Una distribuzione distintiva del fattore inducibile dall'ipossia-1 nelle cellule tubulari renali coltivate con ipoperfusione simulata dal posizionamento del coprioggetto

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Toshitada Yoshihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Astratto

L'ipossia cronica nel tubulointerstizio renale gioca un ruolo chiave nella progressione della cronicarenepatologia(CKD). È quindi importante studiare l'ipossia tubulare e l'attività del fattore inducibile dall'ipossia (HIF)-1 in risposta all'ipossia. La rarefazione del capillare peritubulare provoca ipoperfusione nell'insufficienza renale cronica; tuttavia, l'effetto dell'ipoperfusione sugli HIF è stato studiato raramente. Abbiamo indotto l'ipoperfusione causata dal posizionamento del vetrino coprioggetto nell'uomorene-2 cellule e ho osservato un gradiente di ossigeno sotto il vetrino coprioggetto. L'immunocitochimica dell'HIF-1 ha mostrato una formazione a forma di ciambella sul bordo di un'area positiva al pimonidazolo, che abbiamo chiamato "anello HIF". La tensione di ossigeno dell'anello HIF è stata stimata tra circa 4 mmHg e 20 mmHg. Questo risultato non era compatibile con quelli di ricerche precedenti che mostravano l'accumulo di HIF-1 nell'intervallo anossico con tensione di ossigeno omogenea. Abbiamo inoltre osservato la presenza di un gradiente di pH sotto un vetrino coprioggetto, nonché uno spostamento dell'anello HIF a causa di cambiamenti nel pH del mezzo di coltura, suggerendo che l'anello HIF fosse formato dalla soppressione di HIF-1 correlato a pH basso. Questa ricerca ha dimostrato che l'attivazione di HIF-1 imita lo stato fisiologico nelle cellule in coltura con ipoperfusione.

PAROLE CHIAVEipoperfusione, ipossia, fattore inducibile dall'ipossia, gradiente di ossigeno, pH

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1|INTRODUZIONE

L'incidenza del cronicorenepatologia(insufficienza renale cronica) sta aumentando in tutto il mondo con l'invecchiamento delle società (Tonelli & Riella, 2014). La progressione dell'insufficienza renale cronica è irreversibile una volta che il danno renale raggiunge un certo grado e alla fine si traduce in malattia renale allo stadio terminale (ESRD), indipendentemente dalla malattia sottostante. Questo risultato indica l'esistenza di un "percorso comune finale". Secondo precedenti analisi patologiche, il declino della funzione renale è più fortemente correlato al danno tubulo-interstiziale che al danno glomerulare. Ci sono stati diversi rapporti che hanno dimostrato che la fibrosi renale induce ipossia cronica nel tubulointerstizio e questa ipossia tubulo-interstiziale aggrava la CKD e porta a ESRD. Questa evidenza indica che l'ipossia tubulo-interstiziale gioca un ruolo nel percorso comune finale di CKD (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Ilreneè altamente suscettibile all'ipossia a causa della sua elevata richiesta di ossigeno e dell'esistenza di uno shunt di ossigeno tra le arterie e le vene intrarenali (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Pertanto, riteniamo che sia essenziale studiare l'ipossia e la risposta all'ipossia nel tubulointerstizio renale.

La risposta biologica primaria all'ipossia negli organismi viventi avviene attraverso la via del fattore inducibile dall'ipossia (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF è costituito da - e -subunità. Sebbene la subunità - sia costitutivamente attiva, la subunità - è degradata in presenza di ossigeno. In condizioni normossiche, HIF- è idrossilato dal dominio della prolilidrossilasi (Ph.D.), rendendolo riconoscibile dal soppressore tumorale di von Hippel-Lindau (VHL). Questo riconoscimento si traduce nell'ubiquitinazione e nella degradazione dell'HIF idrossilato nel proteasoma. In condizioni ipossiche, HIF- si accumula nel citosol, perché HIF non idrossilato- sfugge alla degradazione. L'HIF accumulato viene traslocato dal citosol al nucleo, dove si dimerizza con l'HIF- e agisce come fattore trascrizionale, promuovendo l'espressione dei geni a valle. Delle tre isoforme identificate delle subunità HIF—HIF-1, HIF-2 e HIF-3 —è noto che le cellule epiteliali tubulari renali esprimono HIF-1 (Tanaka et al ., 2016). Studi precedenti hanno mostrato un accumulo transitorio o regionale di HIF nelrenecon CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012), e questo HIF è attivato nella ridotta tensione di ossigeno nell'ambiente CKD. Il disadattamento all'ipossia nella CKD potrebbe essere causato dalla presenza di fattori che sopprimono le vie HIF (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Gli effetti protettivi dell'attivazione di HIF sono stati riportati in diversi modelli animali, inclusi ratti diabetici indotti da streptozotocina e ratti nefrectomia 5/6 (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). dottorato di ricerca gli inibitori hanno recentemente attirato l'attenzione come nuovi approcci terapeutici all'anemia renale nei pazienti con insufficienza renale cronica (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). Tuttavia, i dettagli della progressione dell'ipossia renale e il modo in cui si verifica l'accumulo di HIF nelrenecon CKD, rimangono oscuri. L'idrossilazione dell'HIF-dipendente dall'ossigeno si verifica nel citosol ed è quindi importante misurare la tensione dell'ossigeno intracellulare ed extracellulare. Esistono diversi metodi utilizzati per misurare la tensione dell'ossigeno, incluso l'uso di microelettrodi o la risonanza magnetica dipendente dal livello di ossigeno nel sangue (BOLD-MRI). Abbiamo utilizzato la microscopia di imaging a fosforescenza a vita (PLIM) per la misurazione quantitativa dello stato di ossigeno intracellulare (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 è un colorante fosforescente a base del complesso iridio (III) BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoato-piridina, aac=acetilacetone) con un gruppo dimetilamminico cationico, che è passivamente distribuito nei lisosomi intracellulari. È stato sintetizzato come sonda fosforecente per misurare la pressione intracellulare di ossigeno (Yoshihara et al., 2015). PLIM con BTPDM1 ha consentito l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione della pressione parziale dell'ossigeno nelle cellule tubulari renali sulla superficie renale di topi normali, fornendo dati che indicano la presenza di un gradiente di ossigeno, anche nei reni normali (Hirakawa et al., 2018 ).

Ci sono gradienti di ossigeno negli organi viventi, inclusireni, anche in condizioni normali (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), e tali gradienti possono quindi essere previsti anche in CKD. L'ipoperfusione è causata dalla rarefazione della microvascolarizzazione nell'insufficienza renale cronica, in cui il danno glomerulare progressivo provoca una diminuzione del flusso sanguigno capillare peritubulare, aggravando la fibrosi interstiziale. La fibrosi interstiziale compromette la diffusione e l'apporto di ossigeno alle cellule tubulari e porta alla rarefazione del microcircolo, aggravando ulteriormente l'ipossia tubulo-interstiziale (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Gli effetti biologici dell'ipoperfusione, tuttavia, rimangono oscuri, poiché la maggior parte degli studi ha studiato gli effetti dell'ipossia e dell'HIF-1 sulle cellule in coltura in condizioni di perfusione omogenea e tensione di ossigeno (Rexius-Hall et al., 2017). Precedenti studi hanno dimostrato che le cellule in coltura monostrato ricoperte da un vetrino coprioggetto forniscono un buon modello di ipoperfusione indotta da una barriera alla diffusione nel mezzo di coltura. L'ipoperfusione modellata è associata a un gradiente di ossigeno perché un coprioggetto impedisce la diffusione dell'ossigeno dalla parte superiore del mezzo alle cellule (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). In un monostrato di cellule in coltura ricoperte da un vetrino coprioggetto, la tensione dell'ossigeno intracellulare diminuisce con la distanza dal bordo del vetrino a causa della limitata diffusione dell'ossigeno nelle cellule in coltura. Di conseguenza, si forma un gradiente di ossigeno dal bordo al centro del vetrino coprioggetto e la tensione intracellulare di ossigeno può scendere a un intervallo anossico al centro del vetrino (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015) . Nel presente studio, ci siamo concentrati sull'attivazione di HIF e studiato se esiste un cambiamento indipendente dall'ossigeno nell'espressione di HIF in presenza di ipoperfusione con un gradiente di ossigeno. Poiché l'ipoperfusione con un gradiente di ossigeno esiste nei tubuli renali in vivo, l'osservazione degli effetti indipendenti dall'ossigeno sull'espressione di HIF nel modello del vetrino coprioggetto può fornire informazioni sul meccanismo alla base dell'insufficienza dell'accumulo di HIF nella CKD.

estratto di cistancheper rene

2|MATERIALI E METODI

2.1|Coltura cellulare

Le cellule in coltura sono state incubate in un'incubatrice umidificata con il 5% di CO2. L'incubazione ipossica è stata eseguita in un incubatore personale a CO2/multigas APM-30D (Astec). L'anossia è stata indotta con una sacca per anossia, AnaeroPack e set di coltivazione anaerobici #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

Cellule HK-2 (Homo sapiens, umanorene, maschio, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), una linea cellulare epiteliale del tubulo prossimale immortalata da un normale rene umano adulto, sono state coltivate nella miscela di terreno/nutriente modificata di Eagle di Dulbecco F{{2} } Prosciutto (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich) contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) e soluzione di penicillina-streptomicina (15070063, Thermo Fisher Scientific) in un piatto di coltura da 10 cm. Per il passaggio, le cellule HK-2 sono state dissociate con tripsina (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) e centrifugate a 300 g per 5 min.

Cellule di cancro cervicale HeLa ed embrione umanorenele cellule 293 (HEK293) sono state coltivate in DMEM con glucosio basso (1000 mg/L) (D6046, Sigma Aldrich) contenente il 5% di FBS in un piatto di coltura da 10 cm. Queste cellule sono state fatte passare come cellule HK-2.

Le cellule epiteliali dei tubuli prossimali renali (RPTEC) (CC- 2553, Cambrex) sono state mantenute utilizzando i kit RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Per il passaggio, gli RPTEC sono stati dissociati utilizzando tripsina, neutralizzati con soluzione neutralizzante della tripsina (CC-5002, Lonza Ltd.) e centrifugati a 200 g per 5 minuti.

2.2|Istituzione di un modello di ipoperfusione mediante il posizionamento di un vetrino coprioggetto

I vetrini coprioggetto di forma rotonda di 15 mm di diametro (C015001, Matsunami) sono stati puliti mediante ultrasuoni e conservati in etanolo al 99,5% prima dell'uso. Sono stati impiegati due metodi, basati sull'osservazione delle cellule al di fuori del vetrino coprioggetto.

Le cellule in coltura monostrato sono state inserite tra un vetrino coprioggetto e il fondo di un piatto (Figura S1a, b) o un metodo alternativo (Figura S1c), come descritto di seguito. Per stabilire il nostro modello di vetrino coprioggetto per l'imaging dal vivo, sia l'imaging dell'ossigeno che l'imaging PH, è stato selezionato il metodo tradizionale o quello alternativo. Per l'immunocitochimica (ICC), è stato scelto il metodo alternativo, perché quando si utilizza il metodo tradizionale, la maggior parte delle cellule si staccava frequentemente dal fondo del piatto durante la rimozione del vetrino coprioggetto per la fissazione cellulare (Figura S2a).

2.2.1|Metodo tradizionale

Il giorno 1, le cellule sono state poste sul fondo di un piatto a base di vetro da 27 mm (3910-035, Iwaki) a una confluenza dell'100 percento * (circa 5,0 × 105/piatto). Sono stati coltivati ​​in DMEM/F12 contenente il 10% di FBS senza soluzione antibiotica durante la notte. Il giorno 2, un vetrino coprioggetto è stato posizionato sulle cellule in coltura per il periodo indicato (Figura S1b).

2.2.2|Metodo alternativo

Le cellule sono state seminate su un vetrino coprioggetto in un piatto di coltura da 35 mm a una confluenza dell'100 percento (circa 5,0 × 105/piatto) il giorno.

1. Sono stati coltivati ​​in DMEM/F12 contenente il 10 percento di FBS senza soluzione antibiotica durante la notte. Il giorno 2, il vetrino coprioggetto è stato invertito, per fissare la superficie delle sue cellule al fondo di un nuovo piatto a base di vetro da 27 mm per un periodo specificato (Figura S1c).

Abbiamo anche creato un modello di coprioggetto utilizzando coprioggetto di forma rotonda con un diametro di 10 mm (CS01005, Matsunami) (Figura S2b).

2.3|Imaging dell'ossigeno vivo con BTPDM1

Le cellule in coltura sono state preparate il giorno 1, come descritto sopra. Il giorno 2, le cellule sono state risciacquate due volte con la soluzione di sale bilanciato di Hanks (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) e incubate con BTPDM1 500 nM, un colorante lipofilo cationico a base di iridio utilizzato come sonda fosforescente intracellulare (Yoshihara et al., 2015), in DMEM/F12 senza rosso fenolo (21041-025, Thermo Fisher Scientific) per 30 min. Dopo che le cellule sono state lavate due volte con HBSS, sono state inserite tra un vetrino coprioggetto e il fondo di un piatto, come descritto sopra. L'intensità della fosforescenza da BTPDM1 in cellule in coltura ricoperte da un vetrino coprioggetto è stata osservata utilizzando un filtro di eccitazione ed emissione e la fosforescenza di BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) è stata rilevata utilizzando un microscopio a fluorescenza, BZ-X710 (Keyence Corporation). Le immagini ottenute dal microscopio a fluorescenza invertito sono state regolate per la luminosità e il contrasto utilizzando il software di analisi BZ-X.

2.4|Immunocitochimica

Le cellule su un vetrino coprioggetto sono state coltivate con 200 µM di pimonidazolo HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) in DMEM/F12 senza rosso fenolo per 1 ora, dopodiché il vetrino coprioggetto è stato girato e attaccato a un piatto di vetro di copertura, come descritto in precedenza. Le cellule sono state quindi coltivate in DMEM/F12 senza rosso fenolo per un periodo specificato. Quando non è stata utilizzata la colorazione di contrasto con pimonidazolo, è stato omesso il pretrattamento con pimonidazolo.

Dopo il completamento del periodo di coltura, ogni vetrino coprioggetto è stato raccolto e le cellule sono state immediatamente fissate con metanolo/acetone (1:1) su ghiaccio, dove sono rimaste per 30 minuti. Dopo aver lavato due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) di Dulbecco (D5652, Sigma Aldrich), la membrana cellulare è stata permeabilizzata per 30 minuti, incubata con 5% di albumina di siero bovino (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) per 30 minuti e successivamente con blocco proteico senza siero (X0909, DAKO) per 10 min. Le cellule sono state colorate con un primo anticorpo e successivamente con un secondo anticorpo fluorescente. L'elenco dei primi anticorpi è riportato nella Tabella S1. L'immunoglobulina policlonale anti-coniglio FITC-suina (F0205, diluizione 1:20, DAKO) è stata utilizzata come primo anticorpo se l'ospite era un coniglio. L'anticorpo fluorescente Alexa Fluor 594 streptavidina (S11227, diluizione 1:500, Thermo Fisher Scientific) è stato utilizzato come primo anticorpo se l'ospite era un topo, seguito da IgG antitopo biotinilato (H più L) (BA{{23} }, diluizione 1:1000, Vector Laboratories), come secondo anticorpo. La colorazione nucleare è stata eseguita utilizzando bisBenzimide H 33342 tricloridrato (B2261, Sigma Aldrich) per ciascun campione.

I segnali fluorescenti sono stati osservati utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito, BZ-X710 (Keyence Corporation) con i seguenti filtri: Texas Red con una lunghezza d'onda di eccitazione (Ex) di 560/40 nm, lunghezza d'onda di emissione (Em) di 630/75 nm, GFP ( Es: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) e DAPI (Es: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Le immagini sono state regolate per luminosità e contrasto utilizzando il software di analisi BZ-X.

2.5|ICC di HIF di cellule HK-2 trattate con cloruro di cobalto

Il metodo alternativo è stato modificato per produrre un modello coprioggetto di cellule HK-2 trattate con cloruro di cobalto. Le cellule HK-2 sono state seminate a densità semiconfluente (2,5 × 105/piatto) su un vetrino coprioggetto il giorno 1 e trattate con 300 µM di cloruro di cobalto esaidrato (C 8661, Sigma Aldrich) per 16 ore su Giorno 2. Il giorno 3, il vetrino coprioggetto è stato invertito per fissare le superfici cellulari al fondo di un nuovo piatto a base di vetro da 27 mm per 3 ore ed è stato eseguito l'ICC di HIF.

2.6|macchia occidentale

Per studiare l'accumulo di HIF{{0}} sotto diverse tensioni di ossigeno e a diversi livelli di pH, 1.0 × 106 HK-2 cellule per piatto di coltura da 10 cm sono stati incubati in normossia, 2% di ossigeno, 1% di ossigeno o anossia, per 5 ore, o in DMEM/F12 a pH 7,4, pH 6,0 o pH 5,0 per 5 ore.

Queste cellule sono state lisate in tampone RIPA contenente 50 mM Tris-buffer (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0,5 p/v percento di sodio desossicolato, 0,1 percento p/v di SDS e 1,0 percento p/v di NP40.

Per il western blotting, tampone campione SDS contenente {{0}}.35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 percento di SDS, 36 percento di glicerolo, 0,012 percento di blu di bromofenolo e 0,1 M di ditiotreitolo (DTT) è stato aggiunto alle proteine. Le proteine ​​contenenti tampone campione SDS sono state eluite facendo bollire a 95 gradi per 5 minuti.

Le proteine ​​sono state separate mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide SDS all'10 percento. Le proteine ​​sono state quindi trasferite su una membrana AmershamTM HybondTM PVDF (10600023, GE Healthcare) in tampone di trasferimento (tampone Tris-base 48 mM, glicina 39 mM, SDS 0,04% e metanolo 20 v/v) utilizzando un Trans-Blot® Sistema di trasferimento TurboTM (Bio-Rad). Le membrane sono state incubate a temperatura ambiente con anticorpi primari, anticorpi anti-HIF1 (NB100-134, diluizione 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) e anticorpi anti-actina (A2066 , diluizione 1:2000, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693), e successivamente nell'anticorpo secondario, immunoglobulina policlonale di capra anti-coniglio/HRP (P0448, diluizione 1:10000, DAKO, RRID: AB{{26 }}). Per il rilevamento è stato utilizzato il substrato per Western Blotting PierceTM ECL Plus (32132, ThermoFisher Scientific). La chemiluminescenza è stata osservata utilizzando un analizzatore di immagini luminose ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). La riproducibilità è stata confermata eseguendo almeno tre esperimenti indipendenti. L'intensità delle bande è stata quantificata utilizzando il software ImageJ del National Institutes of Health (Schneider et al., 2012).

2.7|Saggio reporter della luciferasi

È stato eseguito un test reporter della luciferasi per misurare l'accumulo di HIF1 nell'incubazione di colture ipossiche omogenee. In precedenza abbiamo costruito un gene della luciferasi contrassegnato guidato da un elemento sensibile all'ipossia (HRE) e sviluppato l'Hypoxia-Responsive Reporter Vector (Transgene Construction). Questo è stato costruito da copie tandem dell'HRE dal gene del fattore di crescita endoteliale vascolare del ratto subclonato nella regione 5' dell'unità di trascrizione am CMV-promotore-luciferasi (pre-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al., 2004).

Le cellule HK{{0}} a una concentrazione di 1,0 × 105 per pozzetto sono state preparate in 12-piastre di coltura di pozzetti (150628, Thermo Fisher Scientific). Le cellule sono state co-trasfettate con 500 ng di vettori pGL3-Basic HRE-luciferasi e 30 ng di vettori di controllo della luciferasi renilla pRL-SV40 (Promega), usando 2 µl di reagente di trasfezione FuGENE® HD (E2311, Promega) per bene. Come controllo negativo sono state utilizzate cellule HK-2 co-trasfettate con 500 ng di vettori di luciferasi di lucciola di base di pGL3- e 30 ng di vettori di controllo della luciferasi di renilla di pRL-SV40 (Promega).

Le cellule trasfettate sono state incubate in normossia, 2% di ipossia, 1% di ipossia o un sacchetto di anossia, per 5 ore. Le cellule sono state quindi raccolte utilizzando 100 µl di tampone di lisi proteica passiva, per il dosaggio della doppia luciferasi. Per le misurazioni è stato utilizzato un luminometro LB9507 (EG e Berthold). Per correggere l'efficienza della trasfezione, il valore relativo dell'unità luminosa della luciferasi della lucciola è stato diviso per quello della luciferasi Renilla.

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2.8|Analisi dell'apoptosi

Le cellule in coltura sono state coperte con un vetrino coprioggetto per 0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h e 24 h, quindi raccolte utilizzando tripsina. Le cellule trattate con perossido di idrogeno al 3 percento (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) per 30 minuti sono state preparate come controllo apoptotico. L'analisi quantitativa dell'apoptosi è stata eseguita utilizzando Muse Annexin V e Dead Cell Kits (MCH100105, Millipore) in un Muse™ Cell Analyzer (Millipore), secondo le istruzioni del produttore.

2.9|PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR)

L'estrazione totale dell'RNA e la sintesi del cDNA sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore rispettivamente per RNAiso Plus (9109, Takara) e PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara). La PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) nel sistema di rilevamento PCR in tempo reale CFX Connect (Bio-Rad). I livelli di trascrizione sono stati normalizzati al livello di espressione dell'mRNA di actina. qRT-PCR è stata eseguita in triplicato utilizzando primer gene-specifici. HIF-1 è stato amplificato utilizzando primer 5′-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3′ diretti e inversi 5′-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3′. -actina è stata amplificata utilizzando primer 5′-TCCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3′ diretti e inversi 5′-AACTGGTCTCAAG TCAGTGTACAGG-3′.

2.10|Trasfezione con siRNA

Per studiare il knockdown HIF-1 indotto da RNAi nelle cellule HK-2, sono state preparate 5.0 × 104 cellule HK-2 per pozzetto in piastre a sei pozzetti. Due tipi di RNAi — HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] e siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) — sono stati utilizzati con la lipofectamina RNAiMAX Reagente di trasfezione (Thermo Fisher Scientific). Come controllo negativo, è stato utilizzato Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); 1,5 µl di ciascun siRNA e 5 µl di RNAiMAX sono stati miscelati. Le cellule trasfettate con siRNA sono state incubate in condizioni normossiche o ipossiche (1 percento di O2) per 48 ore ed è stato estratto l'RNA. L'efficienza del knockdown dell'HIF-1 è stata esaminata mediante qRT-PCR.

2.11|Imaging dal vivo degli effetti di un gradiente PH

Abbiamo visualizzato il gradiente di pH intracellulare delle cellule viventi sotto un vetrino coprioggetti. Le cellule sono state trattate con l'indicatore di pH intracellulare pHrodo Green AM (p35373, ThermoFisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore, prima di implementare il modello di vetrino coprioggetto. Un microscopio a fluorescenza invertita, BZ-X710 (Keyence Corporation) con un filtro GFP è stato utilizzato per osservare la transizione temporale del gradiente di intensità di fluorescenza sotto un vetrino.

2.12|Analisi quantitativa dell'anello HIF

2.12.1|Sito dell'anello HIF

Abbiamo misurato la distanza degli anelli HIF e delle aree positive al pimonidazolo dai bordi del vetrino usando ImageJ, come segue. Sono state determinate le aree dei cerchi esterni ed interni dell'anello HIF e del cerchio positivo al pimonidazolo ed è stato calcolato il raggio di ciascun cerchio. Ciascun valore è stato sottratto da 7,5 mm, che è il raggio di un vetrino coprioggetto di 15 mm, per calcolarne la distanza dal bordo di un vetrino coprioggetto. Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti di ICC di HIF in ciascuna condizione.

2.12.2|Definizione dell'anello HIF

Abbiamo utilizzato immagini fluorescenti ottenute da un modello di vetrino coprioggetto incubato in normossia e pH neutro. Abbiamo definito il sito dell'anello HIF e il suo esterno e interno come scala 2,5–3.{3}} (0.22–0.45 mm), 0.5 –1.{11}} scala (1,12– 1,35 mm) e 5.0–5,5 scala (2,24–2,47 mm) rispettivamente dal bordo di un vetrino coprioggetto, utilizzando ImageJ. Abbiamo misurato cinque siti di segnali HIF-1 per campione e calcolato la media. Sono stati eseguiti tre esperimenti indipendenti di ICC di HIF.

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2.13|Misurazione della pressione dell'ossigeno mediante immagine PLIM

2.13.1|Realizzazione di una linea di taratura per la misura della pressione dell'ossigeno

È stata realizzata una curva di calibrazione di cellule HK-2, basata sul metodo descritto nel nostro precedente rapporto (Yoshihara et al., 2015). Le cellule HK-2 caricate con BTPDM1 500 nM per 30 minuti sono state coltivate in un incubatore multigas variabile a concentrazione di ossigeno dotato di un microscopio a fluorescenza invertito collegato al sistema di misurazione della durata. È stata costruita una linea di calibrazione basata sulle analisi di Stern-Volmer utilizzando la durata di fosforescenza (PL) delle cellule HK-2 sotto diverse tensioni di ossigeno utilizzando

Equazione (1)

dove τp rappresenta il PL in pO2, τ0 rappresenta il PL in deossigenazione, kq rappresenta la costante di velocità di spegnimento e pO2 rappresenta la pressione parziale dell'ossigeno. Utilizzando questa linea di calibrazione, la pressione dell'ossigeno potrebbe essere calcolata dal PL.

2.13.2|Immagine PLIM di un modello di coprioggetto

Sono state preparate celle HK-2 caricate con BTPDM1 500 nM per 30 minuti. Un modello di vetrino coprioggetto è stato costruito e coltivato in un incubatore multigas a concentrazione variabile di O2 dotato di un microscopio a fluorescenza invertito, collegato al sistema di misurazione della durata.

Le immagini della microscopia per imaging a fosforescenza (PLIM) sono state registrate utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita dotato di un sistema di scansione confocale (Hirakawa et al., 2018). Le immagini PLIM sono state ottenute dopo 30 minuti di incubazione in 21 percento di O2 o 4 percento di O2. Sono state prese quattro immagini PLIM per campione, dalle regioni superiore, inferiore, sinistra e destra vicino al bordo del vetrino coprioggetto, per determinare il PL medio, tenendo conto della variazione dei PL in un vetrino coprioggetto.

2.13.3|Identificazione dell'anello HIF in un'immagine PLIM

Il pimonidazolo è risultato positivo al di sotto di 10 mmHg di pressione dell'ossigeno. L'equivalente PL di 10 mmHg di pressione dell'ossigeno era 4034,6 ns, secondo la linea di calibrazione, quindi è stato possibile identificare la linea esterna del cerchio del pimonidazolo nell'immagine PLIM. Successivamente, è stato possibile trovare i siti degli anelli HIF esterno ed interno nell'immagine PLIM utilizzando l'analisi quantitativa della distanza. Abbiamo misurato la gamma di PL medi equivalenti all'anello HIF nel 21% di O2 e nel 4% di O2.

2.13.4|Misura della pressione dell'ossigeno dell'anello HIF

Abbiamo calcolato l'intervallo delle pressioni dell'ossigeno dell'anello HIF dai PL, utilizzando la linea di calibrazione. Le immagini PLIM sono state analizzate utilizzando SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2.14|analisi statistica

Il test di Dunnett è stato utilizzato per confrontare i gruppi sperimentali e di controllo e si è ritenuto che valori <.05 indicassero="" differenze="" statisticamente="" significative.="" i="" test="" t="" di="" student="" sono="" stati="" utilizzati="" per="" confrontare="" tre="" o="" più="" gruppi="" ed="" è="" stato="" applicato="" il="" valore="" p="" aggiustato="" di="" bonferroni.="" tutte="" le="" analisi="" statistiche="" sono="" state="" eseguite="" utilizzando="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" si="" presumeva="" che="" i="" valori="" derivassero="" da="" una="" popolazione="" normalmente="" distribuita="" e="" sono="" mostrati="" come="" media="" ±="" deviazione="" standard="">

cos'è una cistance

3|RISULTATI

3.1|Formazione del gradiente di ossigeno nel modello di ipoperfusione

Abbiamo confermato l'esistenza di un gradiente di ossigeno nel modello di ipoperfusione indotto dal posizionamento del coprioggetto valutando direttamente la tensione di ossigeno, utilizzando la fosforescenza. La misurazione dell'intensità della fosforescenza può prevedere una tendenza approssimativa della pressione dell'ossigeno (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Abbiamo osservato l'intensità della fosforescenza di un modello coprioggetto di cellule HK-2 trattate con BTPDM1. Le immagini dell'intensità della fosforescenza mostravano ipossia nella maggior parte dell'area all'interno del vetrino, ma nessuna ipossia vicino al bordo, un'osservazione che suggeriva l'esistenza di un gradiente di ossigeno attorno al bordo del vetrino nelle cellule HK-2 ricoperte da un coprioggetto (Figura 1a). Poiché l'intensità della fosforescenza dipende dalla concentrazione della sonda e dal tempo di eccitazione, una misurazione della durata della fosforescenza (PL) è utile per l'analisi quantitativa della pressione dell'ossigeno (Yoshihara et al., 2015). Pertanto, per la misurazione quantitativa della tensione di ossigeno delle cellule in coltura attorno al bordo di un vetrino coprioggetti, abbiamo ottenuto immagini PLIM di cellule HK-2 coperte con un vetrino per 30 minuti (Figura 1b). PL esteso all'aumentare della distanza dal bordo del vetrino coprioggetto. Abbiamo confermato che la tensione di ossigeno, calcolata utilizzando una linea di calibrazione (Figura S3), è diminuita all'aumentare della distanza dal bordo del vetrino coprioggetto, fornendo prove dell'esistenza di un gradiente di ossigeno attorno al bordo del vetrino (Figura 1c). L'esame del profilo temporale dell'intensità della fosforescenza ha indicato che il gradiente di ossigeno ha iniziato a formarsi 10 minuti dopo il posizionamento del vetrino coprioggetto

(Figura 1d).

3.2|Distribuzione HIF-1 unica nel modello di ipoperfusione, "anello HIF"

Abbiamo esaminato la distribuzione HIF-1 nel modello di ipoperfusione con un gradiente di ossigeno. L'ICC di HIF-1 nelle cellule HK-2 ha mostrato un aumento a forma di ciambella sul bordo dell'area positiva al pimonidazolo, che abbiamo chiamato "anello HIF" (Figura 2a). L'intensità del segnale HIF-1 era significativamente maggiore sull'anello HIF rispetto alle sue aree interne o esterne (Figura 2b). Questo fenomeno è stato confermato utilizzando ICC con un altro anticorpo HIF-1 (Figura S4a) o altre linee cellulari tubolari (Figura S4b, c). Abbiamo anche eseguito l'analisi ICC di HIF-1 in altri tipi di cellule in coltura, come le cellule di cancro cervicale HeLa. Sebbene la debole adesione di queste cellule a un vetrino coprioggetti abbia reso difficile una valutazione dettagliata della distribuzione di HIF-1, abbiamo osservato un miglioramento a forma di ciambella di HIF-1 nelle cellule HeLa (Figura S4d).

L'anello HIF e l'area positiva al pimonidazolo hanno iniziato a formarsi diverse ore dopo il posizionamento del vetrino coprioggetto e l'anello HIF è apparso statico entro 3 ore (Figura 2c). Il knockdown di HIF-1 ha provocato la scomparsa del segnale HIF-1 , incluso l'anello HIF (Figura 2d, Figura S4e), indicando che l'anello HIF dipendeva da HIF-1 .

Per studiare la possibilità che la formazione dell'anello HIF dipenda dall'ossigeno, abbiamo studiato la distribuzione di HIF-1 nel modello coprioggetto in incubazione con diverse tensioni di ossigeno. Abbiamo posizionato un piatto in camere ipossiche con diverse tensioni di ossigeno subito dopo aver realizzato un modello di vetrino coprioggetto. Durante l'incubazione ipossica, abbiamo osservato che sia l'anello HIF che l'area positiva al pimonidazolo sembravano espandersi verso l'esterno (Figura 3a). Abbiamo misurato la distanza di ciascun anello HIF e dell'area positiva al pimonidazolo da un bordo del vetrino coprioggetto in condizioni di normossia, 4% di O2 e 1% di O2 incubazione. Sia l'anello HIF che l'area positiva al pimonidazolo si sono espansi verso l'esterno al diminuire della tensione dell'ossigeno circostante (Figura 3b). Questi risultati indicavano che l'anello HIF dipendeva dall'HIF-1 e dalla tensione dell'ossigeno.

Per confermare che l'accumulo a forma di ciambella è un fenomeno specifico dell'HIF, abbiamo eseguito l'ICC con i geni di pulizia nel modello del vetrino coprioggetto. I segnali GAPDH e actina sono stati mantenuti sull'intera area di un vetrino coprioggetto ed erano comparabili tra la regione dell'anello HIF e le altre regioni (Figura S5a, b).

3.3|Misurazione dell'intervallo di pressione dell'ossigeno dell'anello HIF

Abbiamo confermato il potenziamento a forma di anello dell'accumulo di HIF-1 nelle cellule in coltura ricoperte da un vetrino coprioggetto, un fenomeno dipendente dalla tensione dell'ossigeno. Per determinare l'intervallo di tensione dell'ossigeno coinvolto, abbiamo analizzato la pressione dell'ossigeno dell'anello HIF utilizzando una tecnica di durata della fosforescenza. Abbiamo ottenuto immagini PLIM del modello coprioggetto dopo 30 minuti di incubazione in 21 percento di O2 o 4 percento di O2 (Figura 4a). L'anello HIF si è formato sul bordo del cerchio del pimonidazolo nell'ICC di HIF (Figura 3b). Abbiamo identificato il sito nell'immagine PLIM che era equivalente all'area pimonidazolo-positiva nell'ICC di HIF e successivamente identificato il sito corrispondente all'anello HIF (Figura 4b), utilizzando l'analisi quantitativa dei dati di distanza dall'anello HIF e il area pimonidazolo-positiva (Figura 3b). Abbiamo anche misurato l'intervallo di PL dell'anello HIF e quindi utilizzato una linea di calibrazione (Figura S3) per calcolare la pressione dell'ossigeno dell'anello HIF nel 21 percento di O2 (4,20 [3,46–4,97] ~ 35,9 [28,5–44,9] mmHg) e 4 percento di O2 (2,19 [0,21–4,32] ~ 20,4 [17,1–24,1] mmHg) (Figura 4c).

3.4|Accumulo di HIF-1 sotto tensione omogenea di ossigeno

Mentre segnali deboli di HIF-1 all'esterno dell'anello HIF in un modello di vetrino coprioggetto possono essere attribuiti a un'ipossia insufficiente, quelli all'interno dell'anello, dove HIF-1 avrebbe dovuto essere attivato più fortemente dalla tensione di ossigeno inferiore, devono essere controllato da un fenomeno indipendente dall'ossigeno. Per esaminare i fenomeni che causano un mancato accumulo massimo di HIF-1 nell'area anossica che si verifica solo nel modello di ipoperfusione, abbiamo esaminato se esistesse una relazione inversa tra tensione di ossigeno e accumulo di HIF-1 durante l'incubazione con tensione di ossigeno omogenea. L'analisi Western blot dei lisati cellulari sotto diverse tensioni omogenee di ossigeno ha mostrato un aumento dell'accumulo di HIF-1 durante l'incubazione anossica (Figura 5a). Il test reporter HRE-luciferasi ha anche indicato che l'accumulo di HIF-1 era aumentato con una tensione di ossigeno inferiore in condizioni di tensione di ossigeno omogenea (Figura 5b). Questi risultati hanno indicato che l'accumulo di HIF-1 dipendeva dalla tensione dell'ossigeno, con l'accumulo massimo osservato nell'intervallo anossico. Le caratteristiche di HIF-1 dovrebbero variare tra un modello di ipoperfusione e un modello con tensione di ossigeno omogenea. Abbiamo ipotizzato che il fenomeno unico dell'accumulo di HIF-1 in questo modello di ipoperfusione potesse essere determinato da un fattore diverso dalla tensione di ossigeno.

3.5|La formazione dell'anello HIF era indipendente dal dottorato di ricerca

Abbiamo esaminato se la degradazione dell'HIF-1, un possibile meccanismo di formazione dell'anello HIF, fosse sovraregolata all'interno dell'anello HIF. Questa idea sembrava non essere valida, perché l'idrossilazione mediante Ph.D., un processo limitante la degradazione dell'HIF, richiede ossigeno come substrato. Il cloruro di cobalto è ampiamente usato come stabilizzante chimico HIF. Abbiamo costruito un modello coprioggetto di cellule HK-2 trattate con cloruro di cobalto ed eseguito l'analisi ICC di HIF. Il segnale HIF-1 non è aumentato all'interno dell'anello HIF, il che è diventato poco chiaro a causa dell'aumento del segnale HIF-1 all'esterno dell'anello (Figura 6c). L'ICC delle cellule HK-2 con knockdown di PHD2, che si ritiene essere la prolilidrossilasi HIF primaria negli esperimenti di coltura cellulare (Strowitzki et al., 2019), ha prodotto risultati simili (Figura S6). Questi risultati hanno indicato che l'asse PHD-VHL della degradazione HIF non era correlato alla formazione dell'anello HIF.

3.6|Impatto del pH sull'accumulo di HIF-1

Un precedente rapporto descriveva l'uso di un modello di vetrino coprioggetto di miociti cardiaci che presentavano un calo del pH all'interno del vetrino coprioggetto (Pitts & Toombs, 2004). Abbiamo studiato il pH sotto un vetrino e il suo impatto sulla formazione dell'anello HIF. Abbiamo trattato le cellule HK-2 con un indicatore di pH intracellulare, la cui intensità di fluorescenza consente la valutazione del pH nelle cellule. L'imaging dal vivo ha mostrato che il pH è diminuito sulla maggior parte dell'area interna, ma non vicino al bordo del vetrino, suggerendo l'esistenza di un gradiente di pH attorno al bordo nel modello del vetrino (Figura 6a). L'analisi quantitativa della correlazione tra l'intensità della fluorescenza e la distanza da un bordo del vetrino ha mostrato che il primo era elevato all'aumentare della distanza, un'osservazione che supportava l'esistenza di gradienti di pH e ossigeno attorno al bordo del vetrino (Figura 6b). L'analisi Western blot dei lisati cellulari in concentrazioni omogenee di ossigeno ha rilevato che l'incubazione con terreno a pH 5,0 sopprimeva l'accumulo di HIF-1 in condizioni ipossiche (Figura S7a-d). Abbiamo anche confermato che l'accumulo di HIF-1 in ipossia in diverse condizioni di pH è diminuito al di sotto di pH 6,0 (Figura S8a-c).

Un rapporto ha sottolineato l'importanza di condizioni leggermente acide, a pH intorno a 6.0. Secondo questo studio, la riossigenazione dopo l'ipossia ha acidificato il mezzo, causando il sequestro nucleolare del VHL. A sua volta, la degradazione dell'HIF è stata prevenuta nei miotubi C2C12, nei neuroni PC12 e nelle 786-0 cellule tumorali renali (Mekhail et al., 2004). Nel nostro studio, non vi è stato alcun cambiamento nella distribuzione VHL nelle cellule tubulari tra le regioni con accumulo di HIF-1 e quelle in cui è stato soppresso, in un modello di vetrino coprioggetto con valori di pH da 5.{31}} a 7,4 (Figura S9a–c). Le cellule tubolari sono esposte a un'ampia gamma di condizioni di pH (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), quindi abbiamo studiato la variazione dell'anello HIF in mezzi di pH diverso valori compresi tra 5,0 e 8,5. L'anello HIF è stato chiaramente osservato in mezzi con pH 8,5 e 7,4 (Figura 6c). L'anello HIF esisteva anche a pH 6,5 ma era oscurato (Figura 6c). Il segnale HIF-1 è stato attenuato nell'intera area di un vetrino coprioggetto a pH 5,0. (Figura 6c). Abbiamo eseguito un'ulteriore analisi quantitativa della relazione posizionale tra l'anello HIF e il bordo dell'area positiva al pimonidazolo (Figura 7a) e abbiamo scoperto che la posizione dell'anello variava a seconda del pH. Il cerchio interno tendeva ad espandersi verso l'esterno a pH 6,5, rispetto a pH 7,4, mentre il cerchio esterno si rimpiccioliva significativamente verso l'interno a pH 8,5, in base al bordo dell'area positiva al pimonidazolo (Figura 7b, c). Abbiamo anche confermato che le attività dei geni di pulizia sono state mantenute in un modello di vetrino coprioggetto in incubazione acida (Figura S10). Pertanto, il pH sembra svolgere un ruolo importante nel meccanismo alla base della formazione dell'anello HIF.

4|DISCUSSIONE

In questo studio, abbiamo identificato una distribuzione unica di HIF-1 nelle cellule tubulari renali, utilizzando un modello di ipoperfusione indotta dal posizionamento del coprioggetto. Abbiamo scoperto che la formazione e il mantenimento dell'anello HIF erano regolati dalla pressione dell'ossigeno e dal pH, entrambi presenti in un gradiente nel bordo del vetrino coprioggetto di un modello di vetrino coprioggetto. Sulla base di questi risultati, proponiamo un possibile meccanismo per la formazione dell'anello HIF, che coinvolge HIF-1 che si accumula con la diminuzione della tensione di ossigeno e l'accumulo viene soppresso a causa del pH basso entro una certa distanza dal bordo del vetrino coprioggetto (Figura 8 ).

L'ipoperfusione è indotta dalla rarefazione della microvascolarizzazione nell'insufficienza renale cronica (Mimura & Nangaku, 2{{2{28}}}}10; Nangaku, 2006). Nel nostro lavoro precedente, abbiamo utilizzato l'imaging in vivo per dimostrare la presenza di un gradiente di ossigeno nelle cellule tubulari renali dei normali reni di topo (Hirakawa et al., 2018). La tensione dell'ossigeno dovrebbe anche essere eterogenea nelle cellule tubulari in CKD. Tuttavia, non è chiaro se l'esistenza di ipoperfusione con un gradiente di ossigeno influisca sul sistema di difesa contro l'ipossia, HIF. In questo studio, abbiamo studiato la distribuzione dell'HIF nelle cellule del tubulo prossimale coltivate sotto un modello di ipoperfusione e abbiamo scoperto che il gradiente di ossigeno nelle cellule tubulari renali coltivate è stato modellato con successo utilizzando un vetrino coprioggetto rotondo di vetro. Le prove provenienti da esperimenti che utilizzano una tensione di ossigeno omogenea hanno indicato che HIF-1, la cui idrossilazione e la successiva degradazione sono principalmente dipendenti dall'ossigeno, si accumulano. Questa è la quantità di HIF-1 che aumenta al diminuire della tensione di ossigeno. Nel nostro modello di vetrino coprioggetto, tuttavia, HIF-1 è stato soppresso nell'area anossica e ha avuto l'accumulo più elevato a una certa distanza dal bordo di un vetrino coprioggetto. Questo accumulo di HIF a forma di ciambella non è mai stato mostrato prima. Abbiamo dimostrato che il movimento dell'anello HIF può essere osservato indipendentemente dalla tensione di ossigeno dell'atmosfera di incubazione, ma la sua posizione dipendeva dalla tensione di ossigeno. L'intervallo di tensione dell'ossigeno sull'anello HIF è stato misurato a circa 4-20 mmHg utilizzando PLIM con BTPDM1. La maggior parte degli studi precedenti, incentrati su cellule in coltura in un'atmosfera con una tensione di ossigeno omogenea, ha rilevato che la quantità di proteina HIF-1 aumentava negli intervalli ipossici o anossici (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Pertanto, nel nostro modello, la formazione dell'anello HIF deve essere stata influenzata da un fattore diverso dalla tensione dell'ossigeno; era indipendente dal dottorato di ricerca, un processo di limitazione della velocità di degradazione dell'HIF. Una svolta nella delucidazione del meccanismo di formazione dell'anello HIF è stata la nostra scoperta del ruolo del gradiente di pH, così come del gradiente di ossigeno, nel modello del labbro di copertura, che limitava l'afflusso del mezzo simile a un'ipoperfusione in vivo modello. In questo modello di ipoperfusione, il pH intracellulare è diminuito all'aumentare della distanza dal bordo del vetrino coprioggetto ed è stato osservato un gradiente di pH attorno al bordo del vetrino coprioggetto. Abbiamo dimostrato che l'accumulo di HIF-1 è stato soppresso a pH basso, intorno a pH 5,0, rispetto all'incubazione a pH circa neutro sotto tensione di ossigeno omogenea. Il bordo esterno dell'anello HIF si è espanso verso l'esterno a pH 6,5 e il bordo interno dell'anello HIF si è ridotto verso l'interno a pH 8,5, in base al bordo dell'area positiva al pimonidazolo. L'anello HIF è stato oscurato in condizioni acide e il segnale HIF-1 è scomparso a pH 5,0. Pertanto, abbiamo chiarito l'importanza del pH per la formazione dell'anello HIF in un modello di vetrino coprioggetto. Abbiamo dimostrato la possibilità che l'anello HIF fosse formato dalla soppressione dell'accumulo di HIF-1 da un pH basso all'interno dell'anello.

Diversi studi precedenti che utilizzavano il metodo del coprioggetto hanno utilizzato le cellule tumorali. Secondo un rapporto che utilizzava la linea cellulare di epatoma umano Hep3B, che esprime lo spostamento verso il rosso dipendente dall'ossigeno della proteina fluorescente verde (AcGFP1), l'imaging dal vivo di cellule coperte da un vetrino coprioggetto rettangolare ha mostrato uno spostamento verso il rosso all'aumentare della distanza da un bordo del vetrino coprioggetto (Takahashi & Sato, 2010). Lo spettro di emissione delle cellule dell'epatoma è passato dalla lunghezza d'onda della fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP) a quella del rosso quando la tensione dell'ossigeno è diminuita. In un altro studio, la tensione di ossigeno delle cellule SCC-7 con un vetrino coprioggetto rotondo di 15- mm è stata misurata utilizzando una tecnica di durata della fosforescenza. La tensione dell'ossigeno era di 6,9 mmHg e 166 mmHg, calcolata da PL, che era rispettivamente di 3,89 µs e 893 µs, 0–2 mm all'interno e 0–1 mm all'esterno del bordo del vetrino coprioggetto (Yoshihara et al., 2015). Il metodo del coprioggetto è stato utilizzato anche con i miociti cardiaci, un sistema che ha attirato l'attenzione come promettente modello di ischemia-riperfusione in vivo. Kelly et al hanno mostrato che i miociti coperti da un vetrino coprioggetto hanno subito marcati cambiamenti morfologici nel tempo, accompagnati da alterazioni del potenziale della membrana mitocondriale e della dinamica della membrana plasmatica, con conseguente morte dei miociti. Hanno anche dimostrato che il pH intracellulare dei miociti ricoperti da un vetrino coprioggetto scende rapidamente a circa pH 4 al centro di un vetrino (Pitts & Toombs, 2004). Un modello coprioggetto, che inibisce la diffusione dell'ossigeno o nutrizionale alle cellule in coltura sotto un vetrino coprioggetto, può imitare un modello in vivo di zone ischemiche, normali e marginali rispettivamente al centro, all'esterno e al bordo di un vetrino coprioggetto. Diversi studi hanno utilizzato questo modello come modello di ischemia-riperfusione di miociti in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Per quanto ne sappiamo, il nostro studio è il primo ad applicare un metodo coprioggetto alle cellule tubulari. Nel nostro sistema, la distanza dal bordo di un vetrino coprioggetto a una regione equivalente a 10 mmHg di tensione di ossigeno, in cui il pimonidazolo dovrebbe diventare positivo, era di 1,22 mm e la tensione di ossigeno è diminuita fino a zero entro una distanza di 2 mm dal bordo del vetrino coprioggetto . Questo risultato potrebbe essere compatibile con i precedenti rapporti che utilizzavano coprioggetti di circa 15 mm, dimostrando l'esistenza di un gradiente di ossigeno almeno entro 2 mm dal bordo (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Abbiamo esaminato il tasso di apoptosi delle cellule sotto i coprioggetti (Figura S11) e abbiamo scoperto che GAPDH e actina erano mantenuti anche all'interno dell'anello HIF, indicando che l'anello HIF non era causato solo dall'apoptosi cellulare o dalla morte all'interno dell'anello HIF.

Diversi studi hanno misurato la tensione di ossigeno nei reni utilizzando metodi diversi. Alcuni esempi della misurazione della tensione di ossigeno dei reni normali erano i seguenti: 50 mmHg e 30 mmHg nella corteccia e nel midollo mediante microelettrodi; e 49 mmHg e 41 mmHg nei segmenti S1 e S2 delle cellule tubulari della corteccia utilizzando PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). La tensione di ossigeno dei reni malati sarebbe più bassa. Secondo un precedente rapporto che utilizzava microelettrodi di ossigeno, i ratti diabetici avevano una tensione di ossigeno parenchimale renale inferiore: 36 mmHg e 11 mmHg rispettivamente nella corteccia e nel midollo (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Poiché i microelettrodi di ossigeno misurano la tensione media di ossigeno nel parenchimale, nei reni malati è prevista una gamma più ampia. La tensione intracellulare di ossigeno è diminuita a zero mmHg in un modello di rene ischemico la cui arteria renale laterale e vena sono state bloccate (Hirakawa et al., 2015). Considerando questi risultati, l'intervallo di tensione dell'ossigeno sull'anello HIF, circa 4-20 mmHg, sembrava essere plausibile in vivo.

Abbiamo inoltre scoperto che il pH ha influenzato la formazione dell'anello HIF e la tensione dell'ossigeno. Poiché le cellule epiteliali tubulari nel rene sono continuamente esposte al liquido urinario, il pH delle cellule tubulari dovrebbe essere influenzato da quello dell'urina. Considerando l'ampio intervallo di pH nelle urine, abbiamo deciso di studiare le cellule incubate a un intervallo di pH di 5.0–8,5. Ci sono stati studi sull'intervallo di pH nei reni normali. Uno studio ha rilevato che il pH della corteccia era 7,39 ± 0.{{10}}8 e quello del midollo era 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, misurato utilizzando microelettrodi (Burke et al., 1999). Un altro studio, utilizzando l'imaging del pH basato sulla risonanza magnetica, ha mostrato valori di pH rispettivamente di 7,3 ± 0,13 e 7.{51}} ± 0,29 (Raghunand et al., 2003). È stato riportato che il pH renale è diminuito da 6,5 ​​a 6,32 e fino a 5,83 in un caso grave, in un modello murino di CKD con acidosi (Pavuluri et al., 2019). Queste osservazioni hanno fornito prove della caduta del pH e della variazione dell'insufficienza renale cronica. Tuttavia, l'impatto del pH sull'HIF-1 indotto dall'ipossia cronica nell'insufficienza renale cronica non è stato sufficientemente ben esaminato. Nel presente studio, è stato osservato uno spostamento dell'anello HIF tra pH 6,5 e pH 7,4, un intervallo di pH plausibile in CKD. Questo risultato ha supportato l'ipotesi che una lieve diminuzione del pH influisca sull'accumulo di HIF-1 nell'insufficienza renale cronica. Sulla base dell'evidenza di un calo del pH inferiore a 6,0 nei casi gravi di insufficienza renale cronica, è anche necessario valutare lo stato fisiologico HIF-1 a pH più basso. Sebbene siano stati segnalati che un ambiente acido, anche nella normossia, stabilizza l'HIF-1, la maggior parte di questi rapporti ha studiato condizioni di lieve acidità, oltre il pH 6,0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004) . In questo lavoro, abbiamo mostrato la soppressione dell'accumulo di HIF-1 nelle cellule tubulari a pH 5,0 e l'attenuazione dei segnali HIF-1 in un modello di vetrino coprioggetto incubato a pH 5,0. Pertanto, la diminuzione del pH renale nella CKD in vivo potrebbe essere correlata con un'insufficiente attivazione di HIF, nonché con le tossine uremiche nel rene ipossico, aggravando la progressione della CKD (Tanaka et al., 2013).

Il nostro studio ha diversi limiti. In primo luogo, nell'area dell'ipoperfusione, i terreni di coltura dovrebbero essere carenti di nutrienti, oltre alla presenza di carenza di ossigeno e pH ridotto. Tuttavia, è difficile delineare gli effetti del pH, della tensione di ossigeno e di altri fattori indotti dall'ipoperfusione. Nel corpo, l'ischemia, ipoperfusione patologica del sangue causata da una combinazione di basso contenuto di ossigeno e bassi nutrienti, si verifica negli organi e nelle cellule. È importante comprendere le differenze tra il rilevamento dell'ipossia e il rilevamento dell'ischemia. Nonostante la difficoltà nel chiarire l'effetto biologico di ciascun fattore, il nostro modello di ipoperfusione è fisiologicamente plausibile, imitando lo stato patologico in vivo. In secondo luogo, la realizzazione di un modello di coprioggetto richiede abilità e pratica, poiché la maggior parte delle cellule si è occasionalmente staccata durante la rimozione di un coprioggetto, soprattutto quando si utilizza il metodo tradizionale (Figura S2a). Questo problema dipendeva dalla linea cellulare utilizzata. Ad esempio, è stato difficile per noi applicare un modello di vetrino coprioggetto alle cellule HEK 293 perché la loro adesione a un vetrino coprioggetto era relativamente debole. In terzo luogo, era desiderabile ridurre al minimo i danni alle cellule in coltura sotto un vetrino coprioggetti. Il numero di cellule danneggiate è aumentato all'aumentare del periodo durante il quale sono state coperte, come mostrato dall'analisi dell'apoptosi. Abbiamo determinato che 3 ore erano appropriate per stimare l'anello HIF quando sembrava essere statico e circa il 10 percento delle cellule diventava apoptotico (Figura S11). La quarta limitazione era la difficoltà di attaccare le cellule in coltura a un vetrino coprioggetto in modo uniforme in ogni campione (Figura S2b, c). Anche la differenza di attaccamento tra un metodo tradizionale e uno alternativo per realizzare un modello con labbro di copertura potrebbe aver influenzato lo studio. Abbiamo misurato l'intervallo di tensione dell'ossigeno equivalente all'anello HIF mediante una tecnica di fosforescenza a vita, in cui abbiamo creato un modello di coprioggetto utilizzando un metodo tradizionale. Poiché l'anello HIF durante l'immunocitochimica è stato visualizzato utilizzando un metodo alternativo, la vera tensione dell'ossigeno potrebbe essere diversa. Abbiamo minimizzato questi errori utilizzando l'evidenza che il pimonidazolo era positivo a 10 mmHg o meno della tensione di ossigeno. La quinta limitazione è che il pH intracellulare non è necessariamente lo stesso del pH del mezzo di coltura. Diversi rapporti passati hanno dimostrato che il pH intracellulare è coerente con il pH medio in una certa misura nelle cellule in coltura (Michl et al., 2019), potremmo valutare solo l'andamento del pH intracellulare modificando il pH medio. In vivo, la relazione tra il pH delle regioni intracellulari ed extracellulari, come l'urina o il fluido corporeo, è più complicata rispetto alle cellule in coltura. Pertanto, in futuro saranno necessari ulteriori studi sul modo in cui lo spostamento del pH regola l'accumulo della proteina HIF-1 in vivo.

Vantaggio Cistanche: migliora renefunzione

Un'altra limitazione è che il pH dovrebbe avere un effetto sul marcatore dell'ipossia, il pimonidazolo. Abbiamo confrontato la distanza del bordo dell'area positiva al pimonidazolo dal centro di un vetrino coprioggetto in diverse condizioni di pH nel nostro modello di vetrino coprioggetto. Il bordo dell'area positiva al pimonidazolo era comparabile tra pH 6,5, 7,4 e 8,5 (Figura S12a, b). Uno studio precedente ha anche dimostrato il mantenimento del legame del pimonidazolo a diversi valori di pH (Kleiter et al., 2006). Sulla base di queste prove, abbiamo concluso che il pimonidazolo è un marcatore di ipossia appropriato per i nostri esperimenti sui vetrini coprioggetto. La limitazione finale è quella data un intervallo di tensione di ossigeno compreso tra circa 4 mmHg e 20 mmHg (da 0,52% di O2 a 2,6% di O2) dell'anello HIF, le porfirine Pt(II) e Pd(II), che sono ampiamente utilizzate come sonde di ossigeno, presentano vantaggi per la misurazione di concentrazioni di ossigeno molto basse a causa della loro durata della fosforescenza significativamente più lunga rispetto a quelle che utilizzano complessi Ir(III) (Yoshihara et al., 2017). Tuttavia, in generale, una misurazione quantitativa dell'ossigeno basata sulla fosforescenza, calcolata utilizzando l'equazione di Stern-Volmer, ha prestazioni migliori a bassi intervalli di O2 (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Diversi studi precedenti hanno dimostrato la misurazione basata sul complesso Ir(III) di tensioni di ossigeno a partire da circa 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Pertanto, riteniamo che l'intervallo di tensione dell'ossigeno dell'anello HIF dovrebbe essere un risultato preciso.

5|CONCLUSIONI

In sintesi, abbiamo scoperto che la comprensione dei ruoli sia dell'ossigeno che del pH è essenziale per comprendere lo stato fisiologico HIF-1 nell'insufficienza renale cronica e può essere ottenuta studiando le cellule tubulari con ipoperfusione. Il modello coprioggetto, con i suoi limiti di afflusso di media, era un buon modello di ipoperfusione in vivo, specialmente nei tubuli nell'insufficienza renale cronica, poiché la rarefazione dei capillari peritubulari è una delle principali caratteristiche dell'insufficienza renale cronica (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Questo modello di ipoperfusione può anche imitare i gradienti di ossigeno e pH in vivo, come tumori e lesioni ischemiche. Il modello fornisce un approccio promettente alla delucidazione di questi meccanismi biologici.

CONFLITTO D'INTERESSE

Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

CONTRIBUTI DEGLI AUTORI

Tutti gli autori hanno contribuito alla formazione del concetto generale. TH ha eseguito gli esperimenti complessivi. TH e YH hanno analizzato i risultati e fatto le cifre. TH ha scritto il manoscritto originale. KM, TY e ST hanno eseguito l'esperimento utilizzando una tecnica di durata della fosforescenza e hanno modificato la parte del manoscritto. YH, TT e MN hanno curato il manoscritto generale. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

RIFERIMENTO

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