Un approccio proteomico basato sulla scoperta identifica la proteina disolfuro isomerasi (PDIA1) come biomarcatore dello stress cellulare nel diabete di tipo 1

Sommario

Contesto Le risposte allo stress all'interno della cellula sono state collegate sia all'aumento della morte cellulare sia all'accelerazione dell'attivazione immunitaria nel diabete di tipo 1 (T1D). Al momento, mancano informazioni sulla tempistica e sulla portata di queste risposte, nonché sui cambiamenti correlati alla malattia nell'espressione delle proteine ​​​​delle cellule insulari durante lo sviluppo del T1D.

Metodi La spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati è stata eseguita su isole raccolte longitudinalmente da topi NOD e topi NOD-SCID resi diabetici attraverso il trasferimento adottivo di cellule T.

Risultati Nelle isole raccolte da topi NOD femmina a 10, 12 e 14 settimane di età, abbiamo trovato una sovraregolazione limitata nel tempo delle proteine ​​coinvolte nella mitigazione dello stress e nel mantenimento della funzione cellulare, seguita dalla perdita di espressione delle proteine ​​protettive che preannunciavano l'insorgenza del diabete . La segnalazione EIF2 e la risposta proteica spiegata, la segnalazione mTOR, la funzione mitocondriale e la fosforilazione ossidativa erano percorsi comunemente modulati sia nei topi NOD che nei topi NOD-SCID resi acutamente diabetici dal trasferimento adottivo delle cellule T. La proteina disolfuro isomerasi A1 (PDIA1) è stata sovraregolata nelle isole NOD e nelle sezioni pancreatiche di donatori di organi umani con positività agli autoanticorpi o T1D. Inoltre, i livelli plasmatici di PDIA1 erano aumentati nei topi NOD pre-diabetici e nel siero di bambini con T1D di recente insorgenza rispetto ai controlli non diabetici. Interpretazione Abbiamo identificato un nucleo di percorsi modulati attraverso distinti modelli murini di T1D e identificato PDIA1 come un potenziale biomarcatore umano dello stress cellulare nel T1D. Finanziamento NIH (R01DK093954, DK127308, U01DK127786, UC4DK104166, R01DK060581, R01GM118470 e 5T32DK101001-09). Premio al merito VA I01BX001733. JDRF (2-SRA-2019-834-SB, 2-SRA-2018-493-AB, 3-PDF-20016-

199-AN, 5-CDA-2022-1176-AN e 3-PDF-2017-385-AN).

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Parole chiave: stress cellulare; diabete di tipo 1; Proteina disolfuro isomerasi A1; proteomica; Biomarcatori

Ricerca nel contesto

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Prove prima di questo studio

Il diabete di tipo 1 (T1D) si sviluppa in un lasso di tempo di molti anni e come risultato di un'interazione complessa e bidirezionale tra la cellula pancreatica e il sistema immunitario. I risultati di modelli ex vivo di T1D e sezioni pancreatiche di donatori di organi umani con diabete hanno collegato i cambiamenti nella massa cellulare e nella funzione con l'attivazione di una varietà di percorsi di stress, molti dei quali si pensa accelerino la morte cellulare e aumentino l'immunogenicità cellulare. Tuttavia, la maggior parte degli studi esistenti ha esaminato i tessuti in un unico punto temporale, risultando in una visione limitata della patogenesi della malattia che manca di risoluzione sui tempi e sulla portata delle risposte cellulari durante l'evoluzione della malattia. Inoltre, pochi risultati sono stati tradotti tra topi e tessuti umani e in potenziali saggi di biomarcatori.

Valore aggiunto di questo studio

Per caratterizzare i cambiamenti nel proteoma delle isole durante lo sviluppo del T1D, le isole dei topi NOD e dei topi NOD-SCID rese diabetiche acute attraverso il trasferimento adottivo delle cellule T sono state isolate e analizzate utilizzando la spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati (DIA-MS). Nelle isole raccolte longitudinalmente dal modello murino NOD progressivo cronico, si è verificata una sovraregolazione limitata nel tempo delle proteine ​​coinvolte nel mantenimento della funzione cellulare e nella mitigazione dello stress, seguita dalla perdita di espressione di diverse proteine ​​​​protettive che precedono lo sviluppo del diabete. All'insorgenza del diabete, l'analisi proteomica ha identificato un insieme comune di percorsi modulati nelle isole NOD e NOD-SCID. I percorsi implicati nei due modelli includevano la segnalazione EIF2 e la risposta proteica spiegata, la segnalazione mTOR, la disfunzione mitocondriale e la fosforilazione ossidativa. Per tradurre le nostre scoperte nell'uomo, ci siamo concentrati sulla proteina disolfuro isomerasi A1 (PDIA1), che è una tiolo ossidoreduttasi localizzata e secreta da ER altamente abbondante che svolge un ruolo nella secrezione di insulina, nell'elaborazione della proinsulina e nella protezione contro lo stress cellulare da ER. Negli esperimenti di immunofluorescenza, abbiamo verificato un pattern bifasico di espressione di PDIA1 durante la progressione del T1D nelle isole NOD e abbiamo riscontrato un aumento dell'espressione di PDIA1 nelle isole umane trattate ex vivo con citochine e nelle isole dal tessuto pancreatico raccolto da donatori di organi umani con positività agli autoanticorpi e con T1D. Inoltre, i livelli plasmatici di PDIA1 erano elevati nei topi NOD pre-diabetici e nel siero di bambini con T1D di recente insorgenza rispetto ai controlli non diabetici abbinati per età e sesso.

Implicazioni di tutte le prove disponibili

Il nostro studio evidenzia il valore dell'applicazione di approcci proteomici imparziali nei modelli preclinici per identificare i percorsi cellulari chiave coinvolti nell'evoluzione temporale del T1D. Utilizzando questa strategia, abbiamo identificato un insieme comune di percorsi modulati in diversi modelli murini distinti di T1D e identificato PDIA1 come un potenziale biomarcatore associato a T1D nell'uomo.

introduzione

Il diabete di tipo 1 (T1D) deriva dalla distruzione immuno-mediata delle cellule produttrici di insulina e si manifesta clinicamente dopo che si è verificata una soglia di riduzione della massa cellulare e della funzione. I dati provenienti da coorti cliniche di individui positivi agli autoanticorpi suggeriscono che ci sono diversi punti di controllo metabolici prevedibili durante la progressione del T1D. Nella fase iniziale della malattia e in seguito allo sviluppo di autoanticorpi, vi è una perdita misurabile delle risposte precoci del peptide C e una diminuzione della secrezione di peptide C durante il test orale di tolleranza al glucosio (OGTT) che può essere rilevato fino a sei anni prima della diagnosi clinica.1, 2 Questa è seguita da una seconda fase di misurazioni relativamente stabili del peptide C OGTT.1,2 Il deterioramento metabolico accelera da un anno a sei mesi prima della diagnosi clinica di T1D ed è caratterizzato da un marcato declino sensibilità al glucosio unita a ridotta sensibilità all'insulina e aumento dei livelli di glucosio nel sangue.1-3 Parallelamente, gli studi istologici eseguiti su sezioni pancreatiche di donatori di organi con positività agli autoanticorpi e con T1D dimostrano riduzioni variabili della massa cellulare prima e all'insorgenza del diabete.4-6 Risultati da modelli di malattia ex vivo e sezioni pancreatiche di donatori di organi umani con diabete hanno collegato i cambiamenti nella massa cellulare e nella funzione con l'attivazione di una varietà di cellule percorsi di stress intrinseci, come il reticolo endoplasmatico (ER) e la disfunzione mitocondriale, la sovraespressione di HLA di classe I e i cambiamenti nei modelli di splicing alternativi, che sono stati tutti implicati nella morte cellulare e nell'aumento dell'immunogenicità cellulare.7-14

Al momento, uno dei principali fattori limitanti nel trattamento o nella prevenzione del T1D è la mancanza di conoscenza riguardo ai tempi e alla natura della disfunzione cellulare prima dell'insorgenza della malattia clinica. lo stato di malattia durante il periodo peri-diagnostico rappresenta probabilmente una finestra chiave per un intervento terapeutico efficace.15 L'imaging longitudinale del compartimento cellulare e il campionamento del pancreas in individui viventi non sono clinicamente fattibili. Gli studi eseguiti utilizzando isole isolate o sezioni pancreatiche di donatori di organi con diabete forniscono informazioni critiche sulla patogenesi della malattia; tuttavia, consentono solo una visione istantanea della patogenesi della malattia. Una migliore risoluzione temporale dei programmi molecolari modulati all'interno della cellula durante lo sviluppo del T1D potrebbe informare le strategie terapeutiche e dei biomarcatori negli esseri umani.

Il topo diabetico non obeso (NOD) è stato ampiamente utilizzato per studiare la patogenesi del T1D per oltre tre decenni.19-21 Le isole di topi femmina NOD mostrano evidenza di infiltrazione di cellule immunitarie già a quattro settimane di età,22 e la maggioranza dei topi femmina NOD sviluppano il diabete. Al contrario, la maggior parte dei topi NOD maschi rimane libera dal diabete.19,23 Coerentemente con i modelli osservati negli esseri umani, la funzione cellulare e il declino della massa nei topi NOD femmina durante la fase pre-diabetica. Nelle analisi trasversali, sono stati identificati sottoinsiemi di percorsi di stress sovrapposti nelle cellule di topi NOD e nelle isole umane di donatori di organi con diabete.20,24,25 Pertanto, l'analisi longitudinale delle isole pancreatiche di topi NOD femmina durante la progressione al T1D può consentire l'identificazione di percorsi di stress che vengono attivati ​​prima della distruzione cellulare, consentendo così l'identificazione di biomarcatori clinici e lo sviluppo di potenziali terapie.

Per ottenere informazioni sul decorso temporale dei cambiamenti molecolari nella cellula durante la progressione del T1D, abbiamo utilizzato un approccio basato sulla spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati (DIA-MS) per monitorare i cambiamenti longitudinali nel proteoma delle isole durante la progressione precoce e tardiva della malattia in topi NOD. Per illustrare l'utilità di questo approccio nel dare priorità alle proteine ​​cellulari come biomarcatori T1D, ci siamo concentrati sulla proteina disolfuro isomerasi A1 (PDIA1) come esempio di una proteina secreta che è stata espressa in modo differenziato nelle isole NOD durante la progressione del diabete. Abbiamo dimostrato una maggiore espressione delle isole di PDIA1 nelle isole del topo NOD durante l'evoluzione del T1D e nelle sezioni pancreatiche di donatori di organi umani con positività agli autoanticorpi o con T1D. Inoltre, abbiamo sviluppato un test di elettrochemiluminescenza ad alta sensibilità per misurare i livelli circolanti di PDIA1. Utilizzando questo test, abbiamo dimostrato un aumento dei livelli plasmatici di PDIA1 nei topi NOD pre-diabetici e nel siero di bambini con T1D di recente insorgenza rispetto ai controlli pediatrici abbinati per età e sesso.

Metodi

Animali e procedure sperimentali

Female NOD/ShiLTJ (NOD), NOD-BDC2.5, and NOD-SCID mice were purchased from Jackson Laboratory. Female outbred CD1 mice  were  purchased  from  Charles River Laboratories. Only female NOD  mice  were utilized for this study, as spontaneous T1D development occurs almost exclusively in female mice (∼80–85% diabetes incidence in our vivarium), making it very difficult to study diabetes pathogenesis in male NOD mice (∼10% diabetes incidence).26,27 Mouse studies were conducted in accordance with the ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)guidelines.28 Mice were allowed to acclimate for at least two weeks upon arrival prior to the initiation of experi- ments. Blood glucose was monitored weekly in all the mouse models and diabetes was defined as a blood glucose >250 mg/dL per due misurazioni consecutive. La glicemia e il peso corporeo sono stati registrati il ​​giorno dell'isolamento delle isole per ciascun gruppo di età dei topi utilizzati per l'analisi a valle (Figura supplementare S1). Le isole pancreatiche sono state isolate o il pancreas è stato prelevato nei punti temporali indicati utilizzando i metodi descritti in precedenza.29,30

Le isole di topo sono state raccolte a mano, lavate due volte con PBS e conservate come pellet a -80 °C fino all'uso. Il sangue per l'analisi del plasma è stato ottenuto al momento dell'eutanasia tramite puntura cardiaca, trasferito in una provetta Becton Dickinson Vacutainer K2EDTA (Cat# 365974) e centrifugato a 5000 rpm per 10 min a 4 ◦C. I campioni di plasma separati sono stati aliquotati in criotubi da 1,5 mL e conservati a -80 °C fino all'uso.

Sospensioni di splenociti a cellula singola sono state preparate per esperimenti di trasferimento adottivo da 12- topi NOD-BDC2.5 maschi di una settimana, come descritto in precedenza.31 Le cellule CD4 plus T sono state purificate mediante selezione negativa (Cat# 558131, BD Biosciences) , attivato in 6-pozzetti (5 × 106 cellule/pozzetto), rivestito con anticorpo anti-CD3 e anti-CD28 (1 mg/mL ciascuno) ed espanso per 72 ore in flaconi T-75 (5 × 106 cellule/fiasco) in terreno RPMI 1640 completo

(1% di penicillina/streptomicina e 10% di FBS) contenente 100 U/ml di IL-2. Le cellule sono state successivamente raccolte, lavate due volte con la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e diluite a 5 × 106 cellule/mL in HBSS. cellule tramite iniezione intraperitoneale e la glicemia è stata misurata giornalmente per 21 giorni. I topi NOD-SCID di pari età che hanno ricevuto solo HBSS sono stati usati come controlli. L'insorgenza del diabete è stata definita come due letture consecutive della glicemia di

Maggiore o uguale a 250 mg/dL.

Colorazione e quantificazione dell'immunofluorescenza L'immunofluorescenza (IF) è stata eseguita per studiare i risultati chiave dell'analisi MS. In breve, tessuti pancreatici fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) da una coorte indipendente di topi NOD pre-diabetici di pari età, ottenuti a 7, 9, 11, 13 settimane di età e topi che hanno sviluppato il diabete, sono stati sezionati a uno spessore di 5 μm e deparaffinato. Le sezioni sono state idratate due volte con xilene fresco per 5 minuti e una serie di concentrazioni decrescenti di etanolo (100-70%). Il recupero dell'antigene è stato eseguito utilizzando tampone citrato e colorato utilizzando anticorpi contro PDIA1 (Cell Signaling, Cat# 3501S, RRID:AB_2156433), PRDX3 (Abcam, Cat#

ab73349, RRID:AB_1860862), 14-3-3 /YWHAB

(Sigma, Cat# HPA011212, RRID:AB_1844334), insulina (Dako, Cat# IR002, RRID:AB_2800361), glucagone (Abcam, Cat# ab10988, RRID:AB{{5} }), TAGLIO

(ThermoFisher Scientific, Cat# MA1-250, RRID:AB_ 2292611) e BIP (Cell Signaling Technology, Cat# 3177S, RRID:AB_2119845). Allo stesso modo, sezioni di tessuto pancreatico umano da donatori di organi da cadavere non diabetici, donatori di organi con positività agli autoanticorpi ma senza diabete e donatori di organi con T1D (Tabella supplementare S5) sono stati ricevuti dal Biorepository della Rete dei donatori di organi pancreatici (nPOD) e colorati per PDIA1, insulina e glucagone utilizzando gli anticorpi primari sopra menzionati. Gli anticorpi secondari includevano anticorpi anti-cavia di capra 488-etichettati con Alexa, anti-coniglio con asino 568-etichettati con Alexa e anti-topo con asino etichettati con Alexa 647-. I nuclei sono stati colorati con DAPI. Le immagini sono state acquisite utilizzando un microscopio confocale LSM800 (Zeiss, Germania) e quantificate utilizzando il software Image-J (NIH) come descritto in precedenza.30 Da ciascun topo (4-7 topi/gruppo), sono state selezionate casualmente 3-7 isole per l'imaging, e per le sezioni pancreatiche umane, 5-10 isole di ciascun donatore sono state selezionate casualmente per l'imaging. L'intensità di fluorescenza totale normalizzata delle cellule insulari è stata calcolata indipendentemente da due individui che lavoravano in cieco.

Raccolta di campioni di siero umano

Il siero a digiuno è stato ottenuto da bambini con T1D di recente insorgenza e controlli sani non diabetici abbinati per età e sesso (Tabella Supplementare S1). Il consenso informato scritto o il consenso dei genitori e il consenso del bambino sono stati ottenuti da tutti i partecipanti.33 Ai bambini con T1D era stata diagnosticata una nuova malattia entro 48 ore dal prelievo del sangue e sono stati ricoverati presso il Riley Hospital for Children. I soggetti pediatrici di controllo provenivano da una clinica ambulatoriale, non assumevano farmaci con prescrizione cronica ed erano liberi da qualsiasi malattia cronica o acuta nelle due settimane precedenti il ​​campionamento.

Misurazione della PDIA sierica e plasmatica1

Sono stati analizzati trenta μL di campioni di plasma di topo diluiti due volte o trenta μL di campioni di siero umano diluiti quattro volte. Per generare una curva standard è stata utilizzata una proteina rPDIA1 diluita in serie quattro volte con una concentrazione iniziale di 2500 ng/mL. Poiché la proteina PDIA1 umana e di topo condividono un'omologia di sequenza del 93,725%, la proteina rPDIA1 umana è stata utilizzata come standard per misurare campioni umani e di topo. Per quantificare i livelli circolanti di PDIA1 nei campioni di siero umano e plasma di topo, le piastre MSD standard a un punto sono state incubate con 5 ug/mL di anticorpo di cattura (Sigma, Cat# HPA018884, RRID:AB_1854896) durante la notte a 4 ◦C , e sono state seguite le stesse procedure descritte sopra in "Sviluppo del saggio". Dopo l'incubazione del campione, le piastre sono state lavate come descritto sopra e incubate con anticorpo di rilevamento PDIA1 di topo (Thermo Fisher Scientific, Cat# MA3-019, RRID:AB_ 2163120) per 1 ora in un agitatore orbitale a temperatura ambiente. Le piastre sono state quindi lavate e incubate con un Sulfo-Tag di topo MSD per 1 ora a temperatura ambiente in un agitatore. Infine, le piastre sono state lette utilizzando 150 μL di buffer di lettura in un lettore di piastre Quick Plex SQ 120 (MSD) e i dati sono stati analizzati come descritto sopra.

I dettagli sull'elaborazione e l'analisi dei campioni di spettrometria di massa, la coltura di isole umane e l'immunoblot e lo sviluppo del test per misurare la PDIA1 plasmatica e sierica sono forniti nei Materiali e metodi supplementari e nella Tabella supplementare S3.

Etica

I topi sono stati mantenuti presso l'Indiana University School of Medicine Laboratory Animal Resource Center in base a protocolli approvati dall'Indiana University Institutional Animal Care and Use Committee (numero di protocollo: 20104 MD/R/HZ/E/AR). Il siero a digiuno è stato ottenuto da bambini con T1D di recente insorgenza e controlli sani non diabetici di pari età e sesso secondo protocolli approvati dall'Indiana University Institutional Review Board (numero di protocollo: 1411938757). Il consenso informato scritto o il consenso dei genitori e il consenso del bambino sono stati ottenuti da tutti i partecipanti.33

Statistiche

Per la determinazione della dimensione del campione, abbiamo utilizzato https://clincalc. com/stats/samplesize.aspx. All'inizio dello studio, abbiamo raccolto campioni di isole da un totale di 79 topi per l'analisi DIA-MS. Utilizzando i rigorosi criteri di controllo della qualità descritti nei metodi supplementari, un totale di 18 campioni è stato escluso dopo l'analisi della spettrometria di massa. Nonostante queste esclusioni, la dimensione del campione per ciascun gruppo era pari o superiore a 3 topi/gruppo, che forniva l'80 percento di potenza per rilevare le differenze tra i gruppi assumendo un errore di tipo I di 0.05, sulla base dell'incidenza stabilita della malattia dell'80-85% nella nostra colonia NOD. I cambiamenti dell'abbondanza proteica nella proteomica delle isole in diversi gruppi di campioni sono stati analizzati utilizzando l'analisi dei componenti principali (PCA). Le differenze nell'abbondanza di proteine ​​tra due gruppi sono state determinate utilizzando i test t di Student; le differenze tra due o più gruppi sono state testate utilizzando ANOVA unidirezionale. AP 0,05 è stato considerato significativo. Le proteine ​​espresse in modo differenziale sono state visualizzate utilizzando mappe di calore (https://software.broadinstitute.org/morpheus/) con analisi di raggruppamento gerarchico non supervisionato. I percorsi mediani normalizzati verso l'alto e verso il basso regolati sono stati filtrati utilizzando una modifica di 1,5 volte sui dati trasformati log2 e l'arricchimento funzionale dei set proteici con espressione differenziale è stato eseguito utilizzando Ingenuity Pathway Analysis. Il test esatto di Fisher è stato utilizzato per esaminare il significato dell'arricchimento utilizzando P< 0.05. For analysis of PDIA1 in human cohorts, we used the mean ± S.D. of PDIA1 fluorescent intensities (n = 4 mice/group) to calculate sample size requirements. Based on these calculations, a sample size of 10 per group provided 80% power with a type I error α of 0.05. Data other than mass spec- trometry were analysed using GraphPad Prism version

9. I dati sono presentati come media ± SEM o media ± DS

Ruolo dei finanziatori

Le fonti di finanziamento per questo progetto non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta dei dati, nell'analisi, nell'interpretazione, nella scrittura o nella modifica del manoscritto.

Risultati

Analisi dei cambiamenti temporali nel proteoma NOD durante la progressione della malattia

Per caratterizzare i cambiamenti temporali nell'espressione delle proteine ​​delle isole durante la progressione del diabete, le isole pancreatiche sono state isolate da topi CD1 e NOD della stessa età a 10, 12 e 14 settimane di età e al momento dell'insorgenza del diabete (media ± DS l'età dello sviluppo del diabete era di 17 ± 3,3 settimane) e analizzati utilizzando la proteomica DIA (Fig. 1). La figura supplementare S1 mostra i dati sulla glicemia e sul peso corporeo per i topi il giorno dell'isolamento dell'isolotto. Una media di 1160 proteine ​​e 897 proteine ​​sovrapposte sono state quantificate negli isolotti di topo NOD e CD1 (Figura supplementare S3). Poiché i topi CD1 non sono soggetti a diabete e presentano livelli di glucosio nel sangue strettamente regolati, abbiamo utilizzato topi CD1 abbinati per sesso ed età per normalizzare l'abbondanza proteica nelle isole NOD. Per identificare le proteine ​​espresse in modo differenziato in ciascun punto temporale, i risultati sono stati analizzati utilizzando la normalizzazione mediana, un criterio di filtraggio di una variazione di 1.5-volte nell'abbondanza proteica e P 0,05. Come mostrato nella Figura supplementare S4 (a e b), le repliche biologiche in ciascun gruppo sperimentale sono raggruppate insieme, indicando la riproducibilità del nostro approccio proteomico. I pannelli c-e nella figura supplementare S4 illustrano modelli di proteine ​​​​differenzialmente espresse e raggruppamento gerarchico tra i gruppi sperimentali. L'elenco completo delle proteine ​​differenzialmente espresse tra i gruppi sperimentali è incluso nella Tabella supplementare S3. Abbiamo identificato 411 proteine ​​up-regolate e 502 down-regolate in isole di topi NOD di 10 settimane; 364/524 alla settimana 12 e 530/220 alla settimana 14. Un totale di 344 proteine ​​up-regolate e 584 down-regolate sono state identificate nelle isole dei topi NOD al momento dello sviluppo del diabete. Risultati simili (434/275) sono stati osservati nelle isole di topi NOD-SCID-BDC2.5 resi diabetici in fase acuta. Infine, nelle isole dei topi NOD resistenti al diabete sono state identificate un totale di 428 proteine ​​up- e 474 down-regolate.

Nell'analisi dei componenti principali (PCA), i topi NOD in diverse età pre-diabetiche (10, 12 e 14 settimane) si raggruppavano principalmente come un gruppo, mentre i topi diabetici erano distintamente raggruppati (Fig. 2a). Le prime 30 proteine ​​espresse in modo differenziale (DE) da singoli topi sono mostrate in Fig. 2b. L'analisi di clustering gerarchico senza supervisione di queste proteine ​​​​DE ha rivelato una perdita dipendente dal tempo di espressione di insulina e polipeptide amiloide isolotto (IAPP) (Fig. 2c). Inoltre, abbiamo osservato una sovraregolazione limitata nel tempo di diverse proteine ​​implicate nella mediazione dello stress e nel mantenimento della normale funzione cellulare durante la fase prediabetica (Fig. 2c). Le proteine ​​​​che esibiscono questo modello di espressione includevano la proteina 2/3 correlata all'actina 2 (ARPC2), che regola il trasporto mediato dal citoscheletro di actina delle vescicole secretorie, 34-36 collagene 1A1 (COL1A1) e collagene 1A2 (COL1A2), che sono extracellulari proteine ​​della matrice,37,38 e le metallotioneine MT1 e MT2, che sopprimono le risposte immunitarie.39,40 Un modello simile è stato osservato per la perossiredossina 3 (PRDX3), una proteina che regola la funzione mitocondriale, e 14-3- 3 , che svolge un ruolo ruolo nei processi metabolici, inclusa la segnalazione mTOR, il metabolismo degli aminoacidi e la funzione mitocondriale.41,42 La proteina disolfuro isomerasi A1 (PDIA1) è stata sovraregolata in modo simile durante le settimane 12-14. In particolare, PDIA1 è una tiolo reduttasi che svolge un ruolo fondamentale nel ripiegamento della proinsulina e nella regolazione della funzione ER.43 Complessivamente, questo modello di sovraregolazione è stato osservato durante il timepoint 14-settimana seguito dal declino dell'espressione di diverse proteine ​​con potenti - ruoli fondamentalmente protettivi che hanno preannunciato lo sviluppo del diabete (Fig. 2c).

La Fig. 3a mostra i primi 10 percorsi sovraregolati, mentre la Fig. 3b mostra i primi 10 percorsi sottoregolati nell'analisi longitudinale delle isole dei topi NOD utilizzando Ingenuity Pathway Analysis. Durante la progressione del diabete, i percorsi correlati a Cdc42, segnalazione di integrina, actina, aderenti epiteliali e segnalazione di mTOR erano sovraregolati (Fig. 3a). La segnalazione EIF2, che è coinvolta nell'avvio globale della traduzione dell'mRNA ed è un bersaglio durante la risposta proteica spiegata e lo stress ER, 44,45 è stata marcatamente sovraregolata alle settimane 12 e 14 e nei topi diabetici (Fig. 3a). I cambiamenti nella funzione mitocondriale erano rappresentati sia nei percorsi regolati verso l'alto che verso il basso, mentre i percorsi significativamente sottoregolati comprendevano diversi percorsi metabolici, tra cui il ciclo TCA, la fosforilazione ossidativa, l'ossidazione degli acidi grassi e le reazioni redox del glutatione. Anche la segnalazione di Sirtuin e la maturazione del fagosoma erano sottoregolate (Fig. 3b e Figure supplementari S5 e S6).

Confronto di modelli spontanei e indotti di T1D

Per identificare i punti in comune e le differenze nel proteoma delle isole tra il modello NOD spontaneo cronico e un modello aggressivo e acuto di distruzione cellulare immuno-mediata, abbiamo confrontato i risultati della proteomica delle isole isolate dai topi NOD diabetici e delle isole isolate al momento dello sviluppo del diabete da Topi NOD-SCID che avevano subito il trasferimento adottivo di cellule T CD4 plus da topi NOD.BDC2.5. I topi in quest'ultimo gruppo sviluppano un'iperglicemia significativa circa 7 giorni dopo il trasferimento adottivo (Figura supplementare S1). Nonostante un decorso temporale dello sviluppo del diabete significativamente diverso rispetto al modello NOD cronico, circa il 65% delle proteine ​​identificate era comune a entrambi i modelli (Fig. 4a). Inoltre, un confronto tra percorsi canonici funzionali ha suggerito che percorsi simili sono stati attivati ​​in entrambi i modelli. I principali percorsi sovrapposti includevano la modulazione della segnalazione EIF2 e la risposta proteica spiegata, la disfunzione mitocondriale, la fosforilazione ossidativa e la segnalazione mTOR (Fig. 4b). Questi risultati suggeriscono che, indipendentemente dal tipo di infiammazione (acuta o cronica), vengono attivati ​​modelli simili di stress cellulare, sottolineando l'importanza di questo insieme fondamentale di percorsi nella patogenesi del T1D.

Confronto del proteoma di topi NOD che hanno sviluppato il diabete e che sono rimasti senza diabete

Abbiamo ragionato che il confronto tra topi NOD diabetici e topi NOD che sono rimasti liberi dal diabete attraverso un follow-up prolungato potrebbe evidenziare percorsi protettivi all'interno della cellula durante l'attivazione immunitaria. L'analisi proteomica è stata eseguita su isole di età compresa tra 46 e 48 settimane

Topi NOD che sono rimasti liberi dal diabete e i risultati sono stati confrontati con gli isolotti raccolti dai topi NOD al momento dello sviluppo del diabete. Per tenere conto delle differenze che possono essere guidate dall'età, i dati di ciascun gruppo NOD sono stati normalizzati rispetto ai rispettivi controlli di pari età CD1. Rispetto ai topi NOD che hanno sviluppato il diabete, i topi NOD che sono rimasti liberi dal diabete avevano un numero notevolmente inferiore di proteine ​​che erano espresse in modo diverso rispetto ai loro controlli CD1 di pari età (Figura supplementare S4a). L'analisi dei componenti principali ha indicato una netta separazione tra il gruppo resistente al diabete e i topi NOD diabetici (Fig. 5a); dati da singoli replicati biologici mostrati in Fig. 5b. Successivamente, l'analisi di clustering gerarchico senza supervisione è stata eseguita utilizzando il metodo della distanza euclidea e del collegamento medio (Fig. 5c). I dati di questa analisi hanno rivelato la sovraregolazione di diverse proteine ​​uniche precedentemente collegate alla mitigazione dello stress cellulare. Tra le principali proteine ​​sovraregolate nei topi resistenti al diabete e sottoregolate nei topi diabetici c'erano l'IAPP e l'antiossidante-1 (ATOX1), un chaperone di rame che si è dimostrato protettivo contro il perossido di idrogeno e lo stress ossidativo mediato dal superossido.46 Altri pro chiave - le proteine ​​che mostrano questo modello di espressione erano la subunità beta 10 del proteasoma (PSB10), che è coinvolta nel mantenimento dell'omeostasi proteica,47 la proteina coattosina simile (COTL1), una proteina legante l'actina F che svolge un ruolo nella crescita cellulare ,48 e S100A4, che funziona come sensore di calcio citosolico intracellulare.49,50

In Fig. 5d, l'analisi dell'arricchimento del percorso mostra i primi dieci percorsi significativamente sovraregolati nei topi NOD resistenti al diabete rispetto ai topi NOD che hanno sviluppato il diabete. Nei topi NOD resistenti al diabete, c'era una notevole modulazione dei percorsi coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi cellulare, nella riparazione dei tessuti, nella clearance dei tessuti (cioè la fagocitosi nei macrofagi e nei monociti) e nella segnalazione del recettore degli idrocarburi arilici, che è collegata alla mitigazione dell'insulite nei topi NOD .51 Coerentemente con ciò, abbiamo osservato la down-regolazione dei percorsi correlati alla disfunzione mitocondriale, alla maturazione del fagosoma, alla fosforilazione ossidativa e alla risposta proteica spiegata nelle isole di topi NOD resistenti al diabete (Fig. 5e). È interessante notare che la segnalazione del citoscheletro di actina e la segnalazione della giunzione epiteliale aderente sono state identificate tra le vie up- e down-regolate, con proteine ​​distinte implicate all'interno delle categorie up- e down-regolate.

Analisi dei bersagli proteici identificati mediante immunofluorescenza e immunoblot

Per verificare i risultati chiave dell'analisi proteomica, è stata eseguita la colorazione con immunofluorescenza delle sezioni di tessuto pancreatico utilizzando una coorte separata di topi NOD di età compresa tra 9 e 13 settimane e all'inizio del diabete. Tre bersagli proteici, PDIA1, 14-3-3 e PRDX3, sono stati selezionati per esperimenti di convalida basati sui migliori risultati dell'analisi mostrata in Fig. 2b e sui loro ruoli noti nel mantenimento della funzione cellulare.42,43,52,53 Simile a i dati di proteomica, l'intensità della colorazione dell'isoletta PDIA1 (Fig. 6a) e 14-3-3 (Fig. 6b) è aumentata da 9 a 13 settimane nei topi NOD, seguita da una significativa perdita di espressione della proteina bersaglio all'insorgenza di T1D. I cambiamenti nell'intensità della colorazione di PRDX3 non sono cambiati in modo significativo durante i punti temporali prediabetici; tuttavia, l'espressione di PRDX3 era significativamente ridotta all'insorgenza di T1D nei topi NOD (Fig. 6c).

Per testare la pertinenza dei nostri risultati nel T1D umano, sono state ottenute sezioni di tessuto pancreatico da donatori di organi non diabetici, donatori di organi con positività agli autoanticorpi (AAb plus ) e donatori di organi con T1D accertato. L'analisi di immunofluorescenza di PDIA1, insulina e glucagone è stata eseguita e ha rivelato un aumento significativo dell'espressione di PDIA1 nelle isole pancreatiche di individui con AAb plus e con T1D rispetto ai donatori di controllo non diabetici (Fig. 7a e b).

PDIA1 è una proteina residente ER con un ruolo stabilito nella maturazione della proinsulina.43 Pertanto, per capire se ci fosse un'associazione tra stress ER e PDIA1 in condizioni di stress cellulare, abbiamo adottato un approccio in vitro trattando isole umane con o senza citochine pro-infiammatorie (IL-  1 più IFN) o glicemia alta (22,5 mM) per 1 h e 24 h. In entrambe le condizioni di stress cronico (cioè trattamento di 24 ore), abbiamo osservato una sovraregolazione parallela di PDIA1 e IRE1 (Fig. 7c e d). L'espressione di BIP era aumentata ma non in misura significativa. In linea con questi dati, l'analisi dell'immunofluorescenza delle sezioni di tessuto pancreatico NOD ha mostrato una significativa sovraregolazione di CHOP alla settimana 11 (Figura supplementare S7a eb). Tuttavia, non vi era alcuna differenza nell'espressione BIP tra i diversi gruppi di età dei topi NOD.

Analisi del PDIA1 circolante come biomarcatore associato al T1D

Oltre al suo ruolo intracellulare come tiolo reduttasi,43,54,55 PDIA1 è una proteina secreta.43 Per determinare se la sovraregolazione specifica delle isole di PDIA1 identificata nelle analisi di proteomica e immunofluorescenza fosse collegata a cambiamenti nei livelli circolanti di PDIA1, abbiamo sviluppato un test di elettrochemiluminescenza ad alta sensibilità utilizzando la tecnologia Meso Scale Discovery. PDIA1 è stato misurato utilizzando PDIA1 ricombinante diluito in serie (1:4) e questa analisi ha mostrato che PDIA1 poteva essere rilevato nell'intervallo da 0.152 ng/mL a 2500 ng/mL (Fig. 8a). Utilizzando il plasma raccolto dagli stessi topi utilizzati nell'analisi proteomica longitudinale mostrata in Fig. 2, abbiamo scoperto che i livelli plasmatici di PDIA1 erano significativamente aumentati nei topi NOD pre-diabetici rispetto ai topi CD1 a 10 e 14 settimane di età (Fig. 8b-d). Tuttavia, i livelli di PDIA1 non erano diversi tra topi NOD al momento dell'insorgenza del diabete e topi CD1 di pari età (Fig. 8e). Inoltre, i livelli di PDIA1 erano al di sotto dell'intervallo rilevabile nel plasma di topi NOD-SCID diabetici sottoposti a trasferimento adottivo di cellule T.

Successivamente, abbiamo applicato questo test a campioni di siero raccolti da bambini entro 48 ore dall'insorgenza clinica di T1D (n= 14; età media (media ± DS)= 11.57

± 4,05 anni; 8 maschio; 6 femmine) e nel siero raccolto

da controlli pediatrici non diabetici (n=10; età media=12.1 ± 4,20; 6 maschi; 4 femmine) (Tabella Supplementare S1). I livelli sierici di PDIA1 erano significativamente più alti nei soggetti pediatrici con T1D di recente insorgenza rispetto ai controlli, suggerendo che PDIA1 potrebbe avere utilità come biomarcatore clinico di T1D umano (Fig. 8f).

Discussione

In questo studio, abbiamo identificato i cambiamenti temporali nell'espressione della proteina delle cellule insulari durante l'evoluzione del T1D utilizzando tre distinti modelli murini di T1D e proteomica DIA ad alto rendimento. Inoltre, abbiamo illustrato l'utilità di un approccio imparziale per dare la priorità alle proteine ​​cellulari come biomarcatori T1D negli esseri umani, identificando PDIA1 come un esempio di una proteina secreta che è stata espressa in modo differenziato nelle isole NOD durante la progressione del diabete e nelle isole umane da donatori di organi con autoanticorpi positività e diabete. Infine, utilizzando un test di elettrochemiluminescenza ad alta sensibilità per misurare i livelli circolanti di PDIA1, abbiamo dimostrato un aumento dei livelli plasmatici di PDIA1 nei topi NOD pre-diabetici e nel siero di bambini con T1D di recente insorgenza rispetto ai controlli pediatrici abbinati per età e sesso.

L'analisi proteomica dei tre modelli murini ha rivelato diversi temi degni di nota. Nel set di dati ottenuto dalla coorte longitudinale NOD, abbiamo osservato un aumento precoce ma limitato nel tempo dell'espressione di diverse proteine ​​​​legate alla funzione secretoria, al ripiegamento della proinsulina e alla mitigazione dello stress, comprese le proteine ​​​​coinvolte nell'ER e nella segnalazione dello stress ossidativo. È interessante notare che abbiamo osservato la settimana -14 come un potenziale punto di flesso, in cui la perdita di espressione di queste proteine ​​protettive ha preannunciato l'insorgenza del T1D. Coerentemente con questa osservazione, l'analisi del percorso canonico delle proteine ​​espresse in modo differenziato dalle settimane 10, 12 e 14 e l'insorgenza del diabete hanno identificato la sovraregolazione dei percorsi associati alla sintesi di insulina difettosa e diversi percorsi di stress cellulare, tra cui la disfunzione mitocondriale, lo stress ER e attivazione UPR. Abbiamo osservato una down-regolazione delle vie di segnalazione che erano cruciali per la mitigazione dello stress cellulare in corso, inclusa la segnalazione redox del glutatione, che è noto per contrastare gli effetti delle specie reattive dell'ossigeno,56,57 e la maturazione del fagosoma, che è coinvolta nella la pulizia dei detriti cellulari.58,59

Questo modello bifasico ricorda i dati metabolici delle coorti di storia naturale di individui positivi agli autoanticorpi che progrediscono verso il T1D, dove ci sono cambiamenti compensatori nell'architettura della secrezione di insulina che mantengono in gran parte la glicemia fino a 12 mesi prima dell'inizio della malattia, seguiti dalla perdita di insulina secrezione e rapido peggioramento del controllo glicemico 12-6 mesi prima della diagnosi di diabete.2 Our

i risultati sono anche coerenti con studi trasversali che hanno analizzato i modelli di espressione genica e proteica in sezioni pancreatiche di donatori umani con diabete60-63 e in studi precedenti in modelli murini di diabete, dove è stato un ruolo preminente per ER e disfunzione mitocondriale identificato.8,12,64,65 Abbiamo scoperto che questi percorsi sono attivati ​​all'inizio del processo patologico, e c'è una continua sovrapposizione tra molti di questi percorsi di stress attivati ​​chiave nel modello di topo NOD e nel modello acuto e inducibile di T1D al tempo di insorgenza del diabete. Le somiglianze tra l'analisi proteomica di questi due modelli evidenziano l'importanza di questo nucleo di percorsi nella patogenesi del T1D.

Per verificare i risultati dell'analisi proteomica, abbiamo eseguito esperimenti di immunofluorescenza, concentrandoci su tre bersagli identificati nella coorte longitudinale NOD, 14-3-3, PRDX3 e PDIA1. I membri della famiglia di proteine ​​14-3-3 sono stati implicati in varie vie di segnalazione metabolica e sono stati collegati alla protezione contro l'apoptosi nelle cellule pancreatiche.42 PRDX3 previene la disfunzione mitocondriale e la sua sovraespressione ha dimostrato di essere protettiva contro lo stress ossidativo indotto da resistenza all'insulina e iperglicemia.52,66 PDIA1 è una tiolo ossidoreduttasi localizzata in ER altamente abbondante che è stata implicata nella secrezione di insulina stimolata dal glucosio, nell'elaborazione della proinsulina e nella protezione contro lo stress ER.43 In accordo con i precedenti rapporti, abbiamo osservato una correlazione positiva tra l'espressione dei marcatori di stress ER e PDIA1 nelle isole umane trattate con citochine proinfiammatorie o glucosio elevato. Inoltre, abbiamo osservato un aumento dei livelli di PDIA1 nelle sezioni pancreatiche di donatori di organi umani con positività agli autoanticorpi e con diabete.

Da notare che PDIA1 è una proteina secreta. In altri tipi di cellule, il rilascio di PDIA1 è aumentato in caso di lesioni e stress.67,68 PDIA1 extracellulare è stato collegato alla regolazione della formazione di trombi durante l'infiammazione vascolare,69,70 ma è necessaria una comprensione completa del ruolo extracellulare di questa proteina carente. È interessante notare che gli anticorpi anti-PDIA1 sono stati identificati in individui con T1D di recente insorgenza,71 suggerendo che il PDIA1 di origine cellulare funge da autoantigene T1D. Pertanto, abbiamo ipotizzato che l'aumento dell'espressione cellulare di PDIA1 possa riflettersi nella circolazione e che la misurazione di PDIA1 possa avere utilità come biomarcatore T1D. Per testare questa possibilità, abbiamo sviluppato un test di elettrochemiluminescenza ad alta sensibilità per misurare i livelli sierici e plasmatici di PDIA1. Utilizzando questo test, abbiamo documentato un aumento della PDIA1 plasmatica nei topi NOD pre-diabetici e nel siero di bambini con T1D di recente insorgenza.

Il nostro studio ha diversi limiti che dovrebbero essere riconosciuti. In primo luogo, ci sono differenze significative tra i modelli murini e il T1D umano,72-74 che sottolineano la necessità di convalidare in modo incrociato i risultati dei topi nei campioni umani. Abbiamo verificato i risultati chiave utilizzando isole umane e sezioni pancreatiche di donatori di organi umani. Data la natura progressiva della distruzione delle isole nei nostri modelli murini, siamo stati limitati dalla quantità di materiale di partenza nella nostra analisi proteomica, che si è riflessa nel fatto che 18 campioni di isole non sono riusciti a raggiungere i nostri rigorosi standard di controllo qualità. Questa limitazione, combinata con la mancanza di una libreria proteomica definita per le cellule delle isole murine, ha limitato il numero totale di proteine ​​che abbiamo identificato con sicurezza. Tuttavia, abbiamo superato questo vincolo utilizzando una ricerca DIA-Umpire senza libreria e una strategia che prevedeva la convalida a valle del nostro marcatore candidato. Infine, una limitazione di tutti gli studi di proteomica che impiegano isole intatte è che i dati rappresentano un gruppo eterogeneo di cellule endocrine e immunitarie. Pertanto, i risultati potrebbero non solo riflettere i cambiamenti nel proteoma cellulare.

Il nostro studio ha documentato un aumento dei livelli sierici di PDIA1 in una piccola coorte di soggetti pediatrici con T1D di recente insorgenza. Mentre i biomarcatori con la capacità di monitorare in modo non invasivo lo stress cellulare sono carenti nel T1D, è importante notare che il nostro è un piccolo studio trasversale e dovrebbe essere eseguita la validazione in coorti più grandi. Sarà essenziale testare i livelli di PDIA1 in campioni raccolti da coorti cliniche seguite longitudinalmente durante la progressione del T1D. Tale analisi fornirà le informazioni necessarie per capire se PDIA1 può prevedere il rischio di T1D. La nostra analisi delle sezioni pancreatiche umane ha indicato che i livelli di PDIA1 sono aumentati nelle isole pancreatiche negli individui a rischio che sono positivi agli autoanticorpi. Se PDIA1 sia puramente un marker di stress cellulare o possa riflettere i cambiamenti della massa cellulare non è chiaro dai nostri dati e dovrebbe essere testato in studi di follow-up. È interessante notare che i livelli di PDIA1 erano più alti nei bambini con T1D di nuova insorgenza, mentre gli aumenti plasmatici di PDIA1 erano più diversi ai tempi pre-diabetici nei topi NOD. Questi dati sono coerenti con scoperte più recenti che mostrano che esiste una massa cellulare sostanziale rimanente negli esseri umani all'insorgenza del T1D,75,76 mentre in entrambi i modelli murini qui studiati, le cellule sono quasi completamente distrutte al momento dell'insorgenza del diabete.26,77

Nonostante queste limitazioni, il nostro studio evidenzia il valore di approcci proteomici imparziali per identificare i percorsi cellulari coinvolti nell'evoluzione temporale del T1D. Utilizzando questa strategia, abbiamo identificato un insieme comune di percorsi modulati e correlati alla malattia in diversi modelli murini distinti di T1D. Infine, abbiamo identificato l'aumento dell'espressione di PDIA1 come marker di stress cellulare precoce nel T1D e i nostri dati indicano che la misurazione del PDIA1 sierico o plasmatico può servire come biomarcatore clinicamente utile che merita ulteriori test di follow-up nelle popolazioni a rischio di sviluppare T1D.

Contributori

FS e CEM hanno ideato e progettato lo studio. FS e RNB hanno eseguito esperimenti. KR e JV hanno preparato ed eseguito campioni LC-MS/MS. DS, XL, HW e PK hanno eseguito analisi computazionali. MRM, RGM, M-LY e MJM hanno interpretato i risultati. FS e CEM hanno interpretato i dati e scritto il manoscritto. Tutti gli autori hanno fornito revisioni critiche e modifiche al manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale. CEM è garante di questo lavoro. Sia FS che CEM hanno verificato i dati alla base di questo manoscritto.

Dichiarazione di condivisione dei dati

I dati presentati come parte di questo manoscritto sono disponibili su richiesta presso l'autore corrispondente. I dati di proteomica sono stati depositati nel database di proteomica PRIDE (ID di accesso: PXD035504).

Dichiarazione di interessi

CEM e FS hanno depositato una domanda di brevetto provvisorio per l'utilizzo di PDIA1 come biomarcatore del diabete. CEM ha fatto parte di comitati consultivi relativi alle iniziative di sperimentazione clinica di ricerca T1D: Provention Bio, Dompe, Isla Technologies e MaiCell Technologies. CEM è presidente della Immunology of Diabetes Society (IDS), co-direttore esecutivo della rete per i donatori di organi pancreatici con diabete (nPOD), consulente scientifico in TrialNet e PI dell'Isleto integrato NIH

Programma di distribuzione (IIDP). Queste attività non hanno affrontato direttamente gli argomenti trattati in questo manoscritto. Tutti gli altri autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R01 DK093954 e DK127308 (a CEM), R01 DK060581 (a RGM) e U01DK127786 e UC4 DK 104166 (a RGM e CEM), VA Merit Award I01BX001733 (a CEM), 2- SRA -2019-834-SB, JDRF 2-SRA-2018-493-AB (a CEM e RGM) e

regali dalla Sigma Beta Sorority, dalla Ball Brothers Foundation e dalla George and Frances Ball Foundation (a CEM). FS è stata supportata dalla borsa di studio post-dottorato JDRF (3-PDF-20016-199-AN e JDRF 5- CDA-2022-1176-AN). XW è stato supportato dalla sovvenzione NIH R01GM118470. RNB è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato JDRF (3-PDF-2017-385-AN). MRM è stato supportato dal T32 BTDR Fellowship Award (5T32DK101001-09) e dai fondi della Leslie Bottorff Fellowship della Purdue University. Questa ricerca è stata condotta con il supporto del Network for Pancreatic Organ donors with Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), un progetto collaborativo di ricerca sul diabete di tipo 1 supportato da JDRF (nPOD: 5-SRA{{ 18}}QR) e The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant# 2018PG-T1D053, G-2108-04793). Il contenuto e le opinioni espresse sono di responsabilità degli autori e non riflettono necessariamente la visione ufficiale di nPOD. Le organizzazioni per l'approvvigionamento di organi (OPO) che collaborano con nPOD per fornire risorse di ricerca sono elencate su http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners. Gli autori riconoscono il supporto dell'Islet and Physiology Core e del Translation Core dell'Indiana Diabetes Research Center (P30DK097512). Ringraziamo la Dott.ssa Emily Anderson-Baucum e il Dott. Jan Kajstura per la loro assistenza nella redazione del testo di questo manoscritto.