Un nuovo schermo per i regolatori dell'espressione della proteina telomerica TRF2 ha identificato piccole molecole che compromettono l'immunosoppressione dipendente da TRF2 e la crescita del tumore

Si prega di contattareoscar.xiao@wecistanche.comper maggiori informazioni

Riassunto semplice:La proteina telomerica TRF2 (Telomeric repeat-binding factor 2) è sovraregolata nei tumori umani e associata a prognosi sfavorevole. Le proprietà oncogeniche di TRF2 si basano sul suo ruolo protettivo intrinseco dei telomeri, ma anche sugli effetti estrinseci delle cellule attraverso le attività immunosoppressive e angiogeniche. Pertanto, il targeting di TRF2 appare come una promettente strategia antitumorale terapeutica. In questo studio, abbiamo sviluppato un metodo cellulare per lo screening degli inibitori di TRF2 che ci consente di identificare due composti che attenuano le proprietà pro-oncogeniche di TRF2 in vivo.

Riassunto: Il fattore 2 di legame ripetuto telomerico (TRIF2) è una subunità del complesso proteico shelterin, che si lega e protegge i telomeri dall'attivazione indesiderata della risposta al danno del DNA (DDR). L'espressione di TRF2 gioca un ruolo fondamentale nell'invecchiamento e nel cancro, essendo sottoregolata durante la senescenza cellulare e sovraespressa durante l'oncogenesi. I tumori che sovraesprimono TRF2 spesso mostrano una prognosi sfavorevole. Nelle cellule tumorali, TRF2 svolge molteplici funzioni, tra cui la protezione dei telomeri e ruoli autonomi non cellulari, promuovendo la neoangiogenesi e l'immunosoppressione.puritani vitamina cPresentiamo qui una strategia di screening originale, che consente l'identificazione di piccole molecole che diminuiscono o aumentano l'espressione di TRF2. Attraverso lo screening di una piccola libreria di farmaci approvati dalla Food and Drug Agency (FDA), abbiamo identificato due molecole (AR-A014418 e alessidina-2HCl) che compromettevano la crescita del tumore, la neoangiogenesi e l'immunosoppressione sottoregolando l'espressione di TRF2 in un topo modello di xenotrapianto. Questi risultati supportano la strategia chemioterapica di sottoregolazione dell'espressione di TRF2 per il trattamento di tumori umani aggressivi e convalidano questo test basato su cellule in grado di eseguire lo screening di potenziali molecole anticancro e anti-invecchiamento modulando i livelli di espressione di TRF2.

Parole chiave:FR2; cancro; invecchiamento; test di screening cellulare; neoangiogenesi; soppressione immunitaria

Per favore clicca qui per saperne di più

1. Introduzione

I telomeri sono strutture nucleoproteiche specializzate che si trovano alle estremità dei cromosomi lineari che sono regolate da fattori associati ai telomeri come la telomerasi, i complessi proteici shelterin e l'RNA telomerico non codificante contenente ripetizioni [1]. Se adeguatamente regolati, i telomeri proteggono i cromosomi dall'instabilità e dalla senescenza. L'accorciamento del DNA telomerico si verifica come parte dello sviluppo fisiologico programmato e dell'invecchiamento [2]. Tuttavia, l'eccessivo accorciamento del DNA dei telomeri determina rare sindromi progeroidi, come la discheratosi congenita [3]. Inoltre, gli stati telomerici disregolati sono implicati in numerose malattie comuni a tutta la popolazione generale, inclusi quasi tutti i tipi di cancro e diverse malattie degenerative [4]. Pertanto, lo sviluppo di trattamenti farmacologici mirati a specifici componenti telomerici promette di prevenire e curare tali malattie.

Per quanto riguarda i telomeri e il cancro, i punti di controllo della risposta al danno del DNA vitale (DDR) a volte falliscono; questo può portare a un eccessivo accorciamento del DNA telomerico e a riarrangiamenti cromosomici aberranti, che a loro volta possono contribuire all'oncogenesi. Inoltre, la sovraregolazione della telomerasi è un evento chiave nello sviluppo di circa il 90% di tutti i tumori, poiché ciò può conferire una crescita illimitata alle cellule tumorali [5]. Per questo motivo, l'inibizione della telomerasi è stata l'obiettivo di numerosi studi volti a sviluppare trattamenti contro il cancro [6]. Nonostante i recenti progressi, ci sono alcune limitazioni all'uso clinico dei farmaci anti-telomerasi. Ad esempio, per fermare la proliferazione delle cellule tumorali, è necessario raggiungere una lunghezza del DNA telomerico criticamente breve e gli effetti anti-oncogenici dei telomeri accorciati vengono persi in assenza del gene soppressore del tumore p53 [7,8]. Questo periodo di ritardo riduce l'efficacia terapeutica e aumenta gli effetti collaterali pro-invecchiamento limitando il rinnovamento cellulare e favorendo l'attivazione di meccanismi alternativi di allungamento dei telomeri basati sulla ricombinazione [9,10].sistanoPertanto, le strategie anti-telomerasi possono essere più adatte per colpire le cellule tumorali che già ospitano telomeri corti critici [11].

Oltre alla telomerasi, i cambiamenti nell'espressione e nelle attività delle subunità complesse shelterin (TRF1, TRF2, RAP1, TIN2, TPP1 e POT1) sono coinvolti nella tumorigenesi e, in alcuni casi, indipendentemente dalla lunghezza dei telomeri [12-16]. Pertanto, prendere di mira la shelterin per il trattamento del cancro potrebbe essere un'interessante alternativa agli interventi anti-telomerasi. La subunità shel-terin TRF2 rappresenta un candidato interessante; TRF2 è sovraespresso in diverse neoplasie umane, sia nel cancro che nelle cellule vascolari e questo è tipicamente associato a una prognosi sfavorevole [17-20]. In particolare, la sovraespressione di TRF2 può promuovere la tumorigenesi non cellulare in modo autonomo, portando all'immunosoppressione e alla neoangiogenesi[13,18-20]In particolare, la sovraregolazione di TRF2 crea un potente microambiente immunosoppressivo. Alterando l'espressione dei proteoglicani dell'eparan solfato, TRF2 recluta e attiva direttamente le cellule soppressive di derivazione mieloide (MDSC) attraverso il percorso TLR2 [21]. Mentre la sovraespressione di TRF2 nelle cellule tumorali inibisce fortemente il reclutamento di cellule NK nel microambiente tumorale mediante la regolazione della sintesi di HSPG[13], l'attivazione di TLR2 di MDSC indotta dalla sovraespressione di TRF2 porta a una potente inibizione dell'immunosorveglianza delle cellule NK con una forte diminuzione di degranulazione delle cellule NK, produzione e uccisione di IFNgamma [21].cos'è la cistanchePertanto, la sovraespressione di TRF2 attenua fortemente la fase iniziale dell'immunosorveglianza antitumorale inibendo direttamente il reclutamento di cellule NK e indirettamente la funzionalità delle cellule NK attraverso la formazione di un microambiente immunosoppressivo MDSC-dipendente. Di conseguenza, prendere di mira TRF2 nei tumori potrebbe essere una preziosa strategia multi-hit attraverso processi cellulari autonomi e non cellulari, promuovendo il senesce e compromettendo la neo-angiogenesi e la fuga immunitaria.

cistanche può antinvecchiamento

Ad oggi, tutti i piccoli composti identificati che prendono di mira TRF2 compromettono la sua capacità di proteggere le estremità dei cromosomi dalla DDR, quindi con potenziali effetti collaterali pro-invecchiamento [22]. Il nostro lavoro precedente ha dimostrato che una parziale riduzione dell'espressione di TRF2 può invertire la tumorigenicità nei modelli murini attraverso effetti non autonomi cellulari, senza indurre DDR[13]. Abbiamo quindi ragionato sul fatto che concentrarsi sulla riduzione dell'eccesso di TRF2 nei tumori derivanti dalla sua sovraespressione potrebbe essere una strategia interessante per curare il cancro senza effetti collaterali pro-invecchiamento. In questo studio, presentiamo una piattaforma di screening originale per identificare piccoli composti mirati alla stabilità di TRF2. Mostriamo che due migliori risultati hanno inibito l'attività tumorigenica della sovraespressione di TRF2. Questo studio ha dimostrato che l'espressione di TRF2 può essere modulata farmacologicamente e che il nostro test di screening è un metodo affidabile per la selezione di farmaci in grado di modulare i livelli di espressione di TRF2, con potenziali proprietà antitumorali e antietà.

2. Materiali e metodi 2.1.Cellule

Rene embrionale umano (HEK)293-Le cellule T (ATCC CRL-1573) e le cellule BJ-HELTRas[13] sono state coltivate in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Lonza, Levallois Perret, Francia) integrato con Siero fetale di vitello al 10% (FCS), 100 IU/mL di penicillina e 100 ug/mL di streptomicina (Invitrogen, Cergy Pontoise, Francia).

2.2.SDS-PAGE e Western Blotting

I lisati cellulari totali sono stati preparati, separati mediante elettroforesi e asciugati come precedentemente descritto [14]. In breve, le cellule sono state raccolte e lisate in tampone di lisi (8,76 g/L NaCl 10 mM Tris-HCL pH7,2,0,1% SDS,0,1% Triton X -100,10 g/L sodio desossicolato, acido etilendiamminotetraacetico 5 mM (EDTA),1{{50}} ug/mL leupeptina, 1 mM AEBSF e 19 ug/mL aprotinina). I campioni sono stati quindi titolati utilizzando il kit di analisi delle proteine ​​BCA (Interchim, Monlucon, Francia). I campioni (60 ug/corsia) sono stati riscaldati a 95 gradi per 5 minuti in tampone di caricamento (Tris-HCl 500 mM, DTI 100 mM, SDS 2%, blu di bromofenolo 0,1%, glicerolo 10% pH 6,8). Quindi i campioni sono stati caricati su gel di poliacrilammide al 10% ed eseguiti per 45 minuti a 160 V. Le proteine ​​sono state quindi trasferite su membrane Immobilon-FL (Millipore, Upstate New York, USA) utilizzando Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio- Rad, Hercules, CA, USA). Le membrane sono state bloccate per 1 ora nel tampone Intercept Blocking (LI COR, Lincoln, NE, USA) prima dell'incubazione notturna a 4 gradi con una miscela di anticorpi primari (mouselgGl anti-TRF2 diluito a1: 250; e IgGanti-Beta-actina di coniglio diluita a 1:10,000) in tampone Intercept Blocking contenente lo 0,5% di Tween20. Dopo essere state lavate in PBS allo 0,1 percento di Tween20, le membrane sono state incubate per 1 ora a temperatura ambiente nel tampone bloccante Intercept contenente lo 0,25 percento di Tween20 con una miscela di anticorpi secondari: IRDye 680 di capra-anti-topo per l'anticorpo anti-TRF2 e IRDye di capra anti-coniglio 800CW per l'anticorpo anti-beta-actina (1:15,{68}} diluizione).Cstanche antietàGli anticorpi primari e secondari IRDye utilizzati sono elencati di seguito nella tabella degli anticorpi (Tabella 1). Infine, le bande proteiche sono state visualizzate utilizzando il sistema di imaging LiCor Odyssey 9120 (LI-COR). L'espressione di TRF2 è stata misurata normalizzando l'intensità della banda TRF2 alle intensità della banda di actina e dello sfondo.

2.3. Strategia di clonazione

La sequenza di cDNA TRF2 umana è stata clonata tra i siti di restrizione BamHI/BclI di un plasmide lentivirale SFFV-GPR che è un derivato dell'HIV-SFFV-GFP-WPRE [23]. Il plasmide SFFV-GPR contiene un promotore del virus che forma il fuoco della milza (SFV) che controlla un gene policistronico GPR comprendente sequenze di cDNA per proteina fluorescente verde (GFP), una proteina di resistenza alla puromicina e proteina fluorescente Tag-red (RFP)-T (Tag mutato S158T -RFP), ciascuno separato da sequenze di Picornaviridae E2 e T2. Il cDNA hTRF2 è stato inserito nella regione C-terminale di RFP-T, per consentire l'espressione di una proteina di fusione RFP-TRF2.

2.4. Produzione di lentivirus

Per la produzione di lentivirus, 5 × 10* HEK 293- cellule T sono state trasfettate con 8,6 ug di SFFV-GPR o RFP-TRF2- vuoti che esprimono il vettore SFFV-GPR, 8,6 ug di Lenti -Delta 8,91 e 2,8 ug di VSV-g tramite trasfezione mediata da fosfato di calcio. Le cellule trasfettate sono state coltivate in DMEM integrato con il 10 percento di FCS a 37 gradi con il 5 percento di CO2 in piatti di 10- cm. I surnatanti contenenti i virus di nuova costruzione sono stati raccolti dopo 48 ore, quindi passati attraverso un filtro Millipore da 0,45-μm. Dopo la titolazione del virus, è stato utilizzato un rapporto 1∶1 （virus∶cell） per infettare la linea cellulare BJ-HELTRAs, scelta per la sua resistenza ai difetti di TRF2[13].cistanche benefíciosUn clone che esprimeva GFP e la proteina RFP-TRF2 fusa a livelli moderati è stato quindi isolato mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS).

2.5. Screening della citometria a flusso

Le cellule della linea clonale BJ-HELTRas contenenti il ​​vettore SFFV-GPR ed esprimenti la proteina di fusione RFP-TRF2 sono state coltivate in 96-piastre a pozzetti in terreno DMEM integrato con 10 percento di FCS e 1 percento di penicillina/streptomicina. Dopo 24 ore di trattamento farmacologico, le cellule sono state quindi tripsinizzate e lavate in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente 0.5 mM EDTA e 2% FCS prima di fissarsi con 0,5% di formaldeide (FA). Le cellule fissate sono state quindi sottoposte alla citometria a flusso utilizzando un campionatore ad alto rendimento FacsCalibur (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA).

2.6. Reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR)

L'RNA totale è stato isolato utilizzando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Venlo, Paesi Bassi). La trascrizione inversa è stata eseguita utilizzando la trascrittasi inversa Superscript II (Invitrogen) con 1 ug di RNA totale. L'espressione di ciascun gene è stata normalizzata a quella di GAPDH. Sono stati utilizzati i seguenti primer: hTRF2 Fw 5'-GCTGCCTGACTIGAACAGT-3';hTRF2 Rv 5'-CCGTTCTCAACCAACCCCTC-3';hGAPDHFw5'-AGCCACATCGCTCAGACAC-3'hGAPDH Rv 5'-GCCCAATACGACCAAATCC{{ 14}}. 2.7.AlamarBlue

In una 96-piastra a fondo piatto per pozzetto, sono state seminate 5 × 103 cellule per pozzetto in 200 ul di DMEMsup integrato con il 10% di FCS. A 24 ore dopo il trattamento farmacologico, sono stati aggiunti 10 ul di AlamarBlue (Bio-Rad) e l'assorbanza è stata misurata a 570 nm e 600 nm per 36 ore in un lettore di piastre Spectrostar Nano (BMGLabtech, Ortenberg, Germania). La percentuale di ossidoriduzione di AlamarBlue è stata determinata come descritto dal produttore.

2.8.Animali

Gli esperimenti sono stati eseguiti su topi nudi NMRI di una settimana da 8- a 12-di una settimana da Janvier Labs (Francia). Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti secondo le linee guida istituzionali locali e internazionali e sono stati approvati dal Comitato per la cura degli animali dell'IRCAN e dal regionale (CIEPAL Cote d'Azur n. 187 e n. 188) e nazionale (Ministero della ricerca francese n. 03482.01/02482.2 e #02973.01/02973.2) autorità.

2.9. Esperimenti di crescita del tumore

Ciascun topo nudo NMRI è stato iniettato per via sottocutanea nella parte posteriore con 1 x 106 cellule BJ-HELTRAs sospese in 100 μL di PBS (n{4}} topi per gruppo). I topi sono stati trattati nei giorni 16, 18, 20 e 22 con iniezioni intraperitoneali di 100 ul di DMSO (45 percento), alessina-2HCl (1 mg/kg) o AR-A014418 (5 mg/kg), poi proseguito fino al giorno 26. L'aspetto del tumore è stato valutato ogni giorno mediante palpazione. La dimensione del tumore è stata misurata ogni 2-3 giorni utilizzando un calibro. Il volume del tumore è stato quindi determinato utilizzando la formula dell'emi-ellissoide: π×(L×1× h)/6, dove L corrisponde rispettivamente alla lunghezza, I alla larghezza e h all'altezza del tumore.

2.10.Saggi di tappi Matrigel

Le cellule BJ-HELTRas sono state trattate con DMSO (1 percento), alessina-2HCl (1 uM) o AR-A014418 （10 μM） per 2 giorni. Quindi, 100 μL di cellule trattate di 1 × 10 gradi sospese in PBS insieme a 400 μL di Matrigel a fattore di crescita ridotto (Corning, New York, USA) sono stati inoculati per via sottocutanea nella parte posteriore di topi nudi NMRI sotto anestesia con isoflurano. Al giorno 5 dopo l'inoculazione, i tappi Matrigel sono stati raccolti e le cellule infiltranti sono state raccolte mediante dissociazione enzimatica tramite dispasi (Corning), collagenasi A (Roche, Bale, Svizzera) e digestione DNAseI (Roche) per 30 minuti a 37 gradi [13 ]. Le cellule sono state saturate per 15 minuti in ghiaccio con anticorpi anti-CD16/CD32 Fe-Block (clone 2.4G2) prima della colorazione con anticorpi accoppiati per 30 minuti a 4 gradi. Gli anticorpi coniugati utilizzati sono elencati nella tabella degli anticorpi. Le cellule sono state lavate in PBS con 0,5 mM EDTA, 2% FCS e fissate con 0,5% FA. Le cellule colorate sono state analizzate utilizzando un citometro ARIA III con software DIVA6 (BD Biosciences) e FlowJo 10 (LLC).

2.11.Statistiche

Tutti i grafici e le analisi statistiche sono stati prodotti utilizzando il software GraphPad Prism (San Diego, CA, USA). Tutti i risultati sono rappresentati come media ± deviazione standard (sd) o media ± errore standard della media (SEM). Differenze significative tra le medie sono state determinate utilizzando il test a due code di Mann-Whitney. Il test log-rank (Mantel-Cox) è stato utilizzato per determinare la presa del tumore. Per ogni prova, pag<0.05 was="" considered="" statistically="">

3. Risultati

3.1.Identificazione delle Molecole Inibitrici di TRF2

Per lo screening di farmaci in grado di modulare i livelli di proteina TRF2, abbiamo utilizzato un sistema lentivirale per co-trascrivere il gene GFP e RFP fuso all'N-terminale di TRF2. Seguendo una strategia generale descritta altrove [23], abbiamo costruito un lentivirus GRT, in cui il promotore SFFV controllava l'espressione di un gene policistronico che codifica per GFP, una proteina di resistenza alla puromicina e RFP-TRF2 o RFP solo come controllo (Figura 1A). Di conseguenza, tutte le cellule trasdotte esprimevano sia GFP che RFP-TRF2. Questo sistema è stato progettato per identificare i farmaci che modulano l'espressione di TRF2, misurando l'intensità della RFP mediante citometria a flusso, mentre l'intensità della GFP funge da controllo interno per la trascrizione del costrutto reporter.

Abbiamo trasdotto i lentivirus GRT in fibroblasti umani BJ-HELTRas che sono stati immortalati da SV40 e hTERT e resi oncogenici da Ras v12[13]. Per facilitare le misurazioni della regolazione sia dell'up che del down di TRF2, un clone resistente alla puromicina che esprimeva moderatamente sia le proteine ​​​​GFP che RFP-TRF2 è stato isolato utilizzando l'ordinamento FACS e denominato GRI-BJ-HELTRas (Figura 1A). Come controllo positivo, abbiamo trattato le cellule GRT-BJ-HELTRAs con 10 uM di gemcitabina, un modulatore precedentemente descritto della stabilità di TRF2 [24], per 24 ore. Sebbene non sia stata rilevata alcuna modulazione RFP nelle cellule trasdotte con vettore vuoto, è stata osservata una significativa riduzione del rapporto di intensità di fluorescenza media (MFI) RFP/GFP nelle cellule GRT-BJ-HELTRas trattate con gemcitabina rispetto al controllo trattato con DMSO (82% del controllo;p<0.0001)(figure 1b).moreover,="" gemcitabine="" specifically="" diminished="" rfp-trf2="" protein="" levels="" without="" affecting="" gfp="" levels="" (figure="" s1a).="" of="" note,="" we="" observed="" here="" that="" gemcitabine="" is="" reducing="" trf2="" level="" in="" contrast="" to="" the="" published="" work[24],="" a="" difference="" that="" may="" be="" explained="" by="" cell="" type="" differences="" in="" the="" dna="" damage="" response="" induced="" by="" gemcitabine="" since="" trf2="" stability="" can="" be="" altered="" in="" a="" p53-dependent="" manner="" [25].="" this="" effect="" was="" further="" confirmed="" by="" western="" blotting="" analyses="" where="" we="" observed="" that="" endogenous="" trf2="" levels="" were="" affected="" by="" gemcitabine="" treatment="" on="" untrans-duced="" bj-heltras="" cells="" (figure="" s1b).therefore,="" grt-bj-heltras="" cells="" enabled="" detection="" of="" specific="" variations="" in="" trf2="" protein="" levels="" induced="" by="" drug="" treatment.="" or="" gemcitabine="" (right="" panel)(n=""><0.001;two-tailed student'st="" test).="" (c)representative="" rfp/gfp="" flow="" cytometry="" plots="" of="" trf2="" vector-transduced="" bj-heltras="" cells="" treated="" with="" 10="" um="" of="" alexidine-2hcl,="" ar-a014418="" or="" dmso="" (left="" panel).="" box-plot="" quantification="" of="" rfp-trf2="" fusion="" (trf2="" vector)="" proftein="" levels="" following="" treatment="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418(right="" panel)(n=""><0.05;mann-whitney test).(d)representative="" western="" blotting="" showing="" reduced="" trf2="" protein="" levels="" following="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" in="" untransduced="" bj-heltras="" cells="" (left="" panel;="" full="" western="" lolotting="" image="" is="" presented="" in="" figure="" s2a).="" quantification="" of="" trf2="" protein="" levels="" after="" treatment="" with="" 10="" μm="" alexidine-2hccl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="" treatment="" （right="" panel)(n="2;mean" +="" standard="" error="" of="" the="" mean).(e)quarntification="" of="" trf2="" mrna="" levels="" analyzed="" by="" rt-qpcr="" after="" treatment="" with="" 10="" um="" alexidine-2hcl="" or="" ar-a014418="" compared="" to="" dmso="" control="">

Utilizzando la citometria a flusso, abbiamo quindi esaminato 396 composti farmacologici approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) in grado di colpire sei categorie principali di processi biologici: canali ionici, fosfatasi, chinasi, fattori epigenetici, ligandi del recettore nucleare e il percorso Wnt (Figura S1C Le cellule GRT-BJ-HELTRas sono state prima trattate con 10 uM di ciascuno dei 396 composti o DMSO per 24 ore prima dell'analisi della citometria a flusso (Figura S1D). In questo caso, è stato riscontrato che 84 composti modulano i livelli di proteina TRF2 (Figura S1D, pannello di destra; Tabella S1) e sono stati utilizzati per uno schermo secondario (Figura S1E; ​​Tabella S1). In questa schermata secondaria, oltre a trattare le cellule GRT-BJ-HELTRas con 10 uM dei composti selezionati, le cellule BJ-HELTRas non trasdotte o le cellule BJ-HELTRas trasdotte con un vettore vuoto sono state trattate in modo simile per scartare i falsi positivi che emettevano rosso o autofluorescenza verde o che interessano le proteine ​​RFP o GFP. I 18 migliori composti sono stati quindi selezionati per determinare la loro capacità di modulare l'espressione di TRF2 endogeno in cellule BJ-HELTRAs non trasdotte, sulla base del Western blotting (Figura S2A, Tabella B S1). Abbiamo definito gli hit come composti che modulano almeno il 20 percento del dosaggio di TRF2 (in alto o in basso). Usando questi criteri, dai 18 farmaci valutati mediante Western blotting, 9 di questi hanno ridotto e uno aumentato i livelli di proteina TRF2 endogena (Figura S2A, Tabella S1) Abbiamo quindi deciso di scegliere due composti tra questi farmaci per esperimenti in vivo per determinare se potevano contrastare gli effetti pro-oncogenici della sovraespressione di TRF2. Per evitare l'attivazione di DDR e gli effetti collaterali nelle cellule non tumorali, abbiamo selezionato composti che non riducevano né il dosaggio di TRF2 ai livelli più alti né ai livelli più bassi. Tra questi, AR e AD corrispondevano a tali criteri. Entrambi i composti hanno sottoregolato RFP-TRF2 nelle cellule GRT-BJ-HELTRas analizzate mediante citometria a flusso (Figura 1C), livelli di proteina TRF2 endogena come mostrato dall'analisi Western blotting (Figura 1D; Figura S2A, B) e livelli di mRNA TERF2 determinati tramite RT -qPCR (Figura 1E). Inoltre, il trattamento con le rispettive concentrazioni LD50 di AR e AD ha ridotto l'espressione dell'mRNA di TERF2 in entrambe le cellule BJ-HELTRas e nelle cellule BJ-HELTRas con sovraespressione di TRF2- (Figura S3A-C).

3.2.AR-A014418 e alessidina-2HCl hanno invertito la tumorigenicità conferita da alti livelli di espressione di TRF2

Successivamente abbiamo valutato l'impatto di AR e AD sulla crescita del tumore. Per controllare la loro capacità di colpire i tumori che sovraesprimono TRF2-, abbiamo analizzato i potenziali effetti antitumorali di AR e AD sia sulle cellule BJ-HELTRas standard che sulle cellule BJ-HELTRas con sovraespressione di TRF2-. Le cellule BJ-HELTRas sono state trasdotte con vettore lentivirale TRF2 o vettore vuoto, quindi iniettate per via sottocutanea in topi nudi. I topi sono stati quindi trattati con DMSO, 1 mg/kg AD o 5 mg/kg AR ai giorni 16,18,20 e 22 dopo l'iniezione [26,27] (Figura 2A). Come riportato in precedenza [13,21], la sovraespressione di TRF2 promuoveva il tumore ini. tiation e crescita in vivo (Figura 2B-D; p<0.05). treatment="" with="" neither="" ar="" nor="" ad="" impacted="" tumor="" volume="" in="" bj-heltras="" cells="" transduced="" with="" the="" empty="" vector="" (figure="" 2e,="" upper="" panels)="" neither="" tumor="" growth="" rate(figure="" 2f-h).="" by="" contrast,="" both="" drugs="" induced="" a="" significant="" decrease="" in="" the="" tumor="" volume="" of="" trf2-overexpressing="" xenografted="" tumors,="" leading="" to="" significantly="" smaller="" tumor="" sizes="" at="" day="" 26="" (figure="" 2e,middle=""><001)but also="" of="" the="" tumor="" growth="" rate="" (figure="" 2f-h)="" at="" each="" time-point.="" furthermore,="" the="" vol-ume="" and="" growth="" rates="" of="" trf2-overexpressing="" tumors="" treated="" by="" the="" two="" drugs="" returned="" to="" levels="" similar="" to="" those="" of="" the="" control="" tumors,="" thus="" demonstrating="" the="" trf2-specific="" selectivity="" of="" ar="" and="" ad="" (figure="" 2e,lower="" panels).these="" results="" show="" that="" ar="" and="" ad="" treatment="" reversed="" specifically="" the="" tumorigenicity="" conferred="" by="" trf2="" overexpression.="" or）="" were="" injected="" subcutaneously（1×10°cells/100μl）into="" nmri="" nude="" mice.="" the="" mice="" were="" then="" treated="" with="" dmso,alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)="" or="" ar-a014418(5="" mg/kg)="" at="" days16,18,20="" and="" 22="" post-injection,="" then="" followed="" up="" until="" day="" 26="" (n="8" mice="" per="" group).(b-d)="" the="" percentage="" of="" tumor-free="" mice="" (b)="" and="" tumor="" volumes(c)="" were="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" in="" mice="" injected="" with="" bj-heltras="" cells="" overexpressing="" trf2(trf2="" vector)="" or="" empty="" vector.="" tumor="" take="" based="" on="" palpability="" was="" determined="" at="" the="" indicated="" time="" points="" and="" is="" represented="" as="" a="" percentage="" of="" tumor-free="" mice.p="" values="" were="" determined="" using="" the="" log-rank="" mantel-cox="" test(*=""><0.05). tumor="" volumes="" were="" assessed="" at="" different="" time-points="" (mean="" ±="" standard="" deviation);="" tumor="" volume="" at="" d.ay="" 15="" is="" represented="" in="" (d).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><0.001). (e)="" tumor="" volumes="" were="" followed="" as="" in="" (c)="" after="" repetitive="" treatments="" with="" dmso,="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg),="" or="" ar-a014418(5mg/kg).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><0.0001;ns: not="" significant).(f-h)="" tumor="" growth="" rate="" of="" ar-a014418(5mg/kg)treated="" mice(f,h)="" or="" alexidine-2hcl="" (1="" mg/kg)(g,h)="" treated="" mice="" were="" determined="" by="" considering="" the="" last="" day="" before="" treatment="" for="" empty="" vector="" or="" trf2="" vector="" as="" 100%.="" variations="" of="" the="" growth="" rate="" in="" both="" treatments="" over="" the="" time="" are="" represented="" in="" (f,g)="" and="" for="" each="" time-point="" (h).p="" values="" were="" determined="" using="" the="" mann-whitney=""><><><>

3.3.AR-A014418 e alessidina-2HCI contrastato con TRF2-Immunosoppressione e neoangiogenesi dipendenti

Per determinare se gli effetti antitumorali di AR e AD potrebbero prendere di mira le proprietà oncogeniche autonome non cellulari di TRF2, abbiamo esaminato l'infiltrazione e l'attivazione delle cellule immunitarie, nonché l'angiogenesi nei tumori trattati. Abbiamo trattato le cellule BJ-HELTRas standard e TRF 2- con sovraesprimono (Figura S3A) con 1 uM di AD, 10 uM di AR o DMSO per 48 h prima della loro iniezione sottocutanea con Matrigel in topi nudi. I tappi Matrigel sono stati quindi raccolti 5 giorni dopo l'iniezione per analizzare il microambiente tumorale mediante citometria a flusso (Figura 3A). Come previsto [13,21], la sovraespressione di TRF2 non ha modificato l'infiltrazione delle cellule immunitarie globali (cellule CD45 più) (Figura 3B; Figura S4A), ma ha inibito il reclutamento delle cellule natural killer (NK) (Figura 3C; Figura S4B) e la funzione NK -ality (Figura 3C-E; Figura S4C) e aumentare l'infiltrazione MDSC (Figura 3F). In TRF2-che sovraesprimono le cellule BJ-HELTRas in particolare, il trattamento con entrambi i farmaci ha aumentato l'infiltrazione immunitaria globale (Figura 3B; Figura S4A), nonché la quantità e la funzionalità delle cellule NK intratumorali (Figura 3C-E; Figura S4B,C). In particolare, entrambi i farmaci hanno completamente salvato l'inibizione della sorveglianza immunitaria mediata dalle cellule NK (CD107a plus e CD69 plus NK) indotta dalla sovraespressione di TRF2 (Figura 3C). Ciò è stato associato a una drammatica diminuzione del reclutamento di MDSC (Figura 3F; Figura S4D) e a un aumento del reclutamento di monociti e macrofagi (Figura 3G).

Come riportato in precedenza [14,20], l'angiogenesi tumorale era maggiore nei tumori con sovraespressione di TRF2- rispetto ai tumori di controllo. Sebbene la sovraespressione di TRF2 abbia aumentato la quantità di cellule endoteliali CD31 più CD45-all'interno del letto tumorale (Figura 3H; Figura S4E), non è stata rilevata alcuna differenza tra il vettore vuoto o i tumori con sovraespressione di TRF2-dopo il trattamento con entrambi i farmaci. ing TRF2 (vettore TRF2) o vettore vuoto sono stati trattati con 1 uM di alessidina-2HCl o 10 μM di AR-A014418 o DMSO 2 giorni prima dell'iniezione sottocutanea con Matrigel (1 × 10 cellule di grado) in topi nudi NMRI ( n=8). L'infiltrazione delle cellule immunitarie ed endoteliali è stata quindi valutata 5 giorni dopo l'iniezione mediante citometria a flusso. (BH). Analisi in citometria a flusso dell'infiltrazione immunitaria del tampone Matrigel. Viene mostrato il numero di cellule immunitarie che si infiltrano nei tappi Matrigel tra le cellule vive. L'infiltrazione totale di cellule immunitarie (cellule CD45 più) è mostrata in (B);l'infiltrazione di cellule natural killer(NK) (cellule NKp46 più) è mostrata in (C); L'infiltrazione di cellule NK attivate (CD107a plus e CD69 plus NK) è mostrata in (D,E); L'infiltrazione di cellule soppressori di derivazione mieloide (MDSC; CD11b più GR1 più )) è mostrata in (F); l'infiltrazione di monociti-macrofagi è mostrata in (G) e l'infiltrazione di cellule endoteliali è mostrata in (H). p I valori sono stati determinati utilizzando il Mann- Test di Whitney(*p<><><0.001;n =="" 8="" mice="" per="">

4. Discussione

Qui, riportiamo lo sviluppo di un'analisi cellulare per lo screening di composti che modulano l'espressione della proteina telomerica TRF2. Selezionando una piccola libreria di molecole approvate dalla FDA, abbiamo identificato composti che potrebbero aumentare o diminuire i livelli di espressione di TRF2. Abbiamo scoperto che AD e AR downregolavano TRF2 ed esibivano attività antitumorale specifica per le cellule tumorali che sovraesprimono TRF2. Dimostrando ulteriormente la loro attività specifica di TRF2-, il trattamento con AR e AD ha salvato l'immunosoppressione e la neo-angiogenesi conferite dalla sovraespressione di TRF2. Sorprendentemente, il fatto che l'infiltrazione immunitaria globale sia aumentata per i tumori che sovraesprimono TRF2 dopo il trattamento con AR o AD suggerisce che quei farmaci sono più potenti per migliorare la risposta immunitaria quando TRF2 è sovraespresso. Questi farmaci inibiscono l'effetto immunosoppressivo della sovraespressione di TRF2 ripristinando la funzionalità delle cellule NK (CD107a e CD69 più cellule NK) e riducono fortemente l'infiltrazione di MDSC. Ciò suggerisce che quei farmaci attenuano il programma specifico 2-dipendente da TRF che innescano la fuga immunitaria e l'immunosoppressione e possono aumentare il rilascio di molecole associate al pericolo (DAMP) che migliorano la risposta immunitaria in particolare quando TRF2 è sovraespresso. Da notare che osserviamo che AR e AD hanno salvato le funzioni immunosoppressive e pro-angiogeniche della sovraespressione di TRF2, due caratteristiche della sovraespressione di TRF2 che in precedenza abbiamo mostrato come DDR indipendente. Pertanto, abbiamo ipotizzato che gli effetti di AR e AD sulla crescita del tumore siano DDR-indipendenti, un meccanismo che deve essere completamente descritto in ulteriori studi. Il presente studio proof-of-concept fornisce la prova che la riduzione farmacologica dell'espressione di TRF2 potrebbe essere una valida strategia antitumorale

Anche se il metodo di screening considerava i livelli di proteina TRF2 indipendentemente dai livelli di trascrizione, entrambi i farmaci hanno ridotto i livelli di mRNA di TERF2 endogeno, il che implica che AR e AD mirano a più livelli di regolazione di TRF2. A sostegno di ciò, AR è un inibitore della segnalazione Wnt [28], che è un attivatore della trascrizione TERF2 [29]. Più in generale, i farmaci che prendono di mira la via di segnalazione Wnt sono stati arricchiti durante le fasi di screening (Figura S1B-D). Resta da determinare in che modo l'AD, un agente mirato ai mitocondri, influenzi l'espressione di TRF2. Poiché i tumori che mostrano livelli elevati di TRF2 hanno una prognosi sfavorevole e mostrano una maggiore resistenza alla chemioterapia [21], AR e AD sono agenti terapeutici di interesse per tali tumori. Il potenziale di disaccoppiare le attività telomeriche e pro-oncogeniche di TRF2[13] aumenta la possibilità di sottoregolare farmacologicamente TRF2 conferendo così benefici antitumorali multi-hit senza effetti collaterali deleteri pro-invecchiamento. Pertanto, sono necessari studi futuri per determinare gli effetti sinergici di questi farmaci sui livelli di espressione di TRF2 negli studi clinici.

Anche se TRF2 è sovraregolato in vari tumori umani [13,21], la sua espressione è sottoregolata durante l'invecchiamento sia normale che patologico di molti tessuti [30,31] Inoltre, diversi rapporti che coinvolgono modelli murini di disregolazione di TRF2 sottolineano l'importanza di TRF2 a livello crocevia tra invecchiamento e cancro [31-35]. Pertanto, le molecole identificate dalla procedura di screening qui descritta sono candidati farmaci interessanti, sia come agenti antitumorali per la downregulation di TRF2 come confermato in questo studio, sia potenzialmente come agenti anti-invecchiamento sovraregolando TRF2.

Questo articolo è estratto da Cancers 2021, 13, 2998. https://doi.org/10.3390/cancers13122998 https://www.mdpi.com/journal/cancers