in quelli preliminari. Poiché in caso di inibizione degli enzimi correlati alla steroidogenesi12 potrebbero non verificarsi alterazioni istopatologiche nella ghiandola surrenale anche con una ridotta produzione di glucocorticoidi, non si può escludere la possibilità che l'aumento di peso della ghiandola surrenale sia un risultato tossico. Al contrario, l’aumento del peso relativo della milza e dei testicoli nel gruppo maschile trattato con 250 mg/kg, non osservato nello studio preliminare, è stato considerato tossicologicamente insignificante a causa dell’assenza di lesioni istopatologiche o dell’aumento significativo del peso assoluto. Allo stesso modo, la biochimica del siero ha rivelato una diminuzione di A/G e un aumento di Ca in entrambi i sessi, che non è stato considerato avere alcun significato tossicologico, considerando che non sono state rilevate anomalie nei parametri correlati. Inoltre, la diminuzione dei livelli di Bil e ALP in entrambi i sessi e la diminuzione di AST e ALT nelle femmine erano in contrasto con gli effetti tossici attesi e sono stati considerati non significativi.

È stata osservata con significatività statistica una nefropatia cronica caratterizzata da tubuli basofili, cast ialino e infiammazione interstiziale focale nei maschi di tutti i gruppi trattati. Inoltre, nei gruppi maschili trattati con 60 e 250 mg/kg sono stati rilevati un aumento della Cre sierica e del peso assoluto e relativo dei reni; questi cambiamenti non sono stati osservati nei gruppi di trattamento femminili. In questi casi, il grado di accumulo dei granuli eosinofili nelle cellule epiteliali del tubulo prossimale risultava aumentato in modo apparentemente dose-dipendente. Questi granuli sono stati confermati come 2u-globulina mediante immunoistochimica, indicando la presenza di nefropatia da 2u-globulina. Le 2u-globuline legate a determinate sostanze chimiche, come il d-limonene, si accumulano nei lisosomi e si osservano nei tubuli prossimali come granuli eosinofili o ialini9. Questo accumulo può danneggiare le cellule epiteliali, portando a nefropatia cronica progressiva e conseguente formazione di tumori9. Pertanto, sebbene non sia stato identificato il NOAEL per l'2-(1-mentossi)etanolo associato alla nefropatia da 2u-globuline nei reni dei ratti maschi, questo tipo di nefropatia sarebbe specifico per i ratti maschi e quindi non rilevante per l'uomo. valutazione del rischio13. Un aumento del rischio di insufficienza renale mediato da meccanismi legati all'accumulo di 2u-globulina è altamente improbabile, poiché questa proteina è assente nell'uomo14. Pertanto, si è ritenuto ragionevole escludere dalla determinazione del NOAEL i cambiamenti associati alla nefropatia cronica osservati nei maschi.

In conclusione, il presente studio sulla tossicità subcronica della 13-settimana ha dimostrato che il trattamento con 250 mg/kg di peso corporeo/giorno di 2-(1-mentossi) etanolo ha causato cambiamenti tossici nell'ematologia, nella biochimica del siero e nel peso degli organi nei ratti F344 maschi e femmine. Sulla base dei risultati osservati, il NOAEL di 2-(1-mentossi)etanoloè stato valutato come 60 mg/kg di peso corporeo/giorno per entrambi i sessi.

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