Una prospettiva sullo sviluppo degli inibitori della chinasi N-terminale C-Jun come terapie per il morbo di Alzheimer: studio della struttura attraverso studi di docking

Astratto:

La chinasi N-terminale c-Jun (JNK) svolge un ruolo importante nella morte cellulare causata da vari stimoli. Poiché l'isoforma JNK3 è espressa principalmente nel cervello, si ritiene che svolga un ruolo fondamentale in varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (AD) e il morbo di Parkinson (PD), per le quali mancano ancora terapie plausibili. Per sviluppare un inibitore JNK3 nuovo e selettivo, abbiamo condotto una revisione decennale (dal 2011 al 2021) degli articoli pubblicati sugli inibitori JNK, in particolare quelli incentrati su una prospettiva strutturale e approfondimenti sul docking. Abbiamo osservato le strutture di tre isoforme di JNK, vale a dire olo-proteine ​​e strutture co-cristalli, con inibitori JNK3 e riassunto gli aspetti strutturali significativi degli inibitori selettivi di JNK3 come terapie per l'AD.

La malattia di Parkinson è una malattia degenerativa comune del sistema nervoso e i suoi sintomi principali includono tremori, rigidità, lentezza nei movimenti, disturbi dell'equilibrio, ecc. Tuttavia, i problemi con la funzione di memoria associati ai sintomi della malattia di Parkinson ricevono sempre maggiore attenzione.

Gli studi hanno dimostrato che la memoria dei pazienti con malattia di Parkinson viene influenzata in modo significativo durante l'esecuzione di compiti cognitivi e alcuni di loro mostrano anche disturbi delle funzioni cognitive come perdita di attenzione e ridotta sensibilità cognitiva. Ciò però non significa che le persone affette dal morbo di Parkinson non possano avere una buona memoria.

Le persone con malattia di Parkinson possono migliorare le proprie capacità di memoria attraverso la pratica e l'allenamento costante, in particolare eseguendo alcuni allenamenti ed esercizi di memoria. Questi esercizi possono aiutare le persone con malattia di Parkinson a migliorare le proprie capacità cognitive, sviluppare una fiducia in se stessi più positiva, migliorare la qualità della vita e aumentare la propria autostima.

Tra questi, alcuni semplici esercizi di memoria, tra cui molta lettura, scrittura, calcoli matematici, disegno e altre attività, possono migliorare efficacemente la capacità cognitiva dei pazienti con malattia di Parkinson e farli affrontare la vita in modo più positivo e sicuro. Inoltre, sono molto efficaci anche alcuni esercizi di memoria, tra cui la memoria della posizione, la memoria dei numeri, la memoria delle lettere, la memoria della sequenza di eventi, ecc. Questi corsi di formazione consentono alle persone affette da malattia di Parkinson di affrontare e far fronte meglio a vari problemi e di adattarsi meglio alla loro nuova situazione di vita.

Nel complesso, sebbene la malattia di Parkinson possa influenzare l'attenzione e la capacità di memoria dei pazienti, un allenamento cognitivo e un esercizio fisico adeguati possono aiutare i pazienti a migliorare la loro funzione cognitiva e aiutarli ad adattarsi meglio al loro nuovo stato di vita. Pertanto, i pazienti affetti dal morbo di Parkinson non devono aver paura dei problemi di memoria, finché affrontano la vita con un atteggiamento positivo e positivo, avranno sicuramente una vita felice e attiva. Si può vedere che dobbiamo migliorare la nostra memoria. Le Cistanche possono migliorare significativamente la memoria perché la pasta di carne è un materiale medicinale tradizionale cinese con molti effetti unici, uno dei quali è quello di migliorare la memoria. L'efficacia della carne macinata deriva da vari principi attivi, tra cui acido carbossilico, polisaccaridi, flavonoidi, ecc. Questi ingredienti possono promuovere la salute del cervello attraverso vari canali.

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Parole chiave:

Il morbo di Alzheimer; chinasi N-terminale c-Jun; inibitore della proteina chinasi a piccola molecola; JNK3; selettività.

1. Introduzione

Le proteine ​​chinasi sono state scoperte più di 65 anni fa, ma sono bersagli terapeutici da meno di 30 anni [1,2]. Il coinvolgimento delle proteina chinasi in molte malattie è stato stabilito sulla base di un gran numero di studi e tali chinasi sono state per lungo tempo un promettente gruppo bersaglio molecolare. Ci sono 518 proteine ​​chinasi conosciute codificate nel genoma umano e le proteine ​​chinasi fosforilano circa un terzo di tutte le proteine ​​[3,4]. Molti ricercatori nelle aziende farmaceutiche e nel mondo accademico hanno lavorato duramente in questo settore e, di conseguenza, 67 farmaci inibitori della chinasi a piccole molecole sono stati approvati dalla FDA statunitense nel 2021 [5].

Gleevec, un trattamento consolidato per la leucemia mieloide cronica, è stato lanciato nel 2001 dopo essere stato sviluppato da Novartis, dando inizio all’era degli inibitori della proteina chinasi. Questo trattamento sta ancora ampliando la sua gamma di applicazioni. Successivamente, nel 2011, nove inibitori della proteina chinasi a piccole molecole sono stati approvati dalla FDA statunitense e miravano esclusivamente a malattie proliferative come il cancro. Allo stesso modo, la maggior parte degli inibitori della proteina chinasi approvati finora vengono utilizzati in oncologia. Tuttavia, le proteine ​​chinasi sono coinvolte anche in molte altre malattie, tra cui malattie infiammatorie, immunologiche e cardiovascolari, nonché disturbi del sistema nervoso centrale (SNC) come il morbo di Alzheimer (AD) e il morbo di Parkinson (PD) [6]. Nel 2011, ruxolitinib, che è un inibitore di JAK1 e JAK2, è stato approvato come agente terapeutico per la mielofibrosi. Insieme a questa approvazione, la ricerca nel campo degli inibitori delle chinasi non oncologiche è diventata sempre più attiva [7]. Tra i 67 inibitori della proteina chinasi approvati dalla FDA, ci sono fino a 10 farmaci mirati a malattie esterne all’oncologia, ma non esiste ancora un farmaco inibitore della proteina chinasi per i disturbi del sistema nervoso centrale.

L'AD è stato scoperto nel 1906 e un esame post mortem ha osservato due chiari biomarcatori, vale a dire il groviglio tau e la placca amiloide-beta (A), ma a partire dal 2021 non è stato ancora identificato un chiaro obiettivo terapeutico. Con il rapido invecchiamento della popolazione globale, le malattie neurodegenerative come l’AD sono diventate un importante problema sociale e hanno un impatto significativo non solo sui pazienti ma anche su altri individui attorno ai pazienti [8,9]. Poiché gli inibitori della proteina chinasi di piccole dimensioni vengono utilizzati per un'ampia gamma di malattie, i bersagli molecolari hanno attirato un'attenzione significativa nell'area dei disturbi del sistema nervoso centrale. Tra molte potenziali chinasi proteiche del sistema nervoso centrale, abbiamo selezionato la chinasi N-terminale c-Jun (JNK), un membro della famiglia delle chinasi proteiche attivate dal mitogeno. I JNK fosforilano molteplici fattori trascrizionali correlati all’apoptosi, tra cui c-Jun, ATF, APP e tau, e inducono l’apoptosi cellulare [10].

I JNK rispondono a vari stimoli come citochine, neurotossine, stress ossidativo e acidi grassi. Quando gli stimoli raggiungono per la prima volta la membrana cellulare, i segnali vengono trasferiti alla proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPKKK), MAPKK4 e MAPKK7 attraverso la fosforilazione. Successivamente, MAPKK4 e MAPKK7 attivati ​​fosforilano JNK in due siti diversi, e il JNK fosforilato quindi fosforila il terminale N di c-Jun per indurre un segnale apoptotico [11]. Inoltre, JNK fosforila direttamente le proteine ​​apoptotiche come BIM e BMF e le attiva per attivare le caspasi [12]. Nel complesso, i JNK sono fortemente coinvolti nei processi fisiologici dell'apoptosi. Esistono tre diversi geni JNK umani, vale a dire jnk1, jnk2 e jnk3 che codificano 10 diversi splices di varianti JNK (4 JNK1/2 omozigoti e 2 JNK3 omologhi), di cui JNK1 e JNK2 sono i più ampiamente espressi (Figura 1).

A differenza di JNK1 e JNK2, JNK3 è espresso principalmente nel cervello e solo una piccola parte è espressa nel cuore e nei testicoli. JNK3 è stato considerato un potenziale bersaglio terapeutico per le malattie neurodegenerative associate alla morte delle cellule neuronali. Quando c-Jun viene fosforilato da JNK3, facilita anche la maturazione del groviglio tau. Inoltre, è noto che JNK3 fosforila direttamente le proteine ​​tau, portando alla formazione di grovigli tau.

Anche un altro biomarcatore della patologia dell'AD, vale a dire l'amiloide-beta, è correlato a JNK3. JNK3 fosforila la proteina precursore dell'amiloide (APP) a T688, provocando l'endocitosi dell'APP, che è nota per essere il passaggio più importante nell'intero processo di formazione della beta-amiloide [13].

Il meccanismo alla base dell'apoptosi indotta dalla placca A rimane poco chiaro. Le placche A inducono la fosforilazione della proteina chinasi attivata da AMP (AMPK) e l'AMPK attivato fosforila TSC2 e Raptor in S1387 e S792. Questo processo inibisce la via mTOR e il sistema di salvataggio cellulare rappresentativo e induce un blocco traslazionale che impedisce l'espressione proteica [14]. Questo fenomeno induce un diffuso stress ossidativo del reticolo endoplasmatico, che è accompagnato da una risposta proteica spiegata che induce reazioni secondarie come la risposta infiammatoria, che riattiva JNK3. Un altro motivo per prevedere che la morte delle cellule neuronali diminuirà nel cervello dei pazienti con AD quando JNK3 è inibito è che anche la morte delle cellule neuronali e il declino cognitivo sono stati ridotti in un modello murino FAD knock-out per JNK3 [15] (vedere Figura 2).

2. Stato di sviluppo attuale degli inibitori JNK

2.1. Inibitori Pan-JNK

SP600125 (Figura 3) è il primo inibitore pan-JNK noto con valori IC50 di 90, 40 e 40 nM rispettivamente per JNK3, JNK2 e JNK1. Questo composto è stato il primo inibitore di JNK studiato e la comprensione della via di segnalazione intracellulare di JNK è stata ampliata. Inizialmente, è stato sviluppato utilizzando cellule tumorali come indicatori di morte cellulare per apoptosi, ma in seguito questo composto ha mostrato un effetto neuroprotettivo nei modelli animali di PD indotti da MPTP. Ha anche ridotto l’entanglement neurofibrillare e le placche A nei modelli animali di AD [16-18]. La potenza e la selettività di SP600125 non hanno portato allo sviluppo di un farmaco, ma è un composto che ha portato molti scienziati a considerare JNK un bersaglio farmacologico attraente.

AS602801 (Figura 3) è un inibitore pan-JNK attivo per via orale. Valori IC50 di 230, 90 e 80 nM sono mostrati rispettivamente per JNK3, JNK2 e JNK1. Ha dimostrato un effetto significativo sull’endometriosi quando è stato utilizzato in terapia di combinazione con ormoni o come monoterapia in modelli di babbuini e roditori. Sebbene AS602801 non sia un inibitore selettivo, si è tentato di colpire le malattie immuno-correlate con il trattamento con AS602801, a differenza di SP600125. Questo composto è entrato negli studi clinici di fase II nel 2012 con l'indicazione dell'endometriosi [19,20].

Tanzisertib (Figura 3) è il terzo inibitore pan-JNK attivo per via orale, con valori IC50 di 6, 7 e 61 nM rispettivamente per JNK3, JNK2 e JNK1. Tanzisertib si è dimostrato efficace in esperimenti su animali utilizzando un modello di fibrosi polmonare indotta da bleomicina come malattia bersaglio per la fibrosi polmonare idiopatica. Gli esperimenti hanno anche dimostrato che riduce la produzione di TNF in un modello PK-PD di produzione acuta di TNF indotta da LPS nel ratto. È entrato negli studi clinici di fase II con fibrosi polmonare idiopatica come indicazione, ma gli studi sono stati interrotti per ragioni sconosciute [21].

2.2. Inibitori selettivi di JNK

Il composto 1 (Figura 4) è un inibitore selettivo di JNK3 con livelli di attività di<1 nM for JNK3, 210 nM for JNK2, and 518 nM for JNK1. Unlike the pan-JNK inhibitors, it is characterized by isoform selectivity toward JNK3, which is mainly expressed in the brain. Therefore, it was developed to target Parkinson's disease [22]. Compound 2 (Figure 4) was synthesized from compound 1. It has a thiophenyl pyrazolone scaffold and selectivity for other kinases, as well as JNK1 and JNK2 isoforms. Its activity on JNK3 has an IC50 of 35 nM, and it exhibits a much better DMPK profile in vivo compared to previously reported JNK3 inhibitors (1 in Figure 4). It has also been demonstrated that this compound could be an orally available and blood-brain barrier (BBB)-penetrable [23].

Il composto 3 (Figura 4) è stato scoperto attraverso lo screening virtuale basato su una struttura multistadio. Presenta un IC50 da 40 nM per JNK3 e una selettività dell'isoforma 2500- volte superiore rispetto a JNK1 e JNK2, nonché un buon profilo di selettività per 398 chinasi. Mostra anche una maggiore attività neuroprotettiva contro la tossicità cellulare indotta da A nelle cellule SH-SY5Y rispetto a LiCl, che è un potenziale agente terapeutico per l'AD in vitro. Studi su animali utilizzando topi hanno rivelato un aumento delle capacità di apprendimento e memoria e studi dei meccanismi sottostanti hanno rivelato che questo composto può ridurre significativamente la diffusione delle placche fibrillare A attraverso l'inibizione di JNK in seguito alla ridotta fosforilazione delle proteine ​​APP e tau nella corteccia e nell'ippocampo. [24].

Il composto 4 (Figura 4) è un inibitore selettivo JNK2- e JNK3- con valori IC50 di 16 nM per JNK3, 97 nM per JNK2 e 420 nM per JNK1. La selettività dell'isoforma JNK2 non è stata raggiunta, ma il composto ha mostrato un'elevata selettività rispetto ad altre famiglie MAPK e isoforme JNK1. Come inibitore di JNK3 per le terapie delle malattie neurodegenerative, questo composto ha mostrato una permeabilità BBB favorevole [25].

3. Analisi prospettica strutturale del sito attivo di JNK

3.1. Sovrapposizione di strutture cristalline JNK1, JNK2 e JNK3

Per confrontare le strutture di JNK1 e JNK3, il composto 3 è stato ancorato in JNK3 (ID della banca dati delle proteine ​​(PDB): 4WHZ). Il componente indoli-2-one si trova nella regione della cerniera e interagisce con l'idrogeno di NH e l'ossigeno carbonilico nella spina dorsale di Met149. L'azoto del tiazol-4-one forma un legame idrogeno con Lys93 attraverso il ponte idrico e il gruppo 2-clorofenile è sepolto nella tasca idrofobica costituita da Ile124, Leu126, Leu144, Val145, Met146, e Leu206, che si trova sul retro del sito attivo oltre il residuo gatekeeper Met146. Met146 interagisce con un anello aromatico (nel composto 3, il gruppo 2-clorofenile) in JNK3.

Quando la posa agganciata del composto 3 con JNK3 è stata sovrapposta alle strutture cristalline di JNK1 (ID PDB: 3PZE, 2XRW, 4QTD, 3ELJ, 4AWI e 4L7F) (Figura 5), ​​sembrava che ogni residuo Met108 nelle strutture JNK1 osservate potrebbe entrare in conflitto con il gruppo 2-clorofenile che occupa la tasca di selettività, in contrasto con la metionina146 di JNK3 [26]. Questo conflitto di metionina potrebbe spiegare la selettività del composto 3 per JNK3 rispetto a JNK1.

Per determinare come agisce il residuo gatekeeper metionina108 nel sito attivo di JNK2, la posa ancorata del composto 3 è stata sovrapposta a tre strutture cristalline pubblicate di JNK2 (ID PDB: 3E7O, 7CML e 3NPC) (Figura 6). Sebbene Met108 in 3E7O sia in conflitto con il gruppo 2-clorofenile che occupa la tasca di selettività, Met108 di 7CML e 3NPC interagisce con il gruppo 2-clorofenile attraverso interazioni zolfo-pi, simile a Met146 in il sito attivo di JNK3 [32]. O le due strutture che formano le interazioni zolfo-pi sono oloenzimi senza ligandi co-cristallizzati, oppure i ligandi co-cristallizzati hanno già anelli aromatici che occupano la tasca di selettività. Nella struttura cristallina del composto 4, che ha selettività isoforma solo per JNK1, la porzione naftalene ha un'interazione zolfo-pi con il residuo Met146 di JNK3 e l'IC50 di JNK2 è 97 nM, che è un livello di attività ragionevole. Nel caso di alisertib, considerando la struttura cristallina di alisertib su JNK3 (non mostrata), il gruppo trifluorofenile occupa la tasca di selettività e interagisce con Met146, ma l'attività di JNK2 è quasi uguale a quella di JNK3. Combinando queste osservazioni, abbiamo concluso che il composto 4 induce il residuo gatekeeper Met108 di JNK2 a muoversi sufficientemente da formare una tasca idrofobica simile a quella di JNK3.

Il comportamento del residuo gatekeeper Metionina146 nel sito attivo di JNK3 è stato osservato utilizzando lo stesso metodo descritto sopra (Figura 7). I gruppi Met146 nelle quattro strutture cristalline di JNK3 (ID PDB: 4WHZ, 4W4W, 3OY1, 7KSI) mostrano interazioni zolfo-pi con i gruppi 2-cloro-fenile, escluse due strutture cristalline (ID PDB: 6EMH, 6EQ9 ) in cui i ligandi co-cristallizzati non occupano la tasca idrofobica [26–32]. Il movimento indotto dal composto dei residui di metionina nella struttura JNK2 e la formazione di una tasca idrofobica sono più comuni nelle strutture JNK3. Questa tendenza potrebbe spiegare la selettività isoforme dei JNK. Nessuno dei residui Met108 nelle strutture cristalline osservate di JNK1 si muove sufficientemente per formare una tasca idrofobica, ma nelle strutture cristalline di JNK2 e JNK3, i residui di metionina si muovono sufficientemente per creare tasche idrofobiche con gli inibitori. Pertanto, la selettività per JNK1 può essere ottenuta attraverso l'occupazione della tasca idrofobica, ma la selettività di JNK2 richiede ulteriori spiegazioni.

3.2. Residui diversi tra JNK1 e JNK3

Per studiare i residui che compongono il sito attivo di JNK3, abbiamo osservato le sequenze di residui da 45 a 400 di JNK3 e abbiamo scoperto che il residuo Leu144 esiste nel sito attivo come elemento nella tasca di selettività. Il Leu144 forma interazioni idrofobiche con l'anello naftalene del composto 4 nella struttura cristallina di JNK3 (ID PDB: 3OY1) (Figura 8a). Tuttavia, quando la struttura cristallina di JNK1 (ID PDB: 3PZE) è sovrapposta al ligando co-cristallizzato di 3OY1 (Figura 8b), Ile106 esiste al posto del residuo Leu144 nella stessa posizione ed è in conflitto con l'anello naftalene del composto 4 [37]. La distanza tra Leu144 nella struttura cristallina di JNK3 e l'anello naftalenico è mantenuta a 3,53 Å, ma Ile106 della struttura cristallina di JNK1 provoca un cattivo contatto con l'anello naftalene perché è troppo vicina ad una distanza di 2,26 Å. Poiché JNK2 ha anche Leu144 nella stessa posizione di JNK3, possiamo concludere che occupare la sacca di selettività non è una condizione assoluta per ottenere la selettività per JNK1 e JNK2.

4. Gruppi funzionali in ciascun composto che contribuiscono alla selettività delle isoforme

Per determinare gli indizi strutturali per il composto inibitore selettivo 1 nella modalità di legame, abbiamo analizzato in dettaglio il complesso co-cristallino del composto 1-JNK3 (Figura 9). Una coppia di legami idrogeno si forma nella regione cerniera Met149, il gruppo NH della benzammide agisce come donatore di legami idrogeno e l'azoto 2-nell'anello pirazolico agisce come accettore di legami idrogeno. Un altro legame idrogeno si forma tra il gruppo urea e Lys93 attraverso un ponte d'acqua, e il gruppo 2-clorofenile si trova in profondità nella tasca idrofobica, formando un'interazione zolfo-pi con il residuo gatekeeper Met146. L'introduzione del cloruro orto-sostituito sembra essere importante in termini di selettività perché cambia l'angolo dei due anelli in termini di conformazione e fa sì che il gruppo fenilico si adatti alla tasca di selettività [22]. La pirrolidina protonata nell'area di esposizione al solvente forma un legame idrogeno con Asn89 nella parte superiore del sito attivo. Il composto 1 mostra una selettività 210-piegata per JNK3 rispetto a JNK2, che è molto più elevata di quella degli altri inibitori selettivi di JNK3 esaminati. Il legame idrogeno tra pirrolidina e Asn89 è la spiegazione più ragionevole per questo fenomeno.

Un'osservazione simile è stata fatta per la struttura co-cristallina del composto 2-JNK3 (Figura 10). Il composto 2 ha anche due legami idrogeno con Met149 nella regione della cerniera, formato dal gruppo NH dell'ammide e dall'azoto 2- dell'anello pirazolico. Un ulteriore legame idrogeno è stato trovato nella porzione urea con Lys93 attraverso il ponte idrico. Il gruppo 2-clorofenile connesso all'urea ha mostrato un'interazione zolfo-pi con il residuo gatekeeper Met146 all'interno della tasca di selettività e la sostituzione dell'ortocloruro ha reso questa interazione più favorevole. Tutte queste interazioni erano molto simili alla relazione del composto 1 con JNK3. L'unica differenza rispetto alla modalità di legame del composto 1 era la perdita di legami idrogeno nel componente esposto al solvente, che sembra essere la ragione del cambiamento nell'attività di JNK3 (da<1 nM to 35 nM) and the decrease in selectivity compared to JNK2 (from 210- to 39-fold) [23]. However, compound 2 showed a superior pharmacokinetic profile in vivo compared to compound 1. Regardless, we believe that it is advantageous to maintain the hydrogen bond donor property in the solvent exposure component for the future design of selective JNK3 inhibitors.

La modalità di legame del composto 3 è stata esaminata per esplorare la logica per cui il composto 3 mostra una selettività 2500-piegata rispetto a JNK2 (Figura 11). Una struttura co-cristallina non era disponibile per il composto 3 e abbiamo monitorato la modalità di legame attraverso simulazioni di docking. Come mostrato nella Figura 5, il componente dell'indolina-2-one si trova nella regione della cerniera, dove sono presenti due legami idrogeno con Met149, un legame idrogeno con Lys93 attraverso il ponte idrico e l'interazione idrofobica del {{11 }}gruppo cloro-fenile [24]. Oltre a queste interazioni, abbiamo scoperto che il 5-fluoro dell'indolina-2-interagisce strettamente con i residui Asn152 e Gln155 (distanze di 4,69 Å e 3,41 Å, rispettivamente) attraverso il legame F. Queste interazioni sono chiare in base alle differenze di attività con e senza sostituzione del fluoro. Inoltre, la catena laterale di Asn152 mostra un'interazione dipolare con il gruppo carbonilico del tiazol-4-one. Sia il legame F che le interazioni dipolo potrebbero spiegare l'elevata selettività del composto 3 per JNK2.

In contrasto con la selettività del composto 3, abbiamo esaminato la bassa selettività del composto 4 per identificare la sua modalità di legame (Figura 12). Ha due legami idrogeno nella regione cerniera e il gruppo carbonilico del triazolo-3-forma direttamente un legame idrogeno con Lys93, a differenza dei composti precedenti. L'anello naftalenico entra nella tasca di selettività per formare interazioni idrofobiche e zolfo-pi con i residui sopra descritti [25]. Sebbene il gruppo cicloesano sia stato sostituito nel componente di esposizione al solvente, non sono state osservate ulteriori interazioni. In conclusione, i composti con selettività per JNK2 mostrano comunemente interazioni aggiuntive sotto forma di legami idrogeno, legami F o interazioni dipolo nell'esposizione al solvente.

5. Conclusioni

Le malattie neurodegenerative come l’AD stanno diventando problemi sociali sempre più critici a causa del rapido invecchiamento della popolazione globale. L’AD è una malattia con enormi bisogni terapeutici insoddisfatti che richiedono nuovi bersagli molecolari terapeutici. Per quanto riguarda i nuovi bersagli terapeutici, abbiamo studiato la c-Jun N-terminal-chinasi 3, che è una proteina chinasi fondamentale nel processo apoptotico neuronale. JNK svolge un ruolo importante nel processo apoptotico al terminale della via MAPK e l'isoforma JNK3 è espressa principalmente nel cervello. Pertanto, è considerato un bersaglio per le malattie neurodegenerative, in cui l'apoptosi neuronale è un evento chiave. Inoltre, poiché JNK3 appare ripetutamente in diversi percorsi patologici dell'AD, lo abbiamo considerato un bersaglio promettente per superare questa malattia.

Pertanto, è stato assemblato un elenco completo degli attuali inibitori pan-JNK e degli inibitori selettivi di JNK3 e sono state esaminate le loro modalità di legame. Gli inibitori selettivi di JNK3 occupano comunemente una regione idrofobica (Ile124, Leu126, Leu144, Val145, Met146 e Leu206) chiamata tasca di selettività introducendo un anello aromatico nell'inibitore di JNK3 in modo che possa entrare nella tasca idrofobica in profondità nel sito attivo di JNK3 . La selettività per l'isoforma JNK1 è stata ottenuta consentendo interazioni idrofobiche e interazioni zolfo-pi. Sei strutture cristalline JNK1, tre JNK2 e sei JNK3 sono state selezionate in base alle loro risoluzioni per confrontare i movimenti indotti dal ligando dei residui Met del gatekeeper. In ciascuno dei sei co-cristalli JNK1, la metionina entrava in collisione con l'anello aromatico nell'inibitore selettivo JNK3 e nessuno dei ligandi co-cristallizzati poteva adattarsi alla tasca idrofobica. La collisione della metionina gatekeeper con l'anello aromatico è stata osservata anche nel co-cristallo di JNK2, ma se il ligando co-cristallizzato occupa la regione idrofobica, allora la metionina di JNK2 viene indotta dal ligando e si può formare una tasca.

Tra le sei strutture co-cristalline inibitore-JNK3 osservate, c'erano più casi con ligandi che occupavano la tasca idrofobica che governa questa selettività. Quattro ligandi cocristallizzati occupavano la tasca idrofobica e due non occupavano la tasca idrofobica. Sebbene siano stati osservati diversi livelli di occupazione a seconda della forma dei quattro ligandi, tutte le metionine formavano una tasca idrofobica.

Come spiegazione supplementare per i residui che compongono la tasca idrofobica in profondità nel sito attivo, esiste una differenza tra il Leu di JNK3 e l'Ile di JNK1. A differenza del relativamente corto Leu, il residuo Ile di JNK1 impedisce agli anelli aromatici medio-grandi di entrare nella tasca idrofobica.

Poiché il residuo di leucina si trova nella tasca idrofobica di JNK2 e JNK3, l'anello aromatico nella regione idrofobica non ha un impatto significativo sulla selettività su JNK2. Secondo questi risultati, si può vedere che sono necessari elementi aggiuntivi per ottenere la selettività isoformale per JNK2, e si può comprendere che non ci sono ancora molti inibitori che hanno superato questo ostacolo.
Per quanto riguarda le strutture degli inibitori selettivi di JNK3 che sono anche selettivi per JNK2, è stato osservato che tutti mostrano un legame aggiuntivo nella porzione esposta al solvente. Un inibitore selettivo di JNK3, vale a dire il composto 1 (Figura 9), forma un legame H tra pirrolidina protonata e Asn89, e un altro inibitore selettivo di JNK3, vale a dire il composto 3, forma anche un legame F tra il fluoro sostituito nell'indolina{{11 }}un gruppo e Asn152/Gln155. Questi legami sono tutte interazioni aggiuntive nell'area di esposizione al solvente. Inoltre, il gruppo carbonilico del tiazolo-4-uno nel composto 3 era vicino al residuo Asn152, previsto come interazione dipolare.

Una volta raggiunta la selettività delle isoforme, ci sono ancora molti ostacoli da superare. Innanzitutto, a causa delle somiglianze delle tasche di legame dell'ATP prese di mira dalla maggior parte degli inibitori della proteina chinasi, si dovrebbe ottenere preferenzialmente una selettività generale su un kinome proteico diverso da JNK1/2. In secondo luogo, sarà necessaria un’elevata potenza perché la concentrazione corporea delle sostanze terapeutiche deve competere con l’ATP, che è presente nell’ordine dei millimolari nelle cellule. In terzo luogo, sarà necessaria la penetrazione della BBB senza la generazione di importanti effetti collaterali, che è la sfida più difficile poiché l’AD, la malattia che stiamo cercando di sconfiggere, è una malattia cronica e sono necessarie terapie per il trattamento a lungo termine. Pertanto, nelle indicazioni con un periodo di dosaggio così lungo, un ampio profilo di sicurezza diventa una questione molto importante. Sebbene lo sviluppo degli inibitori di JNK3 come trattamento per le malattie neurodegenerative non abbia ancora avuto successo, sta diventando chiaro che JNK3 è un bersaglio terapeutico promettente.

JNK3 sta attirando sempre più attenzione come bersaglio terapeutico per l'AD. Queste caratteristiche dovrebbero essere prese in considerazione nella progettazione di nuovi inibitori JNK3, che potrebbero facilitare a breve lo sviluppo di inibitori JNK3 potenti e selettivi come terapie per l'AD.

Finanziamento:

Questa ricerca è stata finanziata dalle sovvenzioni della National Research Foundation of Korea NRF-2020R1A6A1A03042854 (Center for Proteinopathy) e NRF-2021R1A2C2007159 (J.-M. Hah).

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale:

Non applicabile.
Dichiarazione di consenso informato:

Non applicabile.

Conflitto di interessi:

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Riferimenti

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