Un lungo RNA non codificante conservato, GAPLINC, modula la risposta immunitaria durante lo shock endotossico

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Significato

L'infiammazione è stata ampiamente studiata nel contesto dei geni codificanti le proteine. Studi recenti hanno scoperto gli IncRNA come importanti regolatori dell'immunità. La caratterizzazione funzionale di questi geni rimane un'area attiva di ricerca. In questo studio, identifichiamo GAPLINC come funzionalmente conservatoIncRNAtra umani e topi. L'esaurimento di GAPLINC si traduce in una maggiore espressione dei geni della risposta immunitaria che sono direttiNF-kBobiettivi. Sorprendentemente, osserviamo che i topi knockout Gaplinc mostrano resistenza allo shock endotossico indotto da LPS e scopriamo che l'espressione basale dei geni infiammatori previene la formazione di punti per proteggere dall'insufficienza multiorgano e dalla morte. Questi risultati hanno implicazioni nel trattamento della sepsi, in cui le nuove terapie mirate agli IncRNA possono fornire preziose informazioni per comprendere l'infiammazione e migliorare i risultati dei pazienti.

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FG 1. Identificazione e caratterizzazione di macrofagi specificiIncRNA GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1,000-fok). (C) Analisi RNA-Seq diGAPLNCespressione durante la differenziazione da monociti a macrofagi per i punti temporali indicati. L'espressione GAPLINC è rappresentata come copie per cellula (FPKM. (D) La mappa di calore rappresenta l'espressione genica da un pannello Nanostring personalizzato, che mostra i primi 10 InciNA differenzialmente espressi confrontando i monociti con i macrofagi in cellule umane primarie e cellule THP-1. I dati di Nanotring sono stati eseguiti in duplicati biologici. (E) Uno schema per cellule progenitrici di granulociti-monociti che dà origine a due popolazioni distinte; 1) MDDC e 2) MDM. La traccia del browser del genoma UCSC mostra le letture di RNA-Seq da monociti, macrofagi e cellule dendritiche alGAPLINCluogo. () Analisi qPCR di RNA purificati dalle frazioni nucleare (bianco) e citoplasmatico (grigio) in MDM (analisi G qPCR di Russ isolata da diverse frazioni di polisomi di sistemi MDM (gradiente di saccarosio dal 10 al 50 percento, SW41, 40 K rpm, per ~ 1,5 ore).

Studi recenti hanno identificato migliaia di lunghi RNA non codificanti (ncRNA) nei genomi dei mammiferi che regolano l'espressione genica in diversi processi biologici. Sebbene gli IncRNA siano stati identificati in una varietà di cellule immunitarie e siano implicati nella risposta immunitaria, la funzione biologica e il meccanismo della maggior parte rimangono inesplorati, specialmente nella sepsi. Qui, identifichiamo un ruolo per un hdRNA - adenocarcinoma gastrico predittivo lungo RNA intergenico non codificante (GAPLINC) - precedentemente caratterizzato per il suo ruolo nel cancro, ora nel contesto dell'immunità innata, dei macrofagi e dello shock endotossico indotto da LPS. L'analisi del trascrittoma dei macrofagi di esseri umani e topi rivela che GAPLINC è un IndRNA conservato altamente espresso dopo la differenziazione dei macrofagi. Dopo l'attivazione infiammatoria, GAPLINC viene rapidamente sottoregolato. I macrofagi impoveriti di GAPLINC mostrano una maggiore espressione di geni infiammatori al basale, mentre la sovraespressione di GAPLINC sopprime questa risposta. Coerentemente con i cel impoveriti di GAPLINC, i topi knockout Gaplinc mostrano livelli basali migliorati di geni infiammatori e mostrano resistenza aIndotto da LPSshock endotossico. Meccanicamente, la sopravvivenza è legata all'aumento dei livelli di NF-xB nucleare nei topi knockout Gaplinc che guidano l'espressione basale dei geni bersaglio in genere attivati ​​​​solo in seguito alla stimolazione infiammatoria. Mostriamo che questa attivazione dei geni della risposta immunitaria prima della sfida LPS porta a de-aree la formazione di coaguli di sangue, che protegge i topi knockout Gaplinc dall'insufficienza multiorgano e dalla morte. Insieme, i nostri risultati identificano una funzione precedentemente sconosciuta per GAPLINC come regolatore negativo dell'infiammazione e scoprire un ruolo chiave per questo lncRNA nella modulazione dello shock endotossico.

Fig.2. GAPLINC è un regolatore negativo dell'infiammazione e dipende dalla segnalazione di Nf-sB. I monociti isolati da PBMC umani e differenziati in macrofagi sono stati trasfettati con controllo o siRNA GAPLINC. (UN)Seqanalisi dell'RNAsu GAPLINC kd o controllo siRNA MDM. RNA-Seq è stato eseguito in duplicati biologici. I risultati sono rappresentati in un grafico del vulcano. I geni significativamente sovraregolati con cambiamento di piega maggiore o uguale a 2 sono riquadrati in rosso. (6) Analisi GO-Term su geni significativamente sovraregolati. (C) La mappa termica rappresenta l'espressione genica dei principali geni immuno-correlati sovraregolati su GAPLINC kd. I dati di RNA-Seq sono stati eseguiti in duplicati biologici. Le isoforme (D) GAPLINC negli MDM sono state determinate mediante sequenziamento R2C2 basato su Nanopore. I dati del sequenziamento di Nanopore sono stati eseguiti in duplicati biologici (i dati grezzi sono disponibili su SRAunder Bloproject PRINA639136). (E) Una tabella che rappresenta i conteggi di lettura e la percentuale di ciascuna isoforma GAPLINC. (F) Vettore bidirezionale che esprime GFP-Zetocin da un lato e GAPLINC dall'altro. (G e H) Analisi qPCR dell'espressione GAPLINC in cellule THP-1 che esprimono GAPLINC ectopico o controllo vettoriale vuoto. I livelli di IL6 sono stati quantificati dopo stimolazione con LPS (200 nal mL) per 6 h; i dati sono stati raccolti da tre esperimenti indipendenti.*P<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), U analisi qPCR di GAPLINC in MDM （n {0}}）pretrattato con DMSO o BAY-7082（10μM）, seguita da stimolazione LPS （200 ngmL） per 6 ht i dati sono stati raccolti da tre esperimenti indipendenti. *P<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

la sepsi è una malattia pericolosa per la vita causata da una reazione eccessiva del corpo alla presenza di un'infezione, che può portare rapidamente a insufficienza multiorgano e morte. Il sistema immunitario è essenziale nel fornire protezione contro le infezioni; tuttavia, l'attivazione incontrollata può avere gravi conseguenze per l'host. Secondo i Centers for Disease Control and Prevention, un paziente su tre che muore in ospedale ha la sepsi(1). eppure non comprendiamo ancora i meccanismi molecolari sottostanti che portano alla fatalità. Le opzioni cliniche per il trattamento della sepsi sono limitate alla somministrazione di liquidi, antibiotici e cure di supporto e sono rimaste sostanzialmente invariate per decenni. Sebbene la diagnosi precoce e il trattamento rapido abbiano migliorato gli esiti della sepsi(2), è necessario sviluppare nuove terapie. Sebbene siano stati condotti studi sull'espressione genica per esaminare potenziali bersagli terapeutici per la sepsi, questi bersagli rimangono in gran parte non caratterizzati(3). Abbiamo identificato un lungo RNA non codificante (lncRNA) con ruoli nel controllo della risposta immunitaria e dello shock endotossico che fornisce strade per lo sviluppo di nuovi farmaci per colpire la sepsi.

Risultato

Fig. 3. GAPLIN è conservato nei topi e regola la risposta allo shock endotossico. (4) GAPLINC si conserva in sintenia. GAPLINC si trova su Chr18 negli esseri umani e su Chr17 nei topi, tra i geni codificanti proteine ​​Dlgap1 e Gift. Dlgapil non è espresso inmacrofagi. (B)MCA mostra la distribuzione dei livelli di Gaplinc in vari tipi di cellule immunitarie (BM). (C) analisi qPCR dell'espressione di Gaplin in cellule B e BMDM; questi dati (media ± SD) sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti, (D) analisi qPCR dell'espressione Gaping in BMDMEstimolato con LPS (200 na/mL) per 6 ore; questi dati (media ± DS) sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (E) Schema del locus Gaplinc prima e dopo la cancellazione mediata da CRISPRCas9. Le linee tratteggiate indicano la regione approssimativa di eliminazione. Il gel rappresenta l'amplificazione PCR dei dati genomici. Le lunghezze dell'amplicone vengono confrontate per i topi WT e Gaping KO, (F) analisi qPCR dell'espressione di Gaplinc nei BMDM WT e Gaplinc-KO utilizzando una combinazione di primer per rilevare le regioni di Exon1, Exon2 e esone della trascrizione di Gaplinc; questi dati (media ± DS) sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (G) Analisi RNA-Seq in BMDM da topi WT e Gaplinc KO (n =3). I risultati sono rappresentati in un grafico del vulcano. I geni significativamente sovraregolati con un cambiamento di piega maggiore o uguale a 2 sono mostrati in rosso. (H) Analisi GO-Term su geni significativamente sovraregolati. (I e J) I dati di sopravvivenza dei topi WT e Gaplinc KO sono mostrati in risposta alla sfida LPS di E. coli (5 mg/kg/topi) (n =6 su 10). Il test statistico delle differenze è stato contato utilizzando il test log-rank (Mantel-Cox). "…P< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

Poiché l'espressione di lncRNA può regolare la risposta immunitaria influenzando la differenziazione delle cellule immunitarie e la loro rispettiva funzione (4-7), volevamo studiare il ruolo degli ncRNA nei macrofagi. I macrofagi sono importanti cellule immunitarie innate che possono essere derivate dai monociti e sono fondamentali per il riconoscimento dei patogeni attraverso l'uso di recettori Toll-like (TLR). Dopo l'attivazione. I TLR avviano complesse vie di segnalazione che attivano fattori di trascrizione chiave come NF-kB. Portando alla trascrizione di centinaia di geni della risposta immunitaria(8).

Per identificare gli IncRNA coinvolti nella differenziazione e nella funzione dei macrofagi, abbiamo condotto il sequenziamento dell'RNA (RNA-Seq) in entrambi i macrofagi (MDM) derivati ​​da monociti primari umani e nella linea cellulare monocitica THP -1 s (Fig. lA e SI Appendice. Fig. S1). Abbiamo identificato l'RNA non codificante intergenico lungo predittivo dell'adenocarcinoma gastrico (GAPLINC) come l'IncRNA più sovraregolato durante la differenziazione da monociti a macrofagi (Fig. 1B). I livelli di GAPLINC erano rilevabili entro il giorno 1 e aumentati a ~ 300 copie per cellula (Fig. 1C). Utilizzando la tecnologia di profilazione dell'RNA (nCounter, Nanostring), abbiamo convalidato GAPLINC come uno dei primi 10 mRNA espressi in MDM primari differenziati e THP-1 (Fig1D). Abbiamo anche confermato che GAPLINC è altamente espresso negli MDM ma non nelle cellule dendritiche derivate da monociti (MDDC) strettamente correlate (Fig. 1E), suggerendo che l'espressione di GAPLINC è specifica per il tipo cellulare. Eseguendo un esperimento di frazionamento cellulare e misurando i livelli di GAPLINC nei compartimenti citoplasmatico e nucleare dei macrofagi utilizzando qPCR, abbiamo scoperto che GAPLINC è localizzato prevalentemente nel citosol rispetto a CD14, un mRNA citoplasmatico, e NEAT1, un IncRNA nucleare (Fig. 1F). Ciò è coerente con i risultati nelle cellule tumorali, in cui GAPLINC è localizzato principalmente nel citoplasma(9). Per garantire che GAPLINC non sia codificante, abbiamo eseguito la profilazione del polisoma, un metodo utilizzato per analizzare se un gene è attivamente tradotto in proteine. Contrariamente a CD14, né NEATI né GAPLINC sono stati trovati nella frazione ad alto polisoma, suggerendo che GAPLINC non è tradotto (Fig 1G),

Fig.4. Gaplnc KO sovraregola gli IRG e mostra un aumento del livello di p65 nel nudo al basale. (A) Livelli di citochine nel siero di topi WT e Gaplinc KO da basal.n=4 a 7,*P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

Successivamente, abbiamo studiato l'effetto del silenziamento di GAPLINC sulla differenziazione dei macrofagi. Poiché i livelli di GAPLINC sono aumentati durante la differenziazione, abbiamo ipotizzato che il knock-down (KD) di GAPLINC avrebbe un impatto sui geni coinvolti nella differenziazione. Utilizzando il piccolo RNA interferente (siRNA) in pool, abbiamo raggiunto dal 55 al 65% di kd di GAPLINC negli MDM primari (SIAappendice, Fig. S2). Abbiamo eseguito RNA-Seq e identificato un numero di geni che erano disregolati su GAPLINC kd (Fig. 24). Abbiamo confermato i migliori risultati utilizzando Nanostring (appendice SI, Fig. S3). L'analisi dell'arricchimento dell'ontologia genica (GO) ha mostrato che i geni della risposta immunitaria erano significativamente sovrarappresentati nei geni sovraregolati su GAPLINC kd e non nei geni coinvolti nella differenziazione dei macrofagi, contrariamente alla nostra ipotesi originale. (Fig. 2B). In particolare, i geni differenzialmente espressi nelle cellule GAPLINC-KD includono citochine e chemochine proinfiammatorie (IL6, CXCL10 e TNFSF10), geni stimolati dall'IFN (ISG) (IFIT2 e RSAD2) e proteine ​​​​leganti il ​​guanilato (GBP) (GBP3 e GBP5) (Fig. 2C e Appendice SI. Fig. S4). Per verificare che la differenziazione dei macrofagi non sia stata influenzata da GAPLINC kd. i livelli di CD11B.CD16 e CD14 sono stati misurati nei macrofagi trattati con controllo e segnalazione e sono stati trovati simili (appendice SI. Fig S5). Successivamente, abbiamo utilizzato un ulteriore approccio kd utilizzandoCRISPRinibizione (CRISPRi) per colpire il sito di inizio trascrizionale mediante GAPLINCusando tre diversi RNA guida (gRNA) in cellule THP-1 stimolate con forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA). Abbiamo raggiunto oltre l'80 percento di kd di GAPLINC e abbiamo nuovamente osservato una maggiore espressione della citochina proinfiammatoria IL6 quando GAPLINC viene abbattuto al basale (appendice SI. Fig. S6 A e B). È interessante notare che, dopo l'attivazione del lipopolisaccaride (LPS), i livelli di IL6 erano simili nel controllo rispetto alle cellule GAPLINC kd THP -1 (SIAappendice, Fig. S6C). Poiché i livelli basali differiscono, l'induzione complessiva di IL6 si riduce quando viene rimosso GAPLINC. (Appendice S7, Fig. S6D).

Poiché GAPLINC kd ha portato alla sovraregolazione dei geni della risposta immunitaria, abbiamo generato una linea cellulare THP-1 che sovraesprimeva GAPLINC per determinare se media l'effetto opposto. Utilizzo di dati di sequenziamento a lettura lunga. abbiamo identificato le isoforme dominanti di GAPLINCespresse negli MDM (Fig. 2D). L'isoforma più abbondante, che corrisponde all'annotazione del gene Reference Sequence (RefSeq), è stata incorporata nel nostro costrutto (Fig. 2E). Abbiamo utilizzato un vettore lentivirale contenente un promotore bidirezionale per guidare la proteina fluorescente verde (GFP)/Zeocin e GAPLINC in parallelo (Fig. 2F). Abbiamo confermato utilizzando qPCR che GAPLINC era espresso stabilmente in THP-1 rispetto al controllo (Fig. 2G). La sovraespressione di GAPLINC ha ridotto IL6 a livello di RNA rispetto al controllo in seguito alla stimolazione con LPS, un componente dei batteri gram-negativi (Fig. 2H). Queste osservazioni suggeriscono che GAPLINC agisce come un regolatore negativo della risposta infiammatoria.

Successivamente, abbiamo esaminato i livelli di GAPLINC negli MDM primari in risposta all'infiammazione. Dopo la stimolazione con LPS, abbiamo scoperto che GAPLINC era rapidamente sottoregolato (Fig. 2I). Inoltre, utilizzando qPCR dimostriamo che GAPLINC è anche sottoregolato dopo l'attivazione con una varietà diTLRligandi (appendice SI, Fig. S7A). È stata confermata l'induzione dei geni infiammatori a controllo positivo TNF-a, IL6 e CCL5 (appendice SI, Fig. S7B). Questi dati suggeriscono che l'espressione di GAPLINC deve essere ridotta dopo la stimolazione affinché si verifichi un'induzione ottimale del gene infiammatorio. Per valutare il ruolo di NF-kB nel controllo dell'espressione di GAPLINC, gli MDM sono stati pretrattati con dimetilsolfossido (DMSO) o BAY11-7082, un inibitore di NF-B,

seguita da stimolazione con LPS per 6 ore. Negli MDM trattati con BAY11-7082- la down-regulation di GAPLINC era compromessa rispetto al controllo (Fig. 2/). il che suggerisce che la regolazione di GAPLINC dipende dalla segnalazione NF-KB. È stata confermata l'induzione dei geni infiammatori a controllo positivo TNF- e IL6 alla stimolazione LPS (SIAAppendice, Fig, S7C). Per capire come viene regolato GAPLINC, abbiamo utilizzato il test per la cromatina accessibile alla trasposasi utilizzando il sequenziamento (ATAC-seq) negli MDM per valutare l'accessibilità della cromatina del locus GAPLINC. Abbiamo scoperto che GAPLINC viene trascritto attivamente nei macrofagi a riposo ma si spegne strettamente dopo la stimolazione LPS (Fig. 2K), suggerendo che GAPLINC è regolato a livello di trascrizione.

Per esplorare la conservazione di GAPLINC tra umani e topi. abbiamo cercato di identificare loci sintenici, in cui i geni sono conservati in posizione tra gli stessi due geni codificanti proteine. seguita da una valutazione per la conservazione funzionale. Qui, mostriamo che Gaplinc è conservato in posizione, individuando una trascrizione tra i geni Dlgap1 e TgifI (Fig. 3A). Per confermare la specificità del tipo cellulare, abbiamo utilizzato il Mouse Cell Atlas (MCA)

(10) per valutare i livelli di trascrizione attraverso le cellule immunitarie nel midollo osseo (BM) e l'hanno trovato più espresso nei macrofagi, con livelli più bassi di espressione nei progenitori dei neutrofili (Fig. 3B). Successivamente, per determinare se i modelli di espressione sono stati conservati durante la differenziazione dei macrofagi sia nell'uomo che nei topi, abbiamo eseguito RNA-Seq confrontando le cellule BM con i macrofagi derivati ​​​​dal midollo osseo (BMDM), completato l'assemblaggio della trascrizione de novo e riscontrato che i livelli di Gaplinc del topo aumentavano dopo la differenziazione (SI Appendice, Fig. S8A). Lo abbiamo convalidato mediante qPCR, confrontando i livelli di Gaplinc nelle cellule BM con i BMDM (Fig. 3C). Paragonabile al GAPLINC umano. mouse Gaplinc è rapidamente regolato verso il basso nei BMDM stimolati da LPS (Fig. 3D). Come controllo, abbiamo confermato l'induzione dei geni infiammatori The-a e I6 (appendice SI. Fig. S8B). Mouse Gaplinc è anche rapidamente sottoregolato dopo l'attivazione con vari ligandi TLR. È stata anche confermata l'induzione dei geni di controllo positivo ll6 e Ccl5 (appendice SI, Fig. S8C).

Usando CRISPR, abbiamo generato un mouse Gaplinc knockout (KO) in cui sono stati rimossi l'esone I e la maggior parte del primo introne (Fig. 3E). I topi Chaplin KO si riproducevano normalmente e non mostravano evidenti difetti di sviluppo. L'eliminazione di Gapline è stata confermata dall'amplificazione PCR del DNA genomico nei topi wild-type (WT) e Gaplinc KO, con dimensioni dell'amplicone ~ 1.300 bp per WT e ~ 500 bp per topi Gaplinc KO (Fig. 3E), La strategia di genotipizzazione completa per confermare WT e Gaplinc KO è evidenziato nell'appendice SI, Fig. S9. Abbiamo anche confermato la carenza di Gaplinc nei BMDM usando qPCR (Fig. 3F). Per valutare se la carenza di Gaplinc ha influenzato la differenziazione, abbiamo colorato i BMDM WT e Gaplinc-KO per CD11B e F4/80; i modelli di colorazione erano simili, suggerendo una normale differenziazione dei macrofagi (appendice SI, Fig. S104). Per valutare se Gaplinc KO ha interrotto la funzione dei macrofagi, abbiamo confrontato l'attività di fagocitosi nei BMDM WT e Gaplinc-KO e non abbiamo riscontrato differenze (appendice SI, Fig.S10B).

Per valutare l'impatto globale della carenza di Gaplinc nei macrofagi, abbiamo eseguito RNA-Seq su BMDM WT e Gaplinc-KO; entrambi non sono stati trattati e LPS stimolati per 6 ore. Nei BMDM Gaplinc-KO, l'espressione di 23 geni (mostrati in rosso. Fig.3G) era significativamente sovraregolata al basale. Questi geni includono citochine e chemochine proinfiammatorie (Il6.l1-a. I1-8 e Cxd10), ISG (Ifitlbl1), membri della famiglia GBP (Gbp5 e Gbp0) e marcatori della superficie cellulare specifici per i macrofagi attivati ​​(Cd69). L'analisi GO ha confermato che i geni coinvolti nella risposta immunitaria sono sovrarappresentati nei BMDM Gaplinc-KO al basale (Fig. 3H). Questi geni sono tipicamente sovraregolati dopo la stimolazione LPS (appendice SI. Fig. S11). Simile ai dati ottenuti dai nostri studi sull'uomo, questi dati suggeriscono cheGAPLINCè funzionalmente conservato tra le specie per controllare basalmente l'espressione dei geni di risposta infiammatoria (IRG). Non c'era alcuna differenza importante nei geni che erano sovraregolati dopo la stimolazione LPS tra i BMDM WT e Gaplinc-KO (Dataset S1).

Numerosi studi hanno dimostrato la capacità degli IncRNA di regolare la trascrizione dei geni vicini(11). Pertanto, abbiamo esplorato potenziali ruoli di regolazione cis per Gaplinc poiché il suo gene vicino, Tgif1, è stato precedentemente implicato nella modulazione dell'attivazione dei macrofagi (12). Utilizzando i nostri dati RNA-Seq, abbiamo confermato che nei BMDM GaplincKO, l'espressione di Tgifl rispetto alle cellule T non è stata influenzata (SIAappendir.Fig.S124). Abbiamo ulteriormente confermato mediante qPCR che Tgifli era inalterato nei BMDM Gaplinc-KO (appendice SI, Fig. S12B). Successivamente, abbiamo esplorato la possibilità che l'interruzione del locus Gaplinc possa rimuovere un importante elemento normativo, come un potenziatore. Abbiamo utilizzato i dati ATAC-seq da BMDM WT per valutare le regioni trascrizionalmente attive nel locus Gaplinc(13). Non abbiamo identificato segnali all'interno della regione di eliminazione di Gaplinc, solo quelli corrispondenti al promotore di Gaplinc (appendice SI. Fig.S13). Collettivamente, questi dati suggeriscono che la sovraregolazione degli IRG sulla carenza di Gaplinc non è dovuta agli effetti sui geni vicini o alla rimozione di un elemento regolatorio.

Poiché Gaplinc KO nei BMDM regola l'espressione degli IRG in condizioni basali, abbiamo quindi voluto sfidare gli animali Gaplinc KO in vivo per osservare le differenze nella risposta dell'ospite. Abbiamo utilizzato un modello di "shock endotossico". in cui Escherichia coli LPS è stato iniettato per via intraperitoneale (ip) in topi WT e Gaplinc KO per misurare le differenze di sopravvivenza. Alla dose di 5 mg/kg/topo. I topi WT hanno mostrato una sopravvivenza percentuale del 0 dopo 2 giorni (Fig.30. Tuttavia, il 100% dei topi Gaplinc KO è sopravvissuto, ottenendo che i topi Gaplinc KO hanno resistenza allo shock endotossico indotto da LPS (Fig. 31). In particolare , si osservano differenze di temperatura significative tra WT e topi carenti di Gaplinc (Fig. 3).Anche quando si utilizza una dose molto più alta di LPS di 20 mg/kg, i topi carenti di Gqplinc mostrano un significativo vantaggio di sopravvivenza (Fig. 3K). , questi dati mostrano che Gaplinc svolge un ruolo importante nella regolazione della risposta immunitaria in vivo.

Dai nostri studi sull'uomo, sappiamo che GAPLINC può regolare i geni immunitari al basale. Sebbene non vi sia alcuna differenza nell'espressione delle citochine dopo l'attivazione infiammatoria, vi è una differenza nell'entità della risposta poiché i livelli di base differiscono. Pertanto, per comprendere meglio queste differenze di sopravvivenza in vivo, abbiamo valutato i cambiamenti nell'espressione delle citochine al basale. Abbiamo utilizzato un array di citochine multiplex per misurare simultaneamente i biomarcatori associati alla risposta immunitaria, alla sepsi e al cancro. Al basale, geni immunitari chiave tra cui MDC. MIP-1a.IL-13. IL-5. e M-CSF era significativamente elevato nel siero dei topi Gqplinc KO rispetto a WT (Fig.44). Queste citochine sono implicate nel reclutamento cellulare: tuttavia, utilizzando la citometria a flusso, abbiamo confermato che la percentuale di neutrofili, cellule T, cellule B, eosinofili, monociti e macrofagi era comparabile tra WT e Gaplinc KOmice al basale (appendice SI, Fig. S14) . È interessante notare che queste percentuali erano anche paragonabili alle sfide post-LPS nei punti temporali di 6 ore e 18 ore (appendice SI, figure S15 e S16). Inoltre, il siero di topi WT e Gaplinc KO testato per le caratteristiche cliniche della sepsi, inclusi lattato e proteina C-reattiva (CRP) (Appendice S7, Fig. S17), non ha mostrato differenze

Poiché livelli aumentati di MDC o IL-13(Fig.44) sono stati precedentemente caratterizzati per svolgere ruoli protettivi contro lo shock endotossico attraverso la modulazione delle citochine proinfiammatorie (14,15), abbiamo quindi esaminato le differenze nei livelli di citochine proinfiammatorie , inclusi l6, Il1- , l1- e Cxcl10, in seguito all'attivazione infiammatoria. Mentre i livelli di WT e Gaplinc KO sono gli stessi sia a livello di trascrizione (Fig. 4B) che di proteine ​​(appendice SI, Fig.S18A-C), l'entità del cambiamento è molto più bassa (Fig. 4C), suggerendo che questa piega ridotta il cambiamento può svolgere un ruolo nel prevenire la suscettibilità dei topi Gaplinc KO all'LPS. shock endotossico indotto.

Insieme alla produzione dilagante di citochine. un altro aspetto clinico dello shock endotossico che può portare alla mortalità è la formazione di coaguli di sangue nei vasi più piccoli, con conseguente insufficienza multiorgano (16.17). Per risolvere questo problema, abbiamo analizzato il siero dei topi trattati con LPS ip. per valutare le differenze nella coagulazione. Utilizzando un test del tempo di tromboplastina parziale attivato (a) che misura il tempo alla formazione di coaguli, scopriamo che i topi WT mostrano un tempo significativamente prolungato rispetto ai topi Gaplinc KO su sfida LPS (Fig. 4D). Tempi di aPTT prolungati suggeriscono che i topi WT sono già stati sottoposti a coagulazione e hanno esaurito i fattori chiave della coagulazione, in modo tale che al momento del test, dell'inizio della coagulazione e della misurazione, il tempo per la formazione del coagulo aumenta. I dati suggeriscono che le differenze nella sopravvivenza alla sfida LPS sono dovute a topi WT sottoposti a una maggiore coagulazione, che porta a un'eventuale insufficienza d'organo e morte.

Successivamente, abbiamo cercato di capire meccanicamente come Gaplinc stia mediando questo effetto. In primo luogo, abbiamo confermato la sua localizzazione e analizzato i livelli di Gaplinc sia nel compartimento citoplasmatico che in quello nucleare dei BMDM mediante qPCR. Simile al GAPLINC umano. il mouse Gaplinc era prevalentemente citoplasmatico (appendice ST, Fig.S19). Successivamente, abbiamo eseguito un'identificazione completa modificata delle proteine ​​​​leganti l'RNA (ChIRP), accoppiata con la spettrometria di massa e il sequenziamento di piccoli RNA, poiché è stato precedentemente dimostrato che GAPLINC interagisce con i micro RNA(18). Non abbiamo osservato interazioni con obiettivi precedentemente identificati (SIAappendice, Fig. S20).

Poiché non siamo riusciti a identificare un partner di legame diretto, ci siamo concentrati sulla funzione conservata tra uomo e topo, in particolare i geni conservati influenzati nei nostri studi GAPLINC kd e mouse Gaplinc KO sui topi, la maggior parte dei quali sono regolatori NF-kB (Fig. 4E ). La forma più abbondante di NF-KB attivata da LPS è l'eterodimero p65:p50 e sette dei nove geni conservati sono bersagli p65 diretti(19). Abbiamo utilizzato l'immunoprecipitazione dell'RNA nativo (RIP) e abbiamo dimostrato che non esiste un'interazione diretta tra Gaplinc e p65 (Appendice S7, Fig. S21). Nella classica via di segnalazione NF-kB, le subunità p6:p50 si trovano nel citosol e si legano a inibitoria I-kB- nelle cellule a riposo. Dopo l'attivazione, I-KB- viene degradato, consentendo a p65:p50 di traslocare nel nucleo e attivare i geni bersaglio (20). Nei BMDM WT e Gaplinc-KO, abbiamo misurato la degradazione di I-kB- utilizzando Western blot e non abbiamo riscontrato differenze (Fig.4F). Successivamente, abbiamo confrontato i livelli totali di p65 nei BMDM. Nei nostri dati RNA-Seg, i livelli di trascrizione di p65 (RelA) nelle condizioni basali e stimolate con LPS per BMDM WT e Gaplinc-KO sono comparabili (appendice SI, Fig. S22). Tuttavia, quando abbiamo confrontato i livelli totali di proteina p65 mediante Western blot, abbiamo riscontrato un aumento significativo dei livelli di p65 nelle cellule Gaplinc-KO rispetto a WT (Fig. 4G). Ciò suggerisce che Gaplinc regola i livelli totali di p65 a livello traslazionale. Inoltre, abbiamo valutato i livelli di p65 nei compartimenti citoplasmatico e nucleare e abbiamo scoperto che la p65 nucleare è più abbondante nelle cellule carenti di Gaplinc rispetto a WT (Fig. 4H). Combinati, questi dati suggeriscono un ruolo meccanicistico per GAPLINC nell'adescamento dell'attivazione di IRG critici.

Discussione

Qui, abbiamo identificato GAPLINC come un IncRNA espresso citosolicamente conservato negli esseri umani e nei topi che funziona per controllare l'espressione genica infiammatoria attraverso la regolazione di NF-xB. Rispetto agli IncRNA citosolici riportati che influiscono sull'efficienza traslazionale modulando l'espressione proteica o l'assemblaggio di ribosomi (21-23), troviamo che Gapline contribuisce citosolicamente all'abilità traslazionale di p65; tuttavia, il meccanismo di interazione, diretta o indiretta, resta da determinare. I nostri risultati forniscono informazioni su come un IncRNA funzionalmente conservato regola la risposta immunitaria e forniscono vie di indagine per lo sviluppo di terapie per lo shock endotossico.