Un nuovo peptide derivato dalla netrina-1- migliora la protezione contro la morte neuronale e attenua l'emorragia intracerebrale nei topi Parte 2
Aug 19, 2024
Inoltre, abbiamo scoperto che il peptide E1 attivava specificamente le vie di segnalazione FAK e SFK. Pertanto, il peptide E1 può avere effetti altamente specifici ed essere efficace nel processo di recupero dopo emorragia intracranica.
Esiste una relazione tra alta specificità e memoria. L’elevata specificità si riferisce all’attività più forte in aree specifiche del cervello quando le persone eseguono un compito. La memoria si riferisce alla capacità delle persone di apprendere e ricordare le informazioni. Quando impariamo a utilizzare un'elevata specificità per eseguire un compito, anche la nostra memoria aumenterà.
La ricerca mostra che quando abbiamo competenze ed esperienza specializzate in un compito, il cervello costruirà gradualmente circuiti neurali e schemi di memoria specializzati. Questi circuiti e modelli avranno un effetto specifico sulla risposta al compito, migliorandone così l'efficienza. Allo stesso tempo, quando eseguiremo compiti simili in futuro, questi circuiti e schemi verranno attivati anche per aiutarci a ricordare ed eseguire meglio il compito.
Compiti con elevata specificità includono musica, lingua, sport, ecc. E l’apprendimento di queste abilità può migliorare la nostra memoria. Ad esempio, quando un pianista si esercita a suonare, il cervello apprende le abilità specifiche del pianoforte e continua a rafforzare questi circuiti durante il processo di pratica. La creazione e il rafforzamento di questi circuiti miglioreranno anche la comprensione e la memoria della musica da parte del pianista.
Pertanto, esiste una relazione positiva tra alta specificità e memoria. L’apprendimento di competenze ed esperienze specifiche può non solo migliorare la nostra efficienza esecutiva, ma anche rafforzare la nostra memoria, aiutandoci ad apprendere e ricordare meglio varie informazioni. Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria, e Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antinvecchiamento, che possono aiutare a ridurre l’ossidazione e le reazioni infiammatorie nel cervello, proteggendo così la salute del cervello. sistema nervoso. Inoltre, Cistanche può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, la capacità di apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire il verificarsi di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.
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A differenza del peptide E1, il peptide E2 può attivare la segnalazione ERK, che promuove la morte neuronale. Ciò può essere causato da una motivina E2 Cx(1–2)Cx(3–4)Tx(0 –1)G che può attivare la via di segnalazione ERK [28].
Ciò indica che diversi peptidi derivati dalla Netrina-1- svolgono funzioni diverse. I principali recettori della Netrina-1 sono DCC e membri della famiglia UNC5 [50]. Il ruolo di DCC e UNC5H2 nell'ICH rimane controverso [51,52].
La sequenza di Netrin-1che abbiamo identificato è fondamentale per l'interazione di Netrin-1 con DCC [19]. Questi risultati suggeriscono che il DCC potrebbe partecipare al recupero funzionale indotto da Netrin-1-dopo l'ICH.
Sono necessari ulteriori studi per indagare i meccanismi alla base di questi processi e le relative vie di segnalazione. Negli esperimenti futuri, valuteremo le proprietà biologiche del peptide E1 per esplorarne la tossicità e l'emivita per l'applicazione clinica.
4. Materiali e metodi
4.1. Animali
Il laboratorio era un laboratorio esente da agenti patogeni specifici (SPF). Tutti i topi sono stati ospitati in un ciclo di luce-buio di 12-h con luci accese dalle 6:00 alle 18:00 e avevano accesso al cibo ad libitum. I topi DCC+/− sono stati generati come precedentemente descritto [53].
I topi Embryosof DCC+/− sono stati utilizzati per la coltura neuronale corticale. La genotipizzazione è stata effettuata mediante reazione a catena della polimerasi (PCR) come descritto in precedenza [53]. I topi C57BL/6J sono stati acquistati da Beijing Huafukang Bioscience Co., Ltd. (Pechino, Cina).
4.2. Costrutti
I costrutti di espressione che codificano il DCC umano (HGNC: 2701), il Netrin-1 umano (HGNC:8029) e l'UNC5A umano (HGNC:12567) sono stati generati nel nostro laboratorio [14,32,45].
pcDNA 3.1-hNetrin-1 (∆407–443)-myc-His è stato generato con un kit di clonazione Seamless Assembly (Clone Smarter, C5891, USA). La sequenza del cDNA di hNetrin-1 (∆407–443) è stata vista nella Tabella Supplementare S2.
Le sequenze di cDNA corrispondenti al dominio FN5 di DCC e gli amminoacidi 407–443 di Netrin-1 sono state costruite mediante ligazione nel vettore pGEX-5x-1 per produrre proteine di fusione GST.
4.3. Raccolta del mezzo condizionato Netrin-1
Il mezzo condizionato dalla netrina-1- è stato raccolto e convalidato come descritto nel nostro precedente rapporto [13,14]. In breve, la netrina umana marcata con Myc-His-1 è stata espressa nelle cellule HEK293T.
Dopo 24 ore, le cellule sono state lavate 3 volte con Opti-MEM (Invitrogen, 31985070, Carlsbad, CA, USA) e quindi incubate per tre giorni in Opti-MEM privo di siero.
Il mezzo è stato arricchito mediante filtrazione centrifuga (Millipore, UFC903096, Billerica, MA, USA) e conservato a -80 ◦C. La netrina arricchita-1 è stata sottoposta a immunoblotting con anti-His e quantificata mediante confronto con BSA come controllo del caricamento.
L'effetto di Netrin{{0}} è stato quindi valutato mediante fosforilazione di FAK. Normalmente, 0,1 mg/mL di Netrin-1 inducono efficacemente la fosforilazione di FAK e questa concentrazione è stata utilizzata nei nostri studi. La durata della stimolazione con Netrin-1 è stata di 20 minuti in tutti gli esperimenti, salvo diversa indicazione.
4.4. Analisi Western Blot
Il Western blotting è stato eseguito come precedentemente descritto [54]. I campioni sono stati lisati in tampone di lisi (1% Nonidet P-40, 0,5% sodio desossicolato, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 150 mM NaCl, 10% glicerolo, 1% Triton X-100, 100 mM NaF, 1 mM vanadato e inibitori della proteasi) per lisare le cellule e il tessuto cerebrale fresco.
Gli anticorpi primari utilizzati erano: anti-DCC di topo (1:500, #554223, BD, San Jose, CA, USA), anti-His di topo (1:1000, TA-02, ZSGB-BIO, Pechino, Cina ), anti-myc di topo (1:1000, 22E8, Sungene Biotech, Tianjin, Cina), anti-Netrin di topo-1 (1:1000, ALX804838, Enzo Life Sciences, Farmingdale, New York, USA ), topo anti-bandiera (1:1000, F3165, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), anti-fosfo-FAK di coniglio(pTyr861) (1:1000, F9176, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), anti-FAK di coniglio (1:200, sc-557, Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA), anti-fosforo di coniglio SRC (Tyr418) (1:1000, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) , famiglia anti-SRC di coniglio (1:1000,#2123, CST, Danvers, MA, USA), anti-GAPDH di topo (1:5000, TransGene Biotech, Pechino, Cina), anti-beta actina di topo (1:3000, A5441, Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA), anti-fosfo-ERK di coniglio (Thr202/Tyr204) (1:1000, #9101, CST, Danvers, MA, USA), anti-fosforo-ERK di coniglio (1:1000, # 4695, CST, Danvers, MA, USA), gli anticorpi secondari coniugati con HRP contro topo, capra o coniglio sono stati acquistati da Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA).
4.5. Legame alla superficie cellulare
Le cellule HEK293 placcate su vetrini coprioggetto sono state trasfettate con plasmidi Flag-DCC utilizzando il metodo del fosfato di calcio come descritto in precedenza [55]. Circa 40 h dopo la trasfezione, le cellule sono state incubate con 100 µg/mL di myc-Netrin-1 o myc-Netrin-1 (∆407–443) per 30 minuto prima di essere lavato per 5 minuti con HBHA (HEPES 20 mM, pH 7,0 e 0,5 mg/mLBSA in HBSS), risciacquato con 1× PBS e fissato sequenzialmente con paraformaldeide al 4% in PBS per 10 minuti. Gli anticorpi primari utilizzati erano anticorpi anti-myc di coniglio (1:200, Abcam, ab9106, Cambridge, MA, USA) e anticorpi anti-flag di topo (1:100, Sigma Aldrich, F3165).
Gli Ac . I nuclei sono stati colorati con 40,6-diamino-2-fenilindolo (DAPI) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Tutte le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale Zeiss LSM 880.
4.6. Riduzione GST
La proteina di fusione GST-DCC è stata purificata con sfere di glutatione-SepharoseTM 4B (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, Regno Unito) secondo il protocollo del produttore.
Circa 500 µg di lisato cellulare da cellule HEK293T trasfettate con i plasmidi indicati sono stati incubati con 2–5 µg di proteina di fusione GST-DCC-FN5 in tampone RIPA a 4 ◦C durante la notte. Le sfere di Glutathi-one-SepharoseTM 4B sono state utilizzate per catturare la proteina di fusione GST-DCC-FN5 e le sue proteine interagenti. Le proteine legate sono state rilasciate nel tampone di caricamento delle proteine mediante denaturazione termica.
4.7. Coltura primaria del neurone corticale
I neuroni corticali primari sono stati coltivati come precedentemente descritto [56]. In breve, gli embrioni (E17) sono stati rimossi da topi gravidi anestetizzati. Le cortecce cerebrali sono state separate e tagliate in piccoli pezzi.
Dopo l'incubazione in {{0}}.125% Trypsin Plus con 0,05% DNasi in HBSS a 37 ◦C per 20 minuti, le cellule sono state triturate con pipette Pasteur in vetro lucidato a fuoco e filtrate con un filtro da 40 µm.
Le cellule dissociate sono state sospese in DMEM con FBS al 10% e placcate su piastre rivestite di poli-D-lisina o vetrini coprioggetto a 37 ◦C in un'atmosfera di CO2 al 5%. Dopo 4 ore, il mezzo è stato sostituito con un mezzo neurobasale integrato con B27 e GlutaMAX.
4.8. Protocolli di coltura e trattamento cellulare NLT
Le cellule neuronali che esprimono GnRH di topo (NLT) sono state mantenute dal nostro laboratorio. Le cellule NLT sono state coltivate in DMEM (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) contenente il 10% di FBS (BiologicalIndustries, Kibbutz Beit Haemek, Israele) e l'1% di penicillina/streptomicina (Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) a 37 ◦C sotto un'atmosfera umidificata composta per il 95% da aria e per il 5% da CO2.
Per determinare la neurotossicità dell'emina, varie concentrazioni (0, 10, 30, 60, 90 e 120 µM) di emina (Sigma-Aldrich) sono state aggiunte alle cellule NLT e trattate per 6 ore. Di queste concentrazioni, 60 µM (LD50) sono stati selezionati e utilizzati negli esperimenti successivi.
I gruppi di controllo sono stati trattati solo con il veicolo (DMSO). La vitalità cellulare e la colorazione Live/Deadstaining sono state eseguite 6 ore dopo il trattamento. Per ciascun gruppo sono stati utilizzati tre pozzetti. Gli esperimenti sono stati ripetuti almeno 3 volte.
4.9. Modello in vitro di morte cellulare indotta dall'emina
La morte cellulare è stata indotta nei neuroni corticali primari e nelle cellule NLT mediante trattamento con emina 50μM e 60 µM, rispettivamente, come precedentemente descritto [57,58]. L'emina è stata sciolta in NaOH 0,1 M per generare una soluzione madre. Per gli studi di neuroprotezione, le cellule sono state trattate con emina 6 ore in presenza di agenti designati o selenito di sodio disciolto in acqua bidistillata.
4.10. Saggio CCK-8
La vitalità cellulare è stata misurata mediante il test CCK-8 (CK04, Dojindo, Kumamoto, Giappone) come precedentemente descritto [59]. In breve, i Neuronal sono stati seminati in piastre a 96-pozzetti con una densità di 6000 cellule/pozzetto in 100 µL di terreno di coltura e alimentati nell'incubatore durante la notte.
Le cellule sono state trattate con Hemin per 6 ore. Le cellule neuronali sono state lavate in PBS preriscaldato (37 ◦C) e reagente CCK-8 (10 µl per 100 µl di mezzo) in ciascun pozzetto.
Successivamente, abbiamo incubato le piastre per 2 ore in un'atmosfera al 5% di CO2 e l'assorbanza a 450 nm è stata misurata utilizzando un lettore di micropiastre. La vitalità cellulare era rappresentata come percentuale del controllo (cellule non trattate).
4.11. Colorazione vivo/morto
La capacità del test CCK-8 di misurare la vitalità è stata verificata mediante colorazione con calceina AM/PI in PBS (Live/Dead Assay, KeyGEN BioTECH, Nanjing, Cina) secondo le istruzioni del produttore.
La soluzione colorante era costituita da 2 µM di reagente calceina AM e 8 µM di reagente PI miscelati in PBS. I campioni sono stati incubati per 30 minuti e ripresi utilizzando una lente obiettivo 20x di un microscopio a fluorescenza (Olympus FSX100, Tokyo, Giappone). Per il modello in vitro della morte cellulare indotta dall'emina sono state utilizzate almeno 3 colture cellulari indipendenti.
4.12. Sintesi e somministrazione di peptidi
Pep Ctrl (NH2-TPCCGKTDVGI-CONH2), Pep E1 (NH2- HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep E2 (NH2- CPCKDGVTGIT-CONH2), Tat (NH{{11} }YGRKKRRQRRR-CONH2),TE1 (NH2- YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), TE1 etichettato FITC (NH2-YGRK-KRRQRRR-HPVGAAGKTCNQTTGQ-CONH2), Pep EGF3 etichettato FITC (NH{{ 27}}HPVGAAGKTCNQTTGQCPCKDGVTGITCNRCAKGYQQ-CONH2), Flag etichettato Pep Ctrl(NH2-DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-TPCRCGKTYDVGI-CONH2), Flag etichettato Pep E1 (NH2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGS-HPVGAAG KTCNQTTGQ-CONH2) e bandiera etichettata I peptidi Pep E2 (NH2- DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK-GGGGSCPCKDGVTGIT-CONH2) con una purezza del 99% sono stati acquistati dalla società Shanghai GL Biochem (Shanghai, Cina) e dalla società Wuhan Bioyeargene Biosciences (Wuhan, Cina).
For more information:1950477648nn@gmail.com
