Una nuova mutazione omozigote KLHL3 come causa di pseudoipoaldosteronismo autosomico recessivo di tipo II diagnosticato in età avanzata
Nov 02, 2023
Introduzione astratta:
Lo pseudoipoaldosteronismo di tipo II (PHA II) è una malattia mendeliana, caratterizzata da acidosi iperkaliemica e bassi livelli di renina plasmatica, tipicamente associati all'ipertensione. Le mutazioni in WNK1, WNK4, CUL3 e KLHL3 causano PHA II, con mutazioni dominanti in WNK1, WNK4 e CUL3 e mutazioni dominanti o recessive in KLHL3. Sono state segnalate quattordici famiglie con mutazioni recessive di KLHL3, con diagnosi all'età di 3 mesi fino a 56 anni, tipicamente in soggetti con funzionalità renale normale.
Metodi: Abbiamo eseguito indagini cliniche e genetiche in un paziente con ipertensione iperkaliemica e utilizzato simulazioni di dinamica molecolare, espressione eterologa in cellule COS7 e Western blotting per studiare l'effetto di una mutazione della malattia candidata KLHL3 sull'espressione della proteina WNK4.
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Risultati: la paziente, una donna di 58-anni proveniente da una famiglia consanguinea, presentava ipertensione, acidosi iperkaliemica persistente associata a grave dolore muscolare, nefrolitiasi, malattia renale cronica (IRC) e malattia coronarica. La terapia con idroclorotiazide ha corretto l'iperkaliemia, l'ipertensione e il dolore muscolare. L'analisi genetica ha rivelato una mutazione omozigote p.Arg431Trp in una posizione KLHL3 altamente conservata. Le simulazioni hanno suggerito una ridotta stabilità della proteina mutante, che è stata confermata dal Western blot. Rispetto al KLHL3 wild-type, la cotrasfezione di p.Arg- 431Trp KLHL3 ha portato ad un aumento dei livelli di proteina WNK4, che si ritiene causi un aumento del riassorbimento di NaCl tramite il trasportatore sensibile ai tiazidici e PHA II.
Conclusioni: Anche nei pazienti che si presentano in tarda età e in presenza di CKD, la PHA II dovrebbe essere sospettata se i livelli di renina sono bassi e l'acidosi iperkaliemica e l'ipertensione sono inadeguate per lo stadio della CKD, in particolare in presenza di un'anamnesi familiare sospetta.
introduzione
L’ipertensione arteriosa sistemica colpisce oltre 1,1 miliardi di adulti in tutto il mondo [1] ed è considerata il più importante fattore di rischio modificabile per morbilità e mortalità per tutte le cause a livello mondiale [2]. Circa il 90% dei pazienti adulti soffre della cosiddetta ipertensione primaria o essenziale con eziologia multifattoriale gene-ambiente [2], mentre nei restanti casi è possibile identificare una causa sottostante dell’ipertensione. Cause comuni di ipertensione secondaria sono l’aldosteronismo primario, l’apnea ostruttiva notturna, la malattia renale parenchimale e la stenosi dell’arteria renale [3]. In rari casi, l’ipertensione viene ereditata come tratto monogenico. I pazienti affetti tipicamente presentano bassi livelli di renina plasmatica, mentre i livelli di aldosterone ed elettroliti variano a seconda dell'eziologia sottostante [4]. Le forme mendeliane di ipertensione si manifestano spesso durante l'infanzia o la giovinezza. Gli adulti vengono raramente indagati per l'ipertensione monogenica; pertanto, la sua prevalenza nella popolazione generale rimane sconosciuta. In una coorte selezionata (criteri di inclusione almeno uno tra: età all'esordio inferiore o uguale a 35 anni, ipertensione resistente, ipertensione con anomalie elettrolitiche, anomalie ormonali, risultati di imaging anomali o segni clinici suggestivi), sono stati selezionati 37 geni candidati, e varianti patogene o probabilmente patogene sono state identificate in 33 casi su 1.179 (2,8%) [5].
Questo studio si concentra sullo pseudoipoaldosteronismo di tipo II (PHA II), una forma di ipertensione mendeliana caratterizzata da acidosi iperkaliemica e bassi livelli di renina plasmatica [6]. La PHA II è anche nota come ipertensione iperkaliemica familiare. È stata descritta per la prima volta nel 1964 da Paver e Pauline in un giovane maschio con grave ipertensione e iperkaliemia nonostante una funzione renale altrimenti normale [7], che è stato ulteriormente caratterizzato da Stokes e colleghi [8] e Arnold e Healy [9] e ha dimostrato di avere un basso renina plasmatica. In seguito al rapporto di una bambina di 10-anni con bassa statura, ipertensione, grave iperkaliemia, lieve acidemia, paralisi periodica e renina soppressa nel 1970 da Gordon et al. [10], la sindrome è stata occasionalmente chiamata anche sindrome di Gordon.
Nel 2001, le mutazioni nei geni serina-treonina chinasi WNK1 e WNK4 senza lisina (WNK) sono state identificate come cause di PHA II [11], e ulteriori mutazioni nei geni KLHL3 (che codifica per kelch-like 3) e CUL3 (che codifica per I geni cullin 3) sono stati descritti nel 2012 [12, 13]. Le sottoforme PHA II causate da mutazioni in WNK1, WNK4 e CUL3 sono malattie autosomiche dominanti, mentre le mutazioni KLHL3 possono essere ereditate sia in modo autosomico dominante che autosomico recessivo [12]. KLHL3 presenta un dominio BTB N-terminale, seguito da un dominio BACK e una struttura ad elica a sei pale C-terminale costituita dalle cosiddette ripetizioni simili a kelch (mostrate in Fig. 1d, 2a). Le mutazioni dominanti di KLHL3 si raggruppano all'interno o tra le pale dell'elica, mentre le mutazioni recessive sono distribuite in tutta la proteina [12]. I casi recessivi sono meno comuni dei casi dominanti; in totale, sono stati pubblicati 21 pazienti provenienti da 14 famiglie con mutazioni recessive KLHL3 [12-15] (Tabella 1).
La fisiopatologia alla base dell'ipertensione nella PHA II è l'aumento del riassorbimento di NaCl attraverso il trasportatore sensibile ai tiazidici (cotrasportatore Na-Cl, NCCT) nel tubulo contorto distale del rene e la terapia con tiazidici corregge sia l'ipertensione che le anomalie elettrolitiche nei pazienti con PHA II [16]. In breve, WNK1 e WNK4 fosforilano OSR1 (gene 1 di risposta allo stress ossidativo) e SPAK (chinasi ricca di prolina-alanina correlata a Ste20-), che poi fosforilano e attivano NCCT [17, 18]. KLHL3 è un adattatore del substrato dell'ubiquitina ligasi CUL3; il complesso KLHL3-CUL3 ubiquitinila le chinasi WNK e quindi ne promuove la degradazione [19]. La perdita della funzione dell'ubiquitina ligasi o il deterioramento del legame con le chinasi WNK causano un aumento dell'abbondanza di WNK, un aumento della fosforilazione dell'NCCT [18] e un aumento dell'assorbimento di NaCl nel tubulo contorto distale. Nei segmenti successivi del nefrone, il riassorbimento di NaCl tramite ENaC (canale epiteliale del sodio) e la secrezione di K+ tramite ROMK (canale del potassio midollare esterno renale) sono ridotti [20, 21]. Topi knockout per KLHL3 mostrano ipoplasia del tubulo contorto distale, livelli fortemente aumentati di WNK1 e WNK4 e aumento della fosforilazione di OSR1, SPAK e NCC nel rene. Inoltre, mostrano iperkaliemia, ipercloremia e acidosi metabolica [22]. Qui, riportiamo un paziente con PHA II autosomico recessivo e caratterizziamo la mutazione genetica e la fisiopatologia sottostanti
Materiali e metodi
Preparazione del DNA e sequenziamento di Sanger Il DNA è stato preparato da un campione di sangue venoso periferico utilizzando il kit QIAamp DNA Blood Maxi (Qiagen) secondo le istruzioni del produttore. La PCR standard e il sequenziamento bidirezionale diretto di Sanger del DNA genomico sono stati eseguiti utilizzando primer pubblicati per KLHL3 [13], WNK1 e WNK4 [11] e CUL3_9F (5′-AGGAGACACTTTCTCAAACCG-3′) e primer CUL3_9R (5′-TGTTCTTCTCCAAAACAATCTACC-3′) per CUL3. Il sequenziamento di Sanger è stato eseguito presso Eurofins Genomics.
Allineamento della sequenza
Sequenze proteiche omologhe sono state identificate utilizzando NCBI Protein BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) e il database EggNOG (http://eggnogdb.embl.de). Le sequenze mostrate includono KLHL3 umano e i suoi ortologhi: Homo sapiens (NP_059111.2), Mus musculus (NP_001349344.2), Gallus gallus (XP_015149442.1), Danio rerio (XP_021328460.1), Ciona intestinalis (XP_009862126.1), Drosophila melanogaster (NP_724095.1) e Caenorhabditis elegans (NP_001254310.1) . I paraloghi umani sono stati identificati dalla ricerca in letteratura e includono da KLHL1 a KLHL42 come mostrato nella Tabella supplementare online 1 (per tutto il materiale supplementare online, vedere www.karger.com/doi/10.1159/000521626) [23]. Le sequenze sono state allineate utilizzando Jalview versione 2.10.5 [24]. La struttura del dominio proveniva da UniProt (Q9UH77, accesso il 13 aprile 2021) ed è stata visualizzata utilizzando DOG [25].
Plasmidi e mutagenesi sito-diretta
I plasmidi pTRE2hyg WNK4 e pFN21A KLHL3 sono stati gentili doni del Dr. Shinichi Uchida (Tokyo Medical and Dental University). Per introdurre la mutazione p.R431W, i primer sono stati progettati utilizzando Primer X (https://www.bioinformatics.org/primerx): 5′- GATGAACACGCGGTGGAGCAGTGTGG -3′ (KLHL3_ R431W{{10} }F) e 5′- CCACACTGCTCCACCGCGTGTTCATC -3′ (KLHL3_R431W_1R). I residui mutanti sono mostrati in grassetto. La mutagenesi sito-diretta è stata eseguita utilizzando il kit di mutagenesi sito-diretta QuikChange con una DNA polimerasi ad alta fedeltà PfuUltra (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. Il cDNA è stato sequenziato da Sanger presso Eurofins Genomics. I plasmidi sono stati preparati utilizzando il kit QIAGEN Plasmid Plus Maxi.
Coltura dei tessuti, trasfezione transitoria e Western Blot
Le cellule COS7 sono state coltivate in DMEM + L-glutammina, 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina (tutti Gibco, Thermo Fisher). Per le trasfezioni, le cellule sono state seminate su piastre a pozzetti 6- con una densità di 1,9 × 105 cellule/pozzetto e coltivate fino a una densità di circa il 90%. Le cellule sono state trasfettate con 1 µg di pTRE2hyg WNK4 e 2 µg di pFN21A (vettore vuoto o KLHL3 wild type [WT]) o cDNA KLHL3 R431W utilizzando Lipofectamina 2000 (Thermo Fisher Scientific) secondo le istruzioni del produttore. Per la trasfezione sono stati utilizzati ciascuno due cloni indipendenti. Quarantotto ore dopo la trasfezione, le cellule sono state lavate in PBS freddo e lisate in Tris-HCl 10 mM (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM e NP40 all'1% contenente il cocktail completo di inibitore della proteasi (Roche, Merck). Il lisato è stato centrifugato a 20,000 g per 30 minuti a 4 gradi e il surnatante è stato conservato a -20 gradi. Le concentrazioni proteiche sono state determinate in duplicati (standard) o triplicati (campioni) mediante il test BCA (Pierce, Thermo Fisher) secondo le istruzioni del produttore. Circa 20 µg di proteina totale sono stati frazionati mediante SDSPAGE e trasferiti su una membrana in PVDF (1,5 ore, 100 V). Le membrane sono state bloccate nel latte in polvere al 2% nel TBST. Il Western blot è stato eseguito utilizzando anti-HaloTag policlonali di coniglio (Promega #G9281, 1:500, 4 gradi durante la notte), seguito da lavaggio e incubazione con IgG anti-coniglio IgG di asino (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # {{46 }}, dianova, 1:20,000, 1 ora a temperatura ambiente), lavaggio e rilevamento chemiluminescente potenziato (Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent, GE Healthcare). Le macchie sono state strippate utilizzando ROTIFree Stripping Buffer 2.0 (Carl Roth), bloccate in latte in polvere al 2% in TBST durante la notte a 4 gradi e incubate con anti-FLAG M2 monoclonale di topo (SigmaAldrich #F1804, Merck, 1:1,{{69} }, 1,5 h a temperatura ambiente), seguito da IgG anti-topo IgG di asino (H + L)-HRPO (Jackson ImmunoResearch # 715-035-151, dianova, 1:20,000, 1 h a temperatura ambiente temperatura), rilevamento, rimozione e blocco dell'ECL come sopra. Le macchie sono state quindi incubate con anti- -actina di topo monoclonale (Sigma-Aldrich # A2228, Merck, 1:5.000, 1 ora a temperatura ambiente) e IgG anti-topo con IgG di asino, seguite nuovamente dal rilevamento dell'ECL. Le bande sono state quantificate utilizzando il software Image Lab su un ChemiDoc XRS+ (Bio-Rad). Le intensità delle bande rilevate rispettivamente dall'anticorpo anti-HaloTag e dall'anticorpo anti-FLAG M2 sono state divise per le corrispondenti intensità delle bande rilevate dagli anticorpi anti- - actina. Per valutare i livelli di espressione di KLHL3, le cellule sono state trasfettate come sopra utilizzando tuttavia 0 µg, 0,5 µg, 1 µg, 2 µg, 4 µg e 8 µg di pFN21A KLHL3 WT o R431W. L'elettroforesi su gel e il blotting sono stati eseguiti come sopra. Per il test di caccia con cicloesimide, le cellule sono state seminate come sopra e trasfettate come sopra, tuttavia con 2 µg di pFN21A KLHL3 WT o 4 µg di KLHL3 R431W. Quarantotto ore dopo la trasfezione, sono stati aggiunti 100 µM di cicloesimide e le cellule sono state lisate dopo i tempi indicati. Ulteriori passaggi di analisi erano come sopra.
Fig. 2. Simulazioni MD dei domini Kelch WT e p.Arg431Trp (R431W) KLHL3. una vista dall'alto del dominio Kelch (PDBID: 4CH9), colorata dalle pale dell'elica (K1–K6). Il sito della mutazione è indicato da una stella gialla e la regione di interesse è colorata in grigio (residui 425–465) e il peptide WNK4 (non incluso nelle simulazioni) è trasparente e colorato in grigio. b Differenza nelle MSF del dominio Kelch mappate sulla spina dorsale proteica. Il sito della mutazione è indicato da una stella gialla. Il colore rosso indica le parti più dinamiche (meno stabili) della proteina. c RMSD dell'intera proteina (in alto), residui 425–465 (al centro) e tasca di legame WNK4- (in basso) dalla struttura cristallina per tre repliche di simulazione indipendenti (linee in grassetto, medie correnti). d Grafici di violino dei legami h (a sinistra) e della distanza COM (al centro) tra K3 (residui 425–441) e K4 (442–465) - pale dell'elica e componenti elettrostatici della tasca di rilegatura (a destra). e Sovrapposizione strutturale dell'interfaccia K3-K4 dal fotogramma finale (1,1 μs) di ciascuna replica (WT, blu; R431W, grigio) con i modelli sperimentali/iniziali (nero). La struttura proteica viene visualizzata come un cartone animato, con il residuo 431 visualizzato come bastoncini. MSF, fluttuazione quadratica media.
Simulazione di dinamica molecolare
Il modello WT era basato sulla struttura cristallina a raggi X (PDBID: 4CH9) del dominio Kelch umano in complesso con il frammento peptidico WNK4 [26]. Gli atomi mancanti e i cappucci terminali sono stati aggiunti utilizzando l'utilità psfgen nella versione 1.9.3 della dinamica molecolare visiva [27]. Il modello KLHL3 mutante (R431W) è stato generato utilizzando Modeller versione 9.18 [28]. L'intervallo finale dei residui per ciascun sistema era 300–585. I terminali N e C dei modelli WT e R431W sono stati neutralizzati rispettivamente mediante acetilazione e N-metilammidazione. Gli stati di protonazione predefiniti sono stati assegnati a ciascun residuo titolabile secondo l'analisi con PROPKA versione 3.0 [29]. Il peptide WNK4 è stato rimosso dalle simulazioni di produzione a causa della dissociazione da KLHL3 dopo le simulazioni di equilibrazione iniziali.
Tutte le simulazioni sono state condotte utilizzando il pacchetto software GROMACS versione 2021 [30]. I parametri del campo di forza CHARMM36m sono stati utilizzati per gli atomi proteici [31]. Gli ioni sono stati descritti utilizzando i parametri CHARMM predefiniti e il modello TIP3P è stato utilizzato per le acque [32]. Per la fase di equilibrazione iniziale è stata utilizzata una fase temporale di integrazione di 1 fs, mentre per tutte le simulazioni successive è stato utilizzato 2 fs. Tutti i legami che coinvolgono l’idrogeno sono stati vincolati utilizzando LINCS [33]. Le interazioni di Van der Waals non legate sono state calcolate utilizzando il potenziale di Lennard-Jones con un raggio di taglio di 1,2 nm; le forze sono state gradualmente disattivate nell'intervallo 1,2-1,0 nm. Tutti i valori elettrostatici sono stati calcolati utilizzando il metodo Ewald [34] della mesh di particelle levigate con una distanza di taglio nello spazio reale di 1,2 nm. Dopo una simulazione iniziale nell'insieme isocorico-isotermico (NVT), tutte le simulazioni successive sono state eseguite nell'insieme isobarico-isotermico (NPT) ad una temperatura di 310,15 K utilizzando il termostato a scala di velocità [35] con una costante di tempo di 0,5 ps. Il termostato è stato applicato separatamente alla proteina e al solvente (cioè acqua e ioni); gli stessi gruppi sono stati utilizzati per la rimozione del movimento del centro di massa (COM). È stata imposta una pressione di 1 bar utilizzando un barostato Berendsen [36] o Parrinello-Rahman [37] in modo isotropico con una costante di tempo di 5 ps.
I modelli WT e R431W sono stati solvatati in una scatola cubica con dimensioni iniziali di 1,2 × 1,2 × 1,2 nm3. Ciascun sistema è stato neutralizzato con NaCl 150 mM. Dopo un'iniziale minimizzazione dell'energia con discesa più ripida, ciascun sistema è stato equilibrato nell'insieme NVT per 5 ns con vincoli di posizione su tutti gli atomi proteici. Una successiva fase di equilibrazione è stata eseguita nell'insieme NPT per 5 ns con le stesse restrizioni della fase precedente. I vincoli di posizione sono stati rimossi da tutte le catene laterali per la simulazione finale dell'equilibratura di 5-ns. Tre strutture iniziali sono state generate dalla fase finale di equilibrazione per simulazioni di produzione indipendenti dei sistemi WT e R431W con tutti i vincoli di posizione rimossi. Ciascuna replica di produzione è stata simulata per 1,1 µs; i primi 0,1 µs sono stati rimossi dall'analisi.
Per valutare la stabilità strutturale nel corso delle simulazioni, sono state calcolate le deviazioni quadratiche medie (RMSD) dalla struttura cristallina per gli atomi di C dell'intera proteina, nonché per l'interfaccia K3–K4 (residui 425–465) e Tasca di rilegatura WNK4- (residui 339, 355, 360, 386, 402, 407, 432, 449, 451, 481, 498, 528 e 577). Le medie correnti delle tracce RMSD sono state calcolate e sovrapposte ai dati grezzi.
L'effetto della mutazione sulla stabilità strutturale è stato visualizzato calcolando la differenza nelle fluttuazioni quadrate medie degli atomi della proteina C, mediata su fotogrammi e repliche e mappando sulla struttura della proteina WT. Tutte le visualizzazioni delle proteine sono state generate utilizzando ChimeraX [38]. L'effetto della mutazione R431W sull'interfaccia da K3 (residui 425–441) a K4 (residui 442–465) è stato caratterizzato dall'analisi del legame idrogeno (legame H) e dalla distanza COM tra i due gruppi. I legami H sono stati valutati in ciascun fotogramma utilizzando lo strumento GROMACS gmx hbond, con cutoff di distanza e angolo di 3,5 Å e 30 gradi, rispettivamente. Le distanze COM sono state valutate in modo simile in ciascun fotogramma: le distribuzioni sia degli Hbond che delle distanze COM sono state visualizzate come grafici di violino. Le medie sono state calcolate su traiettorie e repliche.
L'elettrostatica della tasca di legame WNK4- è stata calcolata utilizzando g_elpot [39]. L'andamento temporale del potenziale elettrostatico nella tasca di legame è stato valutato definendo un volume sferico di raggio 8 Å, centrato nel centro geometrico dei residui costituenti la tasca di legame. Per valutare la varianza dell'elettrostatica, sono state calcolate le medie dei blocchi di 50-ns. La distribuzione del potenziale elettrostatico all'interno della tasca di legame per il mutante WT e R431W è stata visualizzata come grafici di violino, con medie calcolate su 50-ns blocchi e traiettorie.
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