Un modello transgenico rivela il ruolo del Klotho nello sviluppo del cancro al pancreas e apre la strada a una nuova terapia basata sul Klotho

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Riassunto semplice:Abbiamo mirato a studiare il ruolo della proteina antietà klotho e della sua isoforma secreta, nel Regno Unito, nel cancro del pancreas. Tre modelli in vivo, tra cui un nuovo modello genetico murino e analisi bioinformatiche, hanno indicato il klotho come soppressore tumorale nell'adenocarcinoma duttale pancreatico e hanno svelato un pattern unico di ipermetilazione del DNA del klotho nei tumori del pancreas. Questi risultati possiedono un valore prognostico significativo e suggeriscono inoltre che potrebbe fungere da agente terapeutico per l'adenocarcinoma duttale pancreatico.

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Riassunto: il Klotho è una proteina transmembrana antietà, che può essere eliminata e può funzionare come un ormone. I dati accumulati indicano che il klotho è un oncosoppressore in un'ampia gamma di neoplasie maligne e designano il sottodominio KL1 come regione attiva della proteina per questa attività. Abbiamo mirato a studiare il ruolo del klotho come soppressore del tumore nell'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC). Le analisi bioinformatiche dei set di dati The Cancer Genome Atlas (TCGA) hanno rivelato una correlazione tra la sopravvivenza dei pazienti con PDAC, i livelli di espressione di klotho e la metilazione del DNA e hanno dimostrato un modello di ipermetilazione unico del klotho nei tumori del pancreas. Gli effetti in vivo di klotho e KL1 sono stati esaminati utilizzando tre modelli murini. Impiegando un nuovo modello genetico, combinando il knockdown del klotho pancreatico con una mutazione nel Kras, la mancanza di klotho ha contribuito alla generazione di PDAC e alla diminuzione della sopravvivenza del topo. In un modello di xenotrapianto, la somministrazione di particelle virali che trasportano il cielo, un'isoforma di klotho giuntata contenente il dominio KL1, ha inibito i tumori del pancreas.comprare cistancheInfine, il trattamento con cielo solubile ha prolungato la sopravvivenza di Pdx1-Cre; KrasG12D/ più ; Topi Trp53R172H/ plus (KPC), è noto che un modello ricapitola il PDAC umano.bioflavonoidi,In conclusione, questo studio fornisce la prova che il klotho è un oncosoppressore nel PDAC. Inoltre, questi dati suggeriscono che i livelli di espressione di klotho e metilazione del DNA potrebbero avere un valore prognostico nei pazienti con PDAC e che la somministrazione di sKL esogena può servire come una nuova strategia terapeutica per il trattamento del PDAC.

Parole chiave:cloto; KL1; sKL; soppressore del tumore; tumore del pancreas; PDAC

1. Introduzione

Il cancro al pancreas è tra i tumori più aggressivi, con un tasso di sopravvivenza 5-anno del 9 percento . L'incidenza e la mortalità sono in aumento, con 60.430 nuovi casi e 48.220 decessi previsti nel 2021 solo negli Stati Uniti[1]. L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) rappresenta il 85-90 percento di tutte le neoplasie pancreatiche maligne. I modelli attuali indicano il suo sviluppo da neoplasia intraepiteliale pancreatica benigna (PanlN)1-3 a carcinoma invasivo, insieme all'acquisizione di mutazioni genetiche. L'attivazione di Kras è considerata il primo passo verso la malignità [2] e, nei modelli murini, porta allo sviluppo di PanIN entro 9 mesi [3]. Sebbene il PDAC manifesto in questi topi sia raro, nel modello KPC, che combina la mutazione di Kras con la perdita del soppressore tumorale p53 [4], il PDAC di solito si sviluppa entro 3-6 mesi di età [5].

Cistanche può antietà

Klotho (qui usato come klotho) è una proteina transmembrana di tipo I coinvolta nella regolazione dell'invecchiamento [6]. Nei topi, la carenza di klotho porta a una sindrome simile all'invecchiamento accelerato, mentre la sovraespressione di klotho estende la durata della vita [7,8]. La regione extracellulare del klotho è composta da due domini omologhi, KL1 e KL2, che possono essere scissi dalla membrana e agire come ormoni circolanti [9-11]. Viene secreta una seconda isoforma di klotho impiombata in modo differenziato (Regno Unito). Il cielo è identico a KL1, più 15 amminoacidi aggiuntivi al C-terminale. Sono state descritte diverse attività del klotho, inclusa l'attivazione della segnalazione del fattore di crescita dei fibroblasti (FGF)23 [12,13], la regolazione del canale del calcio del membro della sottofamiglia V del canale cationico potenziale del recettore transitorio (TRPV)5 [14,15] e l'inibizione di le vie dell'insulina e del fattore di crescita insulino-simile (IGF)-1 [8,16,17].

Il klotho è espresso prevalentemente nei reni e nel cervello, ma anche in vari tessuti, inclusi il pancreas esocrino ed endocrino [7,17-20]. Le sue attività fisiologiche nel pancreas devono ancora essere determinate; tuttavia, ci sono prove del suo coinvolgimento nella regolazione dell'omeostasi del glucosio. Klotho induce la produzione e la secrezione di insulina in vitro e in vivo, attenua la sensibilità all'insulina nei topi ed è esaurito nelle isole pancreatiche dei pazienti con diabete mellito di tipo 2 (DM2) [8,{5}}]. Il klotho è un potente oncosoppressore in numerose neoplasie maligne, inclusi i tumori gastrointestinali [16,17,23-30]. È silenziato epigeneticamente nel cancro e sia klotho che Karl riducono la crescita delle cellule tumorali in vitro e in vivo [16,17,23,25,26,28,31-33]. Nel cancro del pancreas, la downregulation di klotho è correlata alla sopravvivenza del paziente. In vitro, il klotho riduce la crescita delle cellule tumorali del pancreas e inibisce le vie IGF-I e bFGF[17,34].

In questo studio, abbiamo mirato a decifrare il ruolo del klotho come soppressore del tumore nel PDAC utilizzando tre modelli in vivo. Impiegando un nuovo modello genetico, abbiamo dimostrato che il knockdown del klotho pancreatico ha contribuito allo sviluppo del PDAC e ha ridotto la sopravvivenza dei topi mutanti di Kras. In un secondo modello, abbiamo dimostrato che la somministrazione di particelle virali che trasportano sKL ha inibito i tumori del pancreas in un modello di xenotrapianto. Infine, il trattamento con cielo ricombinante solubile ha prolungato la sopravvivenza dei topi KPC. Questi risultati manifestano il ruolo del koto come attore importante nello sviluppo del PDAC e suggeriscono il klotho come strategia terapeutica per il trattamento dei pazienti con PDAC.

2. Materiali e metodi

2.1. Analisi TCGA utilizzando UCSC Xena Browser

I set di dati di espressione genica RNAseg (IlluminaHiSeq) e metilazione del DNA (Methylation450k) per la coorte The Cancer Genome Atlas (TCGA) Pancreatic Cancer (PAAD) sono stati studiati utilizzando il browser Xena dell'Università della California Santa Cruz (UCSC) (http://xena.ucscedu/, consultato il 19 luglio 2020)[35].cistanciaUtilizzando il browser Xena, la sopravvivenza globale e l'intervallo libero da progressione dei pazienti con cancro del pancreas sono stati analizzati in base alle espressioni di klotho o alla metilazione del DNA di KLOTHO e sono stati creati grafici di Kaplan-Meier. I dati individuali duplicati sono stati rimossi filtrando solo i tumori primari. I dati sull'espressione genica, forniti in unità log2(x più 1), sono stati divisi in due gruppi in base alla mediana; I dati sulla metilazione del DNA sono stati divisi in due gruppi in base ai quartili inferiore e superiore.

Per la metilazione del DNA di KLOTHO sito-specifica, sono stati ulteriormente analizzati campioni con livelli bassi o alti di espressione di klotho, definiti rispettivamente dai quartili inferiori o superiori. Sono stati calcolati i valori 36] per ciascun sito di metilazione ed è stata esaminata la correlazione con l'espressione di klotho nel campione corrispondente tramite il coefficiente di correlazione di Pearson (r).

2.2. Sostanze chimiche, anticorpi e costrutti

Le sostanze chimiche utilizzate in questo studio includevano la variante solubile della giunzione umana klotho, comprendente amminoacidi34-549(dominio sci; numero di accesso BAA24941.1), con una sequenza unica di 15-amminoacidi al C-terminale({ {6}}; PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ, USA); glucosio （Floris, Misgav, Israele）, insulina umana （Actrapid; Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Danimarca) e luciferina (122799; PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

Gli anticorpi utilizzati in questo studio includevano il controllo dell'isotipo IgG2a di ratto (02-9688; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) e l'anti{2}} actina (A5441; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) . Gli anticorpi anti-klotho diretti contro il dominio KL1 (KM2076) sono stati un gentile regalo di Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokyo, Giappone.

2.3.Produzione e purificazione di vettori AAV

I vettori AAV9, il vettore vuoto nullo e il cielo (contenente l'isoforma della variante di splicing klotho secreta, numero di accesso BAA24941.1) sono stati prodotti e purificati nelle strutture di livello 2 di biosicurezza dello United Mixta UAB-VHIR e della Vector Production Unit (VPU) In breve , i vettori sono stati generati utilizzando il sistema di tripla trasfezione nelle cellule HEK293. Dopo 48 h, i vettori AAV sono stati raccolti, trattati con benzonasi, purificati in un gradiente di iodixanolo e titolati usando PicoGreen [37]. L'espressione del transgene è stata guidata da un promotore di CMV, come descritto in precedenza [37].

2.4. Manutenzione degli animali

La manutenzione e gli esperimenti sui topi sono stati effettuati nel Sourasky Medical Center (Tel Aviv, Israele) e in conformità con i regolamenti e gli standard del Sourasky Medical Center Animal Care and Use Committee.

I ceppi di topo utilizzati per i modelli transgenici erano tutti su uno sfondo misto C57BL/6 e JVB/NJ. I topi Pdx1-Cre, LSL-KrasG12D/ plus e LSL-Trp53R172H/ plus t sono stati doni gentili del dottor Ziv Gil (Technion-Israel Institute of Technology di Rambam, Haifa, Israele).

2.5. Modelli di mouse Klockdowm specifici per il pancreas

Per indirizzare il knockdown di KLOTHO al pancreas del topo, sono stati generati topi portatori di alleli KLOTHO flox (KLlox), come descritto in precedenza [38].cistanche AustraliaI topi Keflex/flox sono stati incrociati con topi Pdx1-Cre, esprimendo la ricombinasi Cre controllata dal promotore di Pdxl, ottenendo così Pdx1-Cre; KL-/-topi. Il knockdown del KLOTHO pancreatico è stato confermato con immunoistochimica e livelli di mRNA, come descritto di seguito.

Per generare topi che ospitano il knockdown KLOTHO controllato dal promotore Pdxl e l'espressione di Kras mutante, i topi LSL-KrasG12D/ più [3], portando una sequenza Lox-Stop-Lox seguita da un allele Kras mutante, sono stati incrociati con topi KLflox/flox. Questi topi sono stati ulteriormente incrociati con topi Pdx1-Cre, ottenendo Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ più topi. LSL-KrasG12D/ plus sono stati anche incrociati con topi Pdx1-Cre separatamente e questo Pdx1-Cre; Come controllo sono stati usati topi KrasG12D/plus. I topi sono stati esaminati quotidianamente per rilevare segni di sofferenza, inclusi respiro affannoso, importanti variazioni di peso e tumori di grandi dimensioni (più di 1 cm), e quelli che soddisfacevano i criteri stabiliti dal comitato etico sono stati sacrificati. I topi sono stati monitorati per la sopravvivenza, con la morte definita spontaneamente o da segni che richiedevano il sacrificio. A causa della rapida digestione del tessuto pancreatico da parte dei fluidi pancreatici, abbiamo potuto esaminare solo il pancreas dei topi che erano stati sacrificati. I tessuti sono stati raccolti e mantenuti in formaldeide per 24 ore, che è stata poi sostituita con etanolo al 70%.

2.6. Studi sullo xenotrapianto del tumore dei topi

Topi femmine nudi atimici (sfondo BALB/c), di {{0}} settimane di età, sono stati acquistati da Envigo RMS (Gerusalemme, Israele). I topi sono stati alloggiati e mantenuti in cabine a flusso laminare in specifiche condizioni prive di agenti patogeni. Il primo giorno dell'esperimento, le cellule MIA PaCa-2 che esprimono stabilmente m-Cherry/luciferasi sono state inoculate per via sottocutanea(sc) nei loro fianchi （n=21, cellule di 1 × 10 gradi in 100 μL di 5 percentuale FCS DMEM media）. Dieci giorni dopo l'inoculazione del tumore, una dose elevata (5 × 1011 GC/mL, n{11}}) o una dose bassa (5 × 1010 GC/mL, n=6) di AAV umano è stata iniettata per via intramuscolare (im).AAV-null è servito come controllo (5×1010 GC/mL, n=8). I tumori sono stati misurati con un calibro digitale tre volte a settimana e il volume è stato calcolato con la formula di calcolo del volume dell'ellissoide (0,5 × lunghezza × larghezza2). Il giorno 20 dell'esperimento, i tumori sono stati valutati in vivo monitorando l'attività della luciferasi delle cellule MIA PaCa-2 mediante iniezione di 150 ug/mL di luciferina per via intraperitoneale e l'intensità della luciferasi è stata misurata mediante Biospase.

Lo stesso giorno, l'esperimento è terminato e i topi sono stati soppressi. I tumori sono stati rimossi, pesati e misurati con un calibro digitale. Il sangue è stato raccolto prima dell'eutanasia e i livelli di klotho umano sono stati misurati nel siero utilizzando ELISA (IBL, Minneapolis, MN, USA). Cinquanta microlitri di siero per campione (in duplicato) sono stati utilizzati per l'ELISA e il test è stato condotto secondo le istruzioni del produttore. La correlazione tra il peso dei tumori e i livelli ematici di klotho umano è stata esaminata tramite il coefficiente di correlazione di Pearson.

2.7. Modelli di mouse KPC

La generazione di topi KPC è stata effettuata incrociando topi LSL-Trp53R172H/ più [5] portatori di una sequenza Lox-Stop-Lox, seguita da un allele p53 mutante puntiforme che funziona come una mutazione nulla, con topi LSL-KrasG12D/ più t. Questi sono stati ulteriormente incrociati con topi Pdx1-Cre, risultando in Pdx1-Cre; KrasG12D/ più ; Trp53R172H/ più topi. I topi sono stati abbinati in base a sesso, età e peso e sono stati assegnati in modo casuale a ricevere un trattamento con iniezioni intraperitoneali (ip) di pelle umana solubile (15 mg/kg, due volte a settimana) o controllo del veicolo (n =6 per il gruppo trattato con cielo; n =7 per il gruppo di controllo). Il trattamento è continuato per un massimo di 30 settimane. I topi sono stati esaminati quotidianamente per rilevare segni di sofferenza, inclusi respiro affannoso, importanti variazioni di peso e tumori di grandi dimensioni (più di 1 cm), e quelli che soddisfacevano i criteri stabiliti dal comitato etico sono stati sacrificati. I topi sono stati monitorati per la sopravvivenza, con la morte definita spontaneamente o da segni che richiedevano il sacrificio.

2.8. Genotipizzazione

Le code di topo sono state prelevate a 3 settimane di età per la genotipizzazione. Il DNA è stato estratto mediante incubazione della coda in una soluzione di lisi alcalina, composta da 250 μM di NaOH e 2 μM di disodio EDTA (pH 12.0), per 30-60 min a 95 gradi , seguita da neutralizzazione con 0,4 mM Tris HCL(pH 5,0). Il DNA è stato successivamente amplificato mediante PCR per i diversi genotipi, utilizzando REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israele). I primer erano a una concentrazione finale di 1000 nM. I cicli e i primer della PCR sono descritti in dettaglio nella Tabella S1. I prodotti sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di agarosio all'1,5% e colorati con bromuro di etidio.

2.9. Analisi di immunoistochimica (IHC).

I tessuti sono stati fissati in paraformaldeide al 4% e i tessuti incorporati sono stati sezionati in serie. Le sezioni sono state colorate con ematossilina ed eosina (H&E) ed esaminate al microscopio da un patologo esperto, oppure colorate con IHC, come descritto. Per klotho IHC, le sezioni fissate in formalina e incluse in paraffina, spesse 4 um, sono state decerate in xilene e reidratate. Il recupero dell'antigene è stato eseguito utilizzando un bagno caldo (95 gradi) per 20 minuti in tampone citrato pH6,0. Dopo il raffreddamento per 30 minuti, i vetrini sono stati risciacquati in tampone TBS-tritone (TBS-T).benefici di cistanceSuccessivamente, è stato eseguito il blocco della perossidasi endogena per 10 minuti in H, O/metanolo al 3%. Dopo il risciacquo in TBS-T, le sezioni sono state bloccate per 30 minuti utilizzando BSA al 5% in TBS-T e successivamente sono state incubate per una notte con l'anticorpo primario klotho a 4 gradi. Il rilevamento è stato eseguito con ZytoChem Plus (HRP) One-Step Polymer anti-Mouse/Rabbit/Rat (ZUC053; Zytomed Systems, Berlino, Germania). Rat IgG2a è servito come controllo dell'isotipo.

2.10. Reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa (RT-PCR)

Pancreata da Pdxl-Cre sacrificata; I topi di controllo KL-/- e KLflox/flox sono stati asportati, congelati in azoto liquido e conservati a -80 gradi . Dopo l'omogeneizzazione del pancreata, l'RNA totale è stato preparato utilizzando il kit di isolamento dell'RNA (Sigma) e trascritto inverso utilizzando JScript cDNA SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, USA). Il cDNA è stato amplificato per klotho e -actina (come controllo di caricamento) utilizzando REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma). La PCR è stata ottimizzata a 94 gradi per 5 minuti, seguiti da cicli di 30 secondi a 94 gradi, gli anni '90 a 52,5 gradi e 20 secondi a 72 gradi (45 cicli per klotho, 25 cicli per -actina) e 10 minuti a 72 gradi per l'estensione, utilizzando primer klotho da 12,5 pmol (F,5-ACGTTCAAGTGGACACTACTCT-3'e R,5'-TTCTTIGGCTACACACCCCGTC-3') e primer da 5 pmol-actina (F,5' -TGTTACCAACTGGGACGACA-3"e R,5'-GGGGTGTTGA AGGTCTCAAA-3). I prodotti sono stati sottoposti a elettroforesi su gel di agarosio all'1,5% colorati con bromuro di etidio. La quantificazione è stata effettuata utilizzando il software ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA.

2.11.Analisi statistica

I risultati sono presentati come media ± SD o SEM, come accennato. Le variabili continue sono state confrontate utilizzando il test t se non diversamente indicato. Tutti i test di significatività erano a due code e un valore p inferiore o uguale a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo. La correlazione è stata valutata utilizzando il coefficiente di correlazione di Pearson (r). L'analisi di sopravvivenza è stata effettuata utilizzando il log-rank test.

3. Risultati

3.1. I livelli di espressione di Klotho e metilazione del DNA nei tumori del pancreas sono correlati alla sopravvivenza dei pazienti oncologici

La coorte Cancer Genome Browser (TCGA) Pancreatic Cancer (PAAD) è stata esaminata utilizzando il browser Xena dell'Università della California Santa Cruz (UCSC)[35]. Le analisi dell'espressione genica hanno rivelato una sopravvivenza globale ridotta (OS) e un intervallo libero da progressione (PFI) per i pazienti con cancro del pancreas con tumori che esprimono un klotho basso, rispetto a quelli elevati (n=89 per ciascun gruppo; Figura 1A, B). L'esame dei dati di metilazione ha mostrato una tendenza compatibile di OS e PFI ostacolati nei pazienti che avevano tumori con livelli di metilazione del DNA di KLOTHO elevati, rispetto a bassi (n {4}} e n{5}}, rispettivamente; Figura 2A, B) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0.3) nel cancro del pancreas umano (Figura 2C-E).

3.2. Generazione di topi knockdown pancreatici KLOTHO

I topi knockout KLOTHO non condizionali muoiono intorno alle 8-9 settimane di età [7], quindi non possono fungere da modelli per lo sviluppo del cancro. Pertanto, abbiamo mirato al knockdown di KLOTHO sul pancreas dei topi. A tal fine, i topi Pdx1-Cre sono stati incrociati con topi portatori di alleli KLOTHO flox, KLlox/lox [38], ottenendo così Pdx1-Cre; KL-/- topi (Figura 3A, B). I livelli di RNA e proteine ​​hanno convalidato il knock-down del klotho pancreatico (Figura 3C-E). Pdx1-Cre; I topi KL-77 hanno mostrato un leggero aumento di peso nel tempo, rispetto al controllo (Figura 3F), ma nessuna differenza nel glucosio sierico o nell'insulina e nella tolleranza al glucosio (Figura S1).

Figura 3. Generazione di topi knockdown KLOTHO pancreatici. (A)Diagramma schematico dell'allele KLflox: i siti LoxP fiancheggiano l'esone 2 di KLOTHO, portando al suo knockdown mirato nel pancreas di Pdx1-Cre; KL-/-topi. Il pannello superiore mostra l'allele floxed, il pannello inferiore mostra i risultati attesi della ricombinazione Cre. (B) Gel rappresentativo che mostra i prodotti PCR della genotipizzazione KLOTHO del topo: KL plus / plus (WT; 370 bp), KLl/ plus (470 e 370 bp) e KLflox/flox (470 bp). (C,D) L'RNA pancreatico è stato estratto da Pdx1-Cre; KL-/-(n=7) e topi di controllo(n=4). I livelli di mRNA di Klotho sono stati determinati mediante RT-PCR semiquantitativa e quantificati. Viene mostrato il gel rappresentativo (le macchie originali non ritagliate sono disponibili nella Figura S2). (E) colorazione del klotho immunoistochimica rappresentativa del pancreata asportato da Pdx1-Cre; KL-/- e topi di controllo. Ingrandimento: X20. Senza, senza. (F) Peso dei topi in entrambi i gruppi (n=5per gruppo). Analizzato utilizzando misure ripetute ANOVA.p=0.01. I dati sono presentati come media ± SEM. Controllo, topi KLflox/flox. I topi che ospitano il knockdown KLOTHO del pancreas e l'espressione di Kras mutante sono stati generati incrociando Pdx1-Cre con topi LSL-KrasG12D/ più [3] (Pdx1-Cre; KrasG12D/ più topi) e incrociandoli ulteriormente con Topi KLflox/lox (Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ più topi). Le analisi sono state condotte utilizzando topi maschi. Sono stati esclusi topi femmine, a causa di un alto tasso di lesioni anali sia in Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus e Pdx1-Cre; KL-/-; Topi KrasG12D/ plus, che è coerente con precedenti segnalazioni di papillomi mucocutanei in tali topi [3].

3.3.La perdita di Klotho pancreatico contribuisce a ridurre la sopravvivenza nei topi

Non c'era differenza nella sopravvivenza di Pdx1-Cre; KL-/- topi, rispetto al controllo). Abbiamo proceduto a studiare l'effetto del knockdown pancreatico combinato di KLOTHO e della mutazione di Kras sulla sopravvivenza monitorando i topi per 65 settimane. La morte è avvenuta spontaneamente o per eutanasia quando sono iniziati i segni di grave sofferenza o il carico tumorale che ha richiesto il sacrificio. Sopravvivenza di Pdx1-Cre; KL-/-;KrasG12D/ più topi (n =21) ​​è stato ridotto, rispetto al controllo Pdx1-Cre; KrasG12D/ più topi (n=18; p= 0.02; Figura 4A). Pertanto, all'età di 22 settimane, il 100 percento (18/18) di Pdx{19}}Cre; I topi KrasGi2D/ plus erano vivi, rispetto al 71% (15/21) di Pdx1-Cre; KL-/-; Topi KrasG12D/plus. Non sono state notate variazioni significative di peso tra i gruppi (Figura 4B).

Figura 4. Il knockdown del KLOTHO pancreatico contribuisce a ridurre la sopravvivenza e induce PDAC in vivo. (A) Curve di Kaplan-Meier di Pdx1-Cre; KL-/-;KrasGi2D/ plus (n=21) rispetto al controllo Pdx1-Cre;KrasGi2D/ plus (n=18)mice.p=0.02.( B) Peso dei topi in entrambi i gruppi (n=19 per gruppo). (CE) Pancreata sono stati asportati da Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus (n=7, età media 36 settimane) e controllo Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus (n=8, età media 49 settimane) topi al sacrificio. (C) Confronto tra la valutazione patologica del pancreas colorato con H&E di entrambi i gruppi. (D) colorazione rappresentativa H&E del pancreata raccolto da 24-topi di una settimana.Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus (a destra): perdita completa della polarità cellulare, atipia nucleare significativa e gemmazione di ammassi cellulari nel lume duttale, insieme a fibrosi abbondante e cheratina. Control Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus (a sinistra): nessuna lesione. Ingrandimento: × 10. (E) Lesioni PanIN rappresentative di entrambi i gruppi. Ingrandimento: × 10.

3.4. Klotho collabora allo sviluppo del PDAC In Vioo

Sulla base di studi precedenti che mostrano lo sviluppo di PDAC nei topi che ospitano sia la mutazione di Kras che la perdita dell'attività soppressore del tumore [4], abbiamo esaminato Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus pancreata di topo per lesioni. A causa della rapida digestione del tessuto pancreatico da parte dei fluidi pancreatici, abbiamo potuto utilizzare solo il pancreas dei topi che era stato sacrificato. Esempi di Pdx1-Cre; KL-7-; KrasGi2D/ plus (n =7) ​​e controllo Pdx1-Cre; I topi KrasGi2D/ plus (n =8) sono stati sottoposti a valutazione patologica (età media di morte: rispettivamente 36 e 49 settimane). PDAC è stato identificato in due Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ più topi, ma in nessuno dei Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus topi, mentre PanN2 è stato notato in due dei Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus topi e in quattro Pdx1-Cre; KrasG12D/ più topi (Figura 4C). Vengono mostrate immagini rappresentative (Figura 4D-E).

3.5. Il trattamento con sKL inibisce i tumori del pancreas e prolunga la sopravvivenza in vivo

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >0.729; Figura 5F-G).

Il secondo modello utilizzato per questo scopo è stato il modello KPC. I topi sono stati abbinati in base a sesso, età e peso e trattati con ipiniezioni di sKL umano solubile o controllo del veicolo per un massimo di 30 settimane. La morte è avvenuta spontaneamente o per eutanasia quando sono iniziati i segni di grave sofferenza o il carico tumorale che ha richiesto il sacrificio. La sopravvivenza dei topi trattati con sKL è stata aumentata rispetto al controllo (p=0.005; Figura 5H).

Figura 5. Il trattamento con sKL riduce la crescita locale del tumore e prolunga la sopravvivenza in vivo. (AG) I topi BALB/c nudi atimici sono stati inoculati per via sottocutanea con cellule MIA PaCa-2 che esprimono stabilmente m-Cherry/luciferasi (1 × 10 cellule di grado per topo).Dieci giorni dopo, ai topi sono state iniettate dosi elevate di AAV-sKL (5×1011 GC/mL,n=7), AAV-sKL a basse dosi (5×1010 GC/mL, n{13} }) o controllare AAV-null(5×1010 GC/mL,n= 8).(A) Il volume del tumore è stato misurato in vivo con un calibro digitale. (B) Immagini rappresentative del bioimaging dell'attività della luciferasi dei tumori locali. (C) L'attività della luciferasi dei tumori è stata misurata mediante conteggi al minuto. (D) Immagini rappresentative di tumori raccolti il ​​giorno del sacrificio. (E) Peso dei tumori raccolti. (F) Livelli ematici di klotho umano. *p<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4. Discussione

Il presente studio stabilisce il ruolo del klotho come soppressore del tumore nel PDAC. Le analisi bioinformatiche hanno rivelato una correlazione tra la sopravvivenza dei pazienti con PDAC e i livelli di espressione di klotho e metilazione del DNA e hanno dimostrato un modello di ipermetilazione unico di KLOTHO nei tumori del pancreas. Utilizzando un nuovo modello murino, abbiamo dimostrato che il knockdown del klotho pancreatico collabora con la mutazione di Kras per ridurre la sopravvivenza e generare PDACin Vivo. Inoltre, L ha inibito la crescita dei tumori originati dalle cellule pancreatiche in un modello di xenotrapianto e ha prolungato la sopravvivenza dei topi KPC.

Il klotho viene messo a tacere epigeneticamente attraverso l'ipermetilazione del promotore in un'ampia gamma di neoplasie maligne [16,23,25,26,28-31,33,39,40]. Questo è stato riportato anche in piccole coorti in PDAC, così come in una correlazione tra sopravvivenza di pazienti con PDAC e livelli di espressione di klotho e metilazione del DNA [17,34]. Di conseguenza, la nostra valutazione di OS, così come PFI utilizzando dati comprendenti 178 campioni di PDAC, ha mostrato un'associazione positiva con l'espressione di klotho e una corrispondente associazione negativa con la metilazione del DNA di KLOTHO. Questi dati indicano inoltre che l'espressione di klotho può essere regolata dalla metilazione del DNA e rafforzano l'idea che questi parametri potrebbero servire a valutare la prognosi dei pazienti con PDAC.

Precedenti studi sulla metilazione del DNA di KLOTHO in PDAC [17,34] erano basati su un sottogruppo limitato di pazienti e su esperimenti in vitro e non analizzavano il pattern di metilazione di siti specifici all'interno dell'intero gene KLOTHO. L'analisi corrente, basata sull'ampio set di dati sopra menzionato, ha rivelato che tre siti specifici, due dei quali si trovano all'interno di una CpGisland nell'ultimo esone di KLOTHO, agiscono come regolatori negativi dell'espressione di klotho mediante ipermetilazione. In precedenza abbiamo scoperto che uno di questi siti, cg23282559, è anche ipermetilato nel cancro del colon-retto [25]. È ancora da determinare se questi siti svolgano un ruolo nella regolazione del klotho anche in altre neoplasie.

Klotho è noto per essere espresso nel pancreas; tuttavia, il suo ruolo nel normale sviluppo e funzione del pancreas è ancora sconosciuto. Mentre i topi carenti di klotho mostrano una ridotta produzione di insulina, insieme a un drammatico aumento della sensibilità all'insulina [22], la sovraespressione di klotho nei topi si traduce in un aumento dell'insulina nel sangue a digiuno, accompagnata da insulino-resistenza [8]. Sorprendentemente, il modello murino presentato in questo studio, che ospitava il knockdown del klotho pancreatico, non ha mostrato un fenotipo palese di diabete o un'alterata sensibilità all'insulina. Inoltre, non vi è stato alcun effetto sulla morfologia del pancreas, sulla formazione del tumore o sulla sopravvivenza. Questi risultati suggeriscono che la perdita di klotho pancreatico può essere compensata dagli effetti periferici del klotho sistemico o da altri meccanismi. Inoltre, lo sviluppo del diabete è un processo complesso, che dipende non solo dal pancreas, ma anche dal fegato, dai muscoli e dai tessuti adiposi. Come nel nostro modello, il klotho è stato abbattuto principalmente nel pancreas, questo potrebbe spiegare la mancanza di diabete in questo modello murino.

Coerentemente con i risultati clinici presentati, Pdx1-Cre; KL-/-; I topi KrasG12D/ plus avevano una durata della vita ridotta rispetto al controllo Pdx1-Cre; Topi KrasGi2D/ plus (rispettivamente 48 vs.60 settimane). Sebbene non siamo stati in grado di esaminare patologicamente tutto il pancreas del topo, è stato osservato un tasso più elevato di PDAC conclamato in Pdx1-Cre; KL-7-; topi KrasG12D/ plus, rispetto al controllo Pdx1-Cre; KrasG2D/ più topi. Questi risultati dimostrano l'importanza del klotho nello sviluppo di neoplasie pancreatiche e nella sopravvivenza in vivo. Il fenotipo di Pdx1-Cre; KL-/-: i topi KrasGl2D/ plus sono meno pronunciati, rispetto ai modelli che combinano la perdita di altri soppressori tumorali con le mutazioni di Kras. Ad esempio, i topi KPC hanno una sopravvivenza mediana di soli 5 mesi[5]. È possibile che ciò sia dovuto al parziale compenso della perdita di klotho locale da parte del klotho circolante. In alternativa, l'espressione residua di klotho nel pancreas potrebbe aver influenzato il fenotipo. Il raggiungimento del completo silenziamento mirato del klotho in studi futuri consentirebbe una migliore sottovalutazione del suo ruolo in diversi tessuti, nonché il contrappeso tra gli effetti locali e sistemici del klotho.

Abbiamo presentato due modelli che dimostrano il potenziale terapeutico del klotho. In un modello murino di xenotrapianto, le iniezioni di cancro al pancreas di un vettore cutaneo virale si sono rivelate altamente efficaci, non solo nell'inibire la crescita del tumore ma anche nel ridurre le dimensioni dei tumori. Il trattamento è iniziato quando i tumori erano già visibili e stabiliti, simili al momento dell'inizio del trattamento nella maggior parte dei pazienti. I risultati suggeriscono che potrebbe essere utilizzata per la terapia genica, aggirando così i principali ostacoli alla stabilità e all'efficace somministrazione di farmaci a base di proteine ​​e peptidi. Inoltre, è stata notata una correlazione negativa tra il peso del tumore e i livelli ematici di klotho umano. Ulteriori ricerche sui livelli ematici di klotho rispetto al suo effetto possono aiutare a prevedere chi trarrebbe beneficio dal trattamento con klotho o SQL, nonché a mantenere i livelli all'interno della finestra terapeutica.

Lo sviluppo di terapie a base di klotho è un obiettivo ricercato da molti gruppi di ricerca, così come da aziende farmaceutiche. Per quanto riguarda il trattamento del cancro, ci sono diverse strade che vengono esplorate. Si possono aumentare i livelli endogeni di klotho sfruttando i meccanismi epigenetici che hanno dimostrato di influenzare l'espressione di klotho. È stato riportato che il promotore del klotho è fortemente metilato in molti tumori ed è anche una funzione dell'età. Pertanto, i composti che inibiscono le DNA metil transferasi potrebbero diventare un bersaglio terapeutico per aumentare l'espressione del klotho. D'altra parte, si possono aumentare i livelli aggiungendo klotho in modo esogeno, ad esempio impiegando la terapia genica o la somministrazione di una proteina klotho ricombinante. Qui, abbiamo riportato l'introduzione della regione attiva di klotho (L) utilizzando il sistema AAVexpression, che ha provocato un effetto terapeutico in un modello di cancro del pancreas.

Successivamente, abbiamo dimostrato che il trattamento con cielo solubile ha prolungato la sopravvivenza dei topi KPC, un modello noto per ricapitolare il PDAC umano. Ciò ha dimostrato l'effetto del cielo in un ospite immunocompetente e in un ambiente tumorale nativo, supportando ulteriormente il possibile uso di SSL in contesti clinici.

5. Conclusioni

In conclusione, questo studio ha identificato il klotho come un potente oncosoppressore nel PDAC. Gli attuali regimi di trattamento per il PDAC non sono sufficienti e la somministrazione di sKL esogeno può servire come una nuova strategia per il trattamento del PDAC.

Questo articolo è estratto da Cancers 2021, 13, 6297. https://doi.org/10.3390/cancers13246297 https://www.mdpi.com/journal/cancers