Uno studio comparativo delle proprietà e del meccanismo antietà: resveratrolo e restrizione calorica

ASTRATTO

Il resveratrolo e la restrizione calorica (CR) sono potenti opzioni terapeutiche peranti età. Qui, il loro effetto comparativo sugene associato alla longevitàregolatore delle informazioni di silenziamento (SIRT1) è stato valutato in vitro e in vivo. Cellule IMR-90 trattate con 2,2'-azobis (2-amidinopropano) dicloridrato (AAPH) sono state applicate per stabilire un modello di senescenza cellulare e sono stati utilizzati ratti trattati con D-galattosio (D-gal) come unmodello animale invecchiato. Resveratrolo e CR hanno mostrato risultati similiattività antietà, evidenziato dainibendo la senescenza e l'apoptosi e ripristinando il deterioramento cognitivo e il danno ossidativo. Inoltre, potrebberoup-regolare la telomerasi(TE) attività,aumentare le espressioni di SIRT1, forkhead box 3a (Foxo3a), un regolatore attivo di SIRT1 (AROS) e dell'antigene Hu R (HuR), ma diminuisce i livelli di p53 ed eliminati nei livelli di carcinoma mammario 1 (DBC1). Tuttavia, 10 μM di resveratrolo in vitro e il gruppo ad alto dosaggio in vivo hanno mostratoattività relativamente più forti di livelli SIRT1 antietà e stimolanti rispetto a CR. Insomma, resveratrolo e CR hanno mostrato risultati similiattività antietàsulla segnalazione SIRT1,implicando il potenziale del resveratrolo come mimetico della CR.

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INTRODUZIONE

I miglioramenti nell'assistenza sanitaria hanno contribuito ad aumentare l'aspettativa di vita umana negli ultimi decenni e la popolazione anziana sta quindi aumentando in modo significativo. Sfortunatamente, questo significa ancora un aumento dei periodi di cattiva salute o disabilità. Attualmente, una varietà di malattie legate all'invecchiamento sta emergendo come le maggiori minacce per la salute nella maggior parte dei paesi sviluppati. Sebbene non sia ancora possibile modificare il nostro patrimonio genetico, sono attualmente emerse varie strategie anti-invecchiamento come stili di vita sani e interventi terapeutici, con l'obiettivo di ridurre l'incidenza dei fattori di rischio di cattiva salute [1].

CR, diminuzione dell'apporto calorico senza malnutrizione, è uno degli interventi più robusti che aumentano la durata della vita negli organismi modello dal lievito ai primati [2]. Potrebbe proteggere dal deterioramento delle funzioni biologiche, riducendo l'incidenza e ritardando l'insorgenza di molteplici malattie legate all'età. Il meccanismo mediante il quale la CR prolunga la durata della vita comporta il ritardo della crescita, la riduzione del grasso corporeo, il ritardo dei cambiamenti neuroendocrini o immunologici, l'aumento delle capacità di riparazione del DNA, l'espressione genica alterata, l'aumento dell'apoptosi, la riduzione della temperatura corporea e la depressione del tasso metabolico e il miglioramento dell'attività ossidativa sforzo [3]. L'effetto anti-invecchiamento della CR è stato fortemente associato a un aumento del livello e all'attivazione dei membri della famiglia delle sirtuine e anche correlato ad altre vie di segnalazione molecolare, tra cui il coattivatore del recettore G attivato dal proliferatore del perossisoma- 1 (PGC{{ 6}}), protein chinasi attivata dall'adenosina monofosfato (AMPK), insulina/fattore di crescita dell'insulina-1 e bersaglio della rapamicina [1, 4]. Tuttavia, la maggior parte delle persone non rispetterebbe un programma dietetico così rigoroso, soprattutto a lungo termine. Pertanto, la ricerca recente è sempre più mirata a determinare la fattibilità e l'efficacia di molecole/trattamenti mimetici CR naturali e/o farmacologici senza diminuire il consumo di cibo [5].

Il resveratrolo è un polifenolo vegetale che si trova comunemente in varie piante, tra cui la buccia dell'uva, bacche e arachidi. È interessante notare che l'incorporazione del resveratrolo negli integratori alimentari o negli alimenti può essere una potente opzione terapeutica per l'anti-invecchiamento e diversi rapporti indicano che il trattamento con resveratrolo produce effetti benefici simili a quelli della CR [6], implicando il potenziale del resveratrolo come mimetico della CR [4]. Recentemente, è stato dimostrato che il resveratrolo prolunga la durata della vita aumentando significativamente l'attività di SIRT1, con conseguente aumento dell'affinità di SIRT1 sia per NAD plus che per il substrato acetilato [7, 8], che è anche responsabile della longevità causata dalla CR. Sebbene il resveratrolo e la CR siano stati ampiamente studiati per i loro potenziali benefici per la salute, poco si sa sui loro effetti comparativi. In questo studio abbiamo confrontato l'effetto antietà del resveratrolo e della CR in vivo e in vitro rilevando la via SIRT1.

RISULTATI

Il resveratrolo e la CR hanno ridotto la colorazione -galattosidasi (SA -gal) associata alla senescenza nelle cellule IMR-90 trattate con AAPH

Sfruttando un modello di senescenza indotta da AAPH delle cellule IMR-90, abbiamo testato il possibile effetto sulla colorazione SA- -gal. Come mostrato nella Figura 1, le cellule trattate con AAPH mostravano una colorazione più ampiamente e fortemente positiva rispetto alle cellule di controllo e la colorazione positiva nelle cellule di controllo era relativamente scarsa. È stato riscontrato che il trattamento con resveratrolo (5 μM, 10 μM e 20 μM) o CR offre una marcata protezione nella senescenza indotta da AAPH. Inoltre, confrontando l'effetto del resveratrolo con la CR, le cellule trattate con 10 μM di resveratrolo hanno mostrato una colorazione SA- -Gal positiva relativamente meno frequente rispetto al trattamento con CR. Pertanto, questi risultati hanno suggerito che 10 μM di resveratrolo inibiscono in modo più efficiente la senescenza indotta da AAPH rispetto alla CR.

Analisi al microscopio elettronico a scansione di cellule IMR- 90

L'indagine al microscopio elettronico a scansione ha fornito alcuni nuovi dettagli sulla struttura delle cellule trattate con AAPH (Figura 2). L'IMR normale -90 appariva come cellule completamente diffuse con una tipica forma fusiforme. La maggior parte delle cellule conteneva due processi di assottigliamento e mostrava poche macchie. Le cellule trattate con AAPH mostravano una morfologia ingrandita e appiattita con numerose macchie. Al contrario, l'osservazione al microscopio elettronico a scansione di campioni di IMR-90 trattati con resveratrolo o CR dopo la somministrazione di AAPH indicava chiaramente che, sebbene fosse possibile rilevare alcuni bleb, la normale forma fusiforme era generalmente mantenuta insieme alla completa diffusione.

Il resveratrolo e la CR hanno ridotto l'apoptosi nelle cellule IMR-90 trattate con AAPH

La fosfatidilserina sulla superficie delle cellule, considerata come il segno distintivo dell'apoptosi nella fase iniziale, è stata determinata mediante analisi di colorazione PI/Annexin V (Figura 3). Le cellule apoptotiche sono composte sia da cellule apoptotiche precoci colorate con annessina-V-FITC sia da cellule apoptotiche tardive o necrotiche colorate con annessina-V-FITC e PI. La popolazione di cellule apoptotiche stava aumentando significativamente nel gruppo AAPH (34,54%), rispetto al gruppo negativo (7,32%). Mentre è stato scoperto che il trattamento con resveratrolo (5 μM, 10 μM e 20 μM) o CR riduce l'apoptosi nelle cellule IMR -90 indotte da AAPH. Inoltre, il trattamento con resveratrolo 10 μM (11,58%) ha ridotto in modo più efficiente l'apoptosi indotta da AAPH rispetto al trattamento con CR (16,78%).

Cambiamento dell'aspetto generale e del peso corporeo

Durante l'intero processo dell'esperimento, i ratti modello di invecchiamento hanno ricevuto D-gal alla dose di 200 mg/kg ogni giorno ed è stato osservato l'aspetto generale. Rispetto a quello dei normali ratti di controllo, i ratti nel gruppo modello D-gal sono diventati gradualmente apatici, ottusi e lenti nella risposta; i capelli di quelli del gruppo modello hanno perso gradualmente elasticità e sono diventati fragili; la pelle diventava sottile, anelastica e poco a poco cadeva. Tuttavia, il trattamento simultaneo con resveratrolo o CR con D-gal nei ratti ha mostrato un'inversione dei cambiamenti di cui sopra, rispetto al gruppo D-gal. Non c'era alcuna differenza nel peso corporeo tra i gruppi sperimentali durante il periodo di trattamento, ad eccezione del gruppo CR con quasi nessun aumento di peso durante l'esperimento (Figura 4).

Il resveratrolo e la CR hanno migliorato l'apprendimento spaziale e la memoria dei ratti SD

Abbiamo valutato l'apprendimento spaziale e la capacità di memoria dei ratti eseguendo il test del labirinto acquatico di Morris. Come mostrato nella Figura 5, tutti e cinque i gruppi sono stati in grado di apprendere il compito con successo, come evidenziato dalla graduale riduzione della latenza di fuga e dall'aumento della velocità di nuoto nei 4 giorni della fase di navigazione del luogo. Analizzate con il metodo ANOVA a due vie, sono state mostrate differenze significative sia nella latenza media di fuga che nella velocità di nuoto tra i giorni di allenamento (F(3,138)=41.660, P <0. 01; F(3,138)=10.013, P < 0.01, rispettivamente) e tra i trattamenti (F(4,46 )=36.762, P < {{40}}.01; F(4,46)=20.102, P < 0.01, rispettivamente) ma nessuna interazione tra i fattori giorno e trattamento (F(12,138)=0.846, P > 0,05; F(12,138)=1.084, P > 0,05, rispettivamente). La latenza di fuga nel gruppo D-gal era nettamente più lunga di quella nel gruppo di controllo (P <0,01) (analisi post-hoc, Figura 5A). Nel frattempo, i ratti nel gruppo resveratrolo più D-gal o gruppo CR più D-gal hanno mostrato un'inversione dei suddetti cambiamenti nella latenza di fuga rispetto al gruppo D-gal (P <0,01) (Figura 5A), e hanno notevolmente accorciato la fuga latenza a livelli simili con il gruppo di controllo. Risultati simili sono stati ottenuti per la velocità di nuoto dei ratti (Figura 5B), e i ratti nel gruppo resveratrolo più D-gal e gruppo CR più D-gal hanno mostrato notevoli aumenti della velocità di nuoto rispetto al gruppo D-gal (P <0,01 ). Tuttavia, i ratti ad alte dosi di resveratrolo più il gruppo D-gal hanno mostrato una latenza di fuga relativamente più lunga e una velocità di nuoto inferiore rispetto al gruppo CR più D-gal.

Figura 1: Il resveratrolo e la restrizione calorica riducono la colorazione SA- -gal nelle cellule IMR-90 trattate con AAPH. Le cellule IMR - 90 indotte da AAPH sono state trattate con restrizione calorica (CR) o resveratrolo (RES) alla concentrazione indicata per 2 giorni. L'ingrandimento era 20×.

Figura 2: Analisi al microscopio elettronico a scansione delle cellule IMR-90. Le cellule IMR -90 indotte da AAPH sono state trattate con restrizione calorica (CR) o resveratrolo (RES) alla concentrazione indicata per 2 giorni. L'ingrandimento era 6000×.

Figura 3: Il resveratrolo (RES) e la restrizione calorica (CR) hanno ridotto l'apoptosi nelle cellule IMR-90 trattate con AAPH. Le cellule sono state colorate con annessina V-FITC/PI e analizzate mediante citometria a flusso. Il canale FL1 è stato utilizzato per rilevare la colorazione annessina-V-FITC e il canale FL2 per la colorazione PI

Nella fase della sonda spaziale (Figure 5C e 5D), si è potuto vedere che ci sono state notevoli riduzioni degli attraversamenti di piattaforme nel gruppo D-gal rispetto a quello nel gruppo di controllo (P <0.{{6} }1). È interessante notare che il numero medio di volte in cui i ratti hanno attraversato la piattaforma è migliorato significativamente dopo la somministrazione di resveratrolo o CR, rispetto a quello del gruppo D-gal (P <0,01). Tuttavia, i ratti ad alte dosi del gruppo resveratrolo più D-gal hanno attraversato la piattaforma più frequentemente rispetto a quelli del gruppo CR più D-gal.

Questi risultati hanno indicato che i ratti modello di invecchiamento presentavano menomazioni nell'apprendimento spaziale e nella memoria, mentre il trattamento con resveratrolo o CR potrebbe ripristinare il deterioramento cognitivo correlato all'età causato dalla somministrazione di D-gal. Inoltre, i ratti modello di invecchiamento trattati con un'alta dose di resveratrolo hanno mostrato un comportamento relativamente più efficace rispetto a quelli trattati con CR.

Effetto del resveratrolo e della CR sui livelli di SOD, T-AOC, MDA e lipofuscina nei ratti anziani

I livelli di SOD, T-AOC, MDA e lipofuscina nei ratti sono stati valutati per confermare se gli effetti anti-invecchiamento del resveratrolo e della CR fossero mediati dall'alleviamento dello stress ossidativo causato dalla somministrazione di D-gal. La tabella 1 mostra i livelli di SOD, T-AOC e MDA nel siero, nel fegato e nel cervello nei ratti normali e anziani. L'esposizione a D-gal ha ridotto significativamente i livelli di SOD e T-AOC ma ha aumentato il livello di MDA nel siero, nel fegato e nel cervello rispetto al gruppo di controllo (P <0.05). Il trattamento simultaneo di resveratrolo o CR con D-gal nei ratti ha causato una diminuzione dell'attività del livello di MDA ma un aumento dei livelli di SOD e T-AOC rispetto al gruppo D-gal. Tuttavia, rispetto al trattamento CR, i risultati hanno mostrato che la somministrazione di alte dosi di resveratrolo era relativamente superiore.

Figura 4: Effetto del resveratrolo e della restrizione calorica sul peso corporeo dei ratti trattati con D-gal durante l'esperimento. Tutti i valori sono stati espressi come media ± SD. NG, gruppo di controllo negativo; MG, gruppo di controllo del modello; RESL, basso dosaggio del gruppo resveratrolo; RESH, gruppo ad alta dose di resveratrolo; CR, gruppo di restrizione calorica.

Figura 5: Effetto del resveratrolo e restrizione calorica sul comportamento dei ratti trattati con D-gal con labirinto d'acqua Morris. (A) Confronto delle latenze rispetto alla piattaforma durante 4 giorni di formazione. Ogni topo è stato sottoposto a 4 prove al giorno. (B) Confronto della velocità di nuoto durante 4 giorni di allenamento. (C) Confronto dei numeri di piattaforme di attraversamento in cui la piattaforma è stata rimossa per la prova della sonda. (D) La tipica pista di nuoto nella prova della sonda. Tutti i valori sono stati espressi come media ± SD. * P < 0.05, **P < {{10}}.01 rispetto al gruppo di controllo negativo; # P <0,05, ##P <0,01 rispetto al gruppo di controllo del modello. NG, gruppo di controllo negativo; MG, gruppo di controllo del modello; RESL, basso dosaggio del gruppo resveratrolo; RESH, gruppo ad alta dose di resveratrolo; CR, gruppo di restrizione calorica.

Tabella 1: Stato degli antiossidanti nel tessuto e nel sangue dei ratti in ciascun gruppo

Nota: i valori erano la media ± SD. * P < {{0}}.05, **P < 0.01 rispetto al gruppo di controllo (tutti i gruppi); # P < 0.05, ##P < 0.01 rispetto al gruppo modello (gruppo CR e gruppo RES); ∆P <0,05, ∆∆P <0,01 rispetto al gruppo CR (gruppo RES). NG, gruppo di controllo negativo; MG, gruppo di controllo del modello; RESL, basso dosaggio del gruppo resveratrolo; RESH, gruppo ad alta dose di resveratrolo; CR, gruppo di restrizione calorica.

è relativamente superiore. L'accumulo di lipofuscina è una delle caratteristiche più consistenti dell'invecchiamento cerebrale. Come mostrato nella Figura 6, i ratti trattati con D-gal hanno mostrato un aumento significativo del livello di lipofuscina rispetto al gruppo di controllo (P <0.01). Tuttavia, il trattamento con resveratrolo e CR ha ridotto l'accumulo di lipofuscina nella corteccia cerebrale dei ratti anziani rispetto ai ratti trattati con D-gal (P < 0.01). Inoltre, non vi erano differenze tra il gruppo resveratrolo più D-gal e il gruppo CR più D-gal (P > 0,05).

Resveratrolo e CR hanno regolato l'attività della telomerasi nei ratti che invecchiano

Abbiamo valutato l'effetto del resveratrolo e della CR sull'attività della telomerasi nei tessuti epatici e cerebrali (Figura 7). I nostri risultati hanno mostrato che il trattamento non ha avuto alcun effetto significativo sull'attività della telomerasi nei tessuti epatici (P > 0.05). Tuttavia, l'attività della telomerasi è stata ridotta nel gruppo di somministrazione di D-gal rispetto al controllo (P <0.05). Nel frattempo, il resveratrolo o la CR potrebbero aumentare l'attività della telomerasi nella somministrazione di D-gal più il gruppo di trattamento con resveratrolo o CR. Inoltre, non c'erano differenze tra il gruppo resveratrolo e il gruppo CR (P > 0,05).

Figura 6: Effetto del resveratrolo e della restrizione calorica sul livello di lipofuscina dei ratti anziani. Tutti i valori sono stati espressi come media ± SD. * P < 0.05 rispetto al gruppo di controllo negativo; # P <0,05 rispetto al gruppo di controllo del modello. NG, gruppo di controllo negativo; MG, gruppo di controllo del modello; RESL, basso dosaggio del gruppo resveratrolo; RESH, gruppo ad alta dose di resveratrolo; CR, gruppo di restrizione calorica.

Il resveratrolo e la CR hanno aumentato l'espressione dell'mRNA di SIRT1 indotta da AAPH PCR. I risultati hanno dimostrato che l'espressione dell'mRNA di SIRT1 nelle cellule IMR-90 era significativamente ridotta dall'AAPH. Resveratrolo e CR potrebbero recuperare in modo efficiente i livelli di espressione dell'mRNA di SIRT1 nelle cellule trattate con AAPH e 10 μM di resveratrolo era la concentrazione ottimale per stimolare l'espressione dell'mRNA di SIRT1 nelle cellule IMR-90 (P <0,01; Figura 8)