L'estratto di foglie di Abrus Precatorius inverte il diabete mellito indotto da alloxan/nicotinamide nei ratti attraverso la modulazione ormonale (insulina, GLP-1 e glucagone) ed enzimatica (-amilasi/-glucosidasi) Parte 1

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Sfondo

Abrus precatorius è usato nella medicina popolare nelle regioni afro-asiatiche del mondo. In precedenza, gli effetti ipoglicemizzanti e protettivi del pancreas dell'estratto di foglie di Abrus precatorius (APLE) sono stati confermati sperimentalmente in ratti diabetici indotti da STZ/nicotinamide; tuttavia, il meccanismo alla base dell'effetto antidiabetico e della protezione del pancreas è rimasto sconosciuto. Obbiettivo. Questo studio ha chiarito i meccanismi antidiabetici e gli effetti di protezione del pancreas dell'APLE nei ratti diabetici. Materiali e metodi. APLE è stato preparato con il metodo di estrazione etanolo/Soxhlet. I fenoli totali ei flavonoidi sono stati quantificati calorimetricamente dopo lo screening fitochimico iniziale. Il diabete mellito (DM) è stato accertato in ratti Sprague-Dawley adulti (del peso di 120-180 g) di entrambi i sessi mediante iniezione sequenziale giornaliera di nicotinamide (48 mg/kg; ip) eAlloxan(120 mg/kg; ip) per un periodo di 7 giorni. Fatta eccezione per i ratti di controllo con glicemia a digiuno (FBG) di 4,60 mmol/L, ratti con FBG stabile(16-21 mmol/L)7 giornipost-nicotinamide/Alloxaniniezione sono stati considerati diabetici e sono stati riassegnati in modo casuale a uno dei seguenti gruppi (modello, APLE (rispettivamente 100, 200 e 400 mg/kg; PO) e metformina (300 mg/kg; PO)) e trattati quotidianamente per 18 giorni . Peso corporeo e FBG sono stati misurati ogni 72 ore per 18 giorni. Il giorno 18, i topi si sono sacrificati in profonditàanestesia; gli organi (rene, fegato, pancreas e milza) sono stati isolati e pesati. Il sangue è stato raccolto per la stima dell'insulina sierica, del glucagone e di (LP-1 utilizzando un kit ELSA specifico per ratti,' il pancreas è stato processato. sezionato e colorato con H&E per l'esame istologico. Effetto dell'APLE sulenzimaticoè stata valutata l'attività di alfa (a)-amilasi e -glucosidasi. Le proprietà antiossidanti e di scavenging dei radicali liberi dell'APLE sono state valutate utilizzando metodi standard. Risultati. L'APLE ha ridotto in modo dose-dipendente l'FBG iniziale del 68,67 percento, 31,07 percento e del 4,39 percento rispetto al modello (4,34 percento) e alla metformina (43,63 percento). Il trattamento APLE (100 mg/kg) ha ripristinato la perdita di peso rispetto al modello. L'APLE ha aumentato l'insulina sierica e la GLP-1 ma ha ridotto il glucagone sierico rispetto al modello. APLE ha aumentato sia il numero che l'area della sezione trasversale mediana (× 10 gradi um') delle isole pancreatiche rispetto a quella del modello. L'APLE ha prodotto un'inibizione dipendente dalla concentrazione di -amilasi e -glucosidasi rispetto all'acarbosio. L'APLE ha eliminato i radicali DPPH e dell'ossido nitrico (NO) in modo dipendente dalla concentrazione e ha dimostrato una maggiore capacità antiossidante di riduzione ferrica (FRAC) rispetto agli standard. Conclusione. L'effetto antidiabetico dell'APLE è mediato attraverso la modulazione dell'insulina e del GLP-1 inversamente con il glucagone, l'inibizione non competitiva della c-amilasi e della -glucosidasi, lo scavenging dei radicali liberi e il recupero delle cellule pancreatiche danneggiate/necro-apoptotiche.

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1. Introduzione

Il diabete mellito (DM) è una delle sindromi metaboliche caratterizzate da iperglicemia cronica culminante da un metabolismo disregolato del glucosio secondario a difetti nella funzione delle cellule pancreatiche [1]. Patologicamente, il DM è il prodotto di errori nel metabolismo del glucosio dovuti a difetti nella funzione delle cellule pancreatiche che causano o insufficienza insulinica (DM di tipo 1) o resistenza all'insulina (DM di tipo 2). I sintomi comuni del DM includono polifagia, polidipsia, visione offuscata, perdita cronica di peso corporeo, gastroparesi e poliuria [2]. Nel tempo, l'iperglicemia irrisolta aumenta il rischio di complicanze microvascolari del DM come la nefropatia diabetica, la retinopatia diabetica e la neuropatia diabetica [2]. Queste complicazioni si verificano a causa di un esteso stress ossidativo e lipidicoperossidazionequali sono i sottoprodotti delle reazioni tra glucosio e molecole biologiche [3]. L'ampia glicosilazione di molecole biologiche come DNA, proteine ​​​​e lipidi porta alla generazione di intermedi biochimici instabili che fungono da fonti di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e specie di azoto (RNS). ROS e RNS sono fattori chiave delle reazioni ossidanti e perossidative in varie cellule e tessuti [3].

Epidemiologicamente, è stato riportato che il DM colpisce oltre 387 milioni di persone nel mondo [4]. Si prevede che questa stima provvisoria aumenterà a 592 milioni entro l'anno 2035 [5]. Inizialmente, si pensava che il DM fosse ad esordio nell'età adulta, ma ora è dimostrato che il DM è indipendente dall'età, il che mostra chiaramente l'enormità della minaccia rappresentata da DM alla salute globale.

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Convenzionalmente, il trattamento del DM (tipo 1 e 2) comporta l'uso di agenti antidiabetici, che sono raggruppati come non insulinici (comprese le biguanidi (es. metformina), sulfoniluree (es. gliburide), inibitori dell'SGLT-2 (es. dapagliflozin), sequestranti degli acidi biliari (p. es., colesevelam), mimetico dell'amilina (p. es., pramlintide), agonista della dopamina-2 (p. es., bromocriptina), inibitori della DPP-4 (p. es., sitagliptin), GLP{{5 }}Terapie di RA (es. exenatide), tiazolidinedione (es. rosiglitazone) e inibitori della -glucosidasi (es. acarbosio e voglibosio)) e insulina (es. insulina umana e analoghi) [6]. Le terapie antidiabetiche convenzionali si sono dimostrate efficaci nonostante l'uso di alcune di esse sia costoso e possa essere associato a gravi effetti collaterali[7]. Il costo, gli effetti collaterali e la convinzione generale che le droghe convenzionali siano sintetiche e del resto pericolose rispetto alle medicine a base di erbe, ritenute "naturali" e relativamente sicure, hanno contribuito al rinnovato interesse per l'uso di erbe e derivati ​​dalle erbe. prodotti per il trattamento e la gestione delle malattie umane compreso il DM[8,9]. Questo paradigma è abbastanza comune nei paesi tropicali più poveri del mondo, dove la maggior parte delle persone si affida alla fitoterapia per soddisfare i propri bisogni di assistenza sanitaria di base [8]. Inoltre, ciò potrebbe probabilmente affermare la consueta affermazione che l'uso delle erbe è antecedente alla medicina moderna e che i prodotti naturali continuano a fungere da modelli per la sintesi farmaceutica di nuovi farmaci[10]compresi gli agenti antidiabetici. È importante sottolineare che queste erbe e le terapie derivate dalle erbe vengono utilizzate come terapia aggiuntiva in un modo che riflette i sistemi di credenze e il patrimonio etnobotanico della maggior parte delle comunità locali nelle regioni afroasiatiche del mondo. Ad esempio, molte piante medicinali con rivendicazioni etnobotaniche per il trattamento del diabete mellito come Chrysobalanus orbicularis[11], Spondias mombin e Mangifera indica[12], Sesamum indicum [13] e Bryophyllum pinnatum [14] hanno tutte dimostrato -amilasi e -effetti inibitori della glucosidasi che sono considerati vitali per il controllo glicemico. È in risposta a questo rinnovato interesse per l'uso di erbe e prodotti a base di erbe come terapia aggiuntiva o alternativa, che l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) insieme ad altri gruppi di interesse ha raccomandato l'incorporazione di sistemi di guarigione indigeni, in particolare la fitoterapia in sistemi sanitari dei paesi più poveri [15]. Questa raccomandazione ha reso necessaria la verifica delle indicazioni sulla salute sulle erbe medicinali comunemente utilizzate dalle popolazioni locali per curare le malattie umane[16,17]. È interessante notare che Abrus pre-catorius comunemente chiamato "pisello jequirity" è un'erba medicinale ampiamente utilizzata nella medicina popolare di molte culture in tutte le regioni afroasiatiche del mondo per il trattamento delle malattie umane[18-20]. Numerosi rapporti hanno evidenziato gli usi tradizionali delle foglie di Abrus precatorius nel trattamento e nella gestione del diabete mellito[21-23]. Da notare, gli estratti dalle foglie di Abrus precatorius hanno dimostrato efficacia contro il diabete mellito [1] e il cancro al seno [24], due malattie umane che hanno contribuito in modo significativo al carico di malattie globali [25]. Molti studi hanno giustificato gli usi etnofarmacologici e altre affermazioni medicinali di Abrus precatorius dimostrando sperimentalmente le sue proprietà biologiche tra cui scavenging dei radicali liberi [26], renoprotezione [27], neuroprotezione [28], immunomodulante[19], antinfiammatorio [29], anti-lipotossicità [30] e aggregazione antipiastrinica [31] solo per citare solo un campione.

In precedenza, gli effetti di riduzione del glucosio e di protezione del pancreas dell'APLE sono stati dimostrati sperimentalmente in ratti diabetici indotti da STZ/nicotinamide per confermare il suo uso come medicina popolare antidiabetica da parte della popolazione locale nella regione occidentale del Ghana [1]. Tuttavia, il meccanismo alla base degli effetti ipoglicemizzanti e di protezione del pancreas dell'APLE è rimasto poco chiarito. Attualmente, i meccanismi alla base degli effetti ipoglicemizzanti e di protezione del pancreas dell'APLE come la modulazione di insulina, glucagone e GLP-1, l'inibizione dell'attività enzimatica di -amilasi e -glucosidasi, scavenging dei radicali liberi e recupero di danno alle cellule pancreatiche e necro-apoptosi sono stati dimostrati in vivo e in vitro.

2. Materiali e metodi

2.1. Droghe e prodotti chimici. Alloxan monoidrato (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA), nicotinamide (Sigma-Aldrich Co., St.Louis, MO, USA), acarbosio (LGM Pharma, USA), metformina (Bristol Laboratori Ltd.) , acido gallico (Merck KGaA, USA), rutina (Acros organics, USA), acido ascorbico (Carl Roth, Germania), quercetina (Alfa Aesar, Regno Unito), p-nitrofenil glucopiranoside (pNPG) (BBI Biotech, Cina), ratto Nello studio sono stati utilizzati il ​​kit ELISA per insulina, il kit Rat Glucagon-ELISA e il kit Rat GLP-1 ELSA (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd, Cina). Tutti gli altri solventi e sostanze chimiche utilizzati nello studio erano di grado analitico.

2.2. Raccolta, identificazione e autenticazione delle foglie di Abrus precatorius. Foglie fresche di A. precatorius sono state raccolte da terreni agricoli incolti a Sefwi Asawinso'A' (Distretto di Bibiani-Ahwiaso-Bekwai, regione occidentale, Ghana). Le foglie sono state identificate e autenticate da un botanico qualificato presso l'unità erbario, School of Biological Sciences, University of Cape Coast, dove è stato depositato un esemplare di voucher (CC3366) come precedentemente riportato [1].

2.3.Preparazione dell'estratto di foglie di Abrus precatorius (APLE). APLE è stato preparato secondo un metodo precedente [1]. In breve, le foglie essiccate all'ombra di A. precatorius sono state macinate meccanicamente in polvere fine. Le foglie in polvere sono state conservate in contenitori di plastica ermetici prima dell'uso. Una quantità di 120 g delle foglie in polvere è stata immersa in 700 ml di etanolo per 48 ore e coperta con una garza. La miscela è stata agitata almeno 3 volte al giorno. Il secondo giorno la miscela è stata filtrata su carta da filtro inserita in un imbuto Buchner. Il filtrato è stato sottoposto a separazione utilizzando un evaporatore rotante montato su un bagno d'acqua. Dopo aver recuperato l'etanolo utilizzando l'evaporatore rotante, il risultante liquido sciropposo verde scuro è stato essiccato in un essiccatore per diverse settimane lasciando un estratto solido verde scuro. L'estratto è stato etichettato e conservato in un essiccatore prima dell'uso. APLE è stato continuamente preparato per ottenere quantità sufficienti per tutti gli esperimenti.

2.4 Screening fitochimico di APLE.APLE è stato sottoposto a screening per la presenza di fitocomposti come precedentemente riportato [1]. 2.5.Determinazione del contenuto fenolico totale (TPC) in APLE. Il contenuto fenolico totale nell'APLE è stato determinato utilizzando il metodo del reagente Folin Ciocalteu come precedentemente descritto [32] con lievi modifiche. Una concentrazione diluita di APLE （250μL di 1mg/mL）è stata miscelata con 750μL di reagente Folin Ciocalteu（1 su 10 diluizioni con acqua） e 750μL di Na, CO al 7%. Le miscele sono state quindi portate a 5mL con acqua distillata e incubate a temperatura ambiente per 2 ore per lo sviluppo del colore. L'assorbanza è stata quindi misurata a 765 nm utilizzando uno spettrofotometro (UV-vis, T70 PG Instruments). Dopo la preparazione di una curva standard di acido gallico (0-300ug/mL), il TPC in APLE è stato estrapolato dalla curva di calibrazione dell'acido gallico ed espresso in acido gallico equivalente (GAE). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato.

2.6.Determinazione del contenuto totale di flavonoidi (TFC) in APLE. Il contenuto totale di flavonoidi nell'APLE è stato misurato secondo un metodo precedentemente descritto [33] con alcune modifiche. In breve, 500μL di estratto vegetale di Abrus precatorius (1 mg/mL) preparato in etanolo al 50% è stato miscelato con 500μL di cloruro di alluminio al 10%（AlCl,.6H,O） e 1500μL di acetato di sodio al 10% (NAC,H,O). ,.3H,O). La miscela di reazione è stata incubata a temperatura ambiente per 40 minuti e l'assorbanza è stata misurata a 415 nm utilizzando uno spettrofotometro (strumenti UV-vis, T70 PG). Dopo la preparazione della curva di calibrazione della rutina standard (0-250ug/mL), il TFC in APLE è stato estrapolato dalla curva di calibrazione della rutina ed espresso in rutina equivalente (RE). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in triplicato.

2.7. Approvazione etica. Tutti i protocolli che coinvolgono animali sono stati inizialmente rivisti e approvati dal Comitato di revisione istituzionale sulla sperimentazione animale della Kwame Nkrumah University of Science and Technology (KNUST) (FPPS/PCOL/006/2019). Inoltre, sono stati condotti esperimenti sui ratti in conformità con le Direttive dell'Unione Europea (2010/63/UE) sull'uso e la cura degli animali nella sperimentazione scientifica. La sofferenza degli animali e il numero di animali sono stati ridotti il ​​più possibile per soddisfare i requisiti delle raccomandazioni 3R (perfezionamento, sostituzione e riduzione) [34].

2.8. Acquisizione e cura di animali sperimentali. Ratti Sprague-Dawley adulti sani di 7-8-una settimana di età di entrambi i sessi (con un peso compreso tra 120 e 180 g) sono stati acquistati dal Noguchi Medical Research Institute (NMRI), Università del Ghana. I ratti sono stati successivamente trasportati alla Animal House del Dipartimento di Scienze Biomediche, Università di Cape Coast, Cape Coast, Ghana. I ratti sono stati alloggiati in gabbie di acciaio inossidabile (34 cm × 47 cm × 18 cm) con trucioli di legno secco come lettiera, nutriti con normale cibo per roditori (GAFCO, TEMA) e hanno avuto accesso illimitato all'acqua. I ratti sono stati mantenuti in condizioni ambientali di temperatura, umidità e normale ciclo buio/luce. Tuttavia, queste condizioni sono state variate per soddisfare i requisiti specifici di alcuni esperimenti. I ratti sono stati autorizzati ad abituarsi in queste condizioni ambientali e di laboratorio per oltre due settimane prima dell'uso negli esperimenti.

2.9. Stabilimento del diabete mellito indotto da alloxan/nicotinamide nei ratti. Il diabete mellito sperimentale è stato stabilito in ratti Sprague-Dawley adulti normoglicemici a digiuno durante la notte secondo un metodo precedentemente descritto [1, 35] con alcune modifiche. In breve, ai ratti è stata iniettata sequenzialmente nicotinamide (48 mg/kg; IP) disciolta in una normale soluzione salina e mantenuta in ghiaccio; quindi, 15 minuti dopo, Alloxan (120 mg/kg; ip) è stato ricostituito in una soluzione di tampone citrato 100 mM (pH4,5) è stata somministrata ai ratti ogni giorno per 7 giorni. Successivamente, ai ratti è stata somministrata una soluzione di glucosio al 5% (5 ml/kg; PO) ogni giorno per 7 giorni. Per confermare l'instaurarsi di iperglicemia nei ratti, il sangue è stato raccolto da ratti a digiuno durante la notte 3-7 giorni dopo l'alloxan/nicotinamide e il 5% di trattamenti con glucosio utilizzando il metodo di amputazione della punta della coda. Le code dei ratti sono state prima pulite con cotone sterile imbevuto di etanolo al 10%. La glicemia a digiuno (FBG) è stata misurata utilizzando il glucometro URIT G26 (URIT Medical Electronic Co., Ltd.).

2.10.Experimental Design. A curative rather than prophylactic treatment approach was adopted in this study, where after the establishment of experimental diabetes mellitus in rats, diabetic rats were subjected to various treatments. Figure 1 shows an outline of experiments carried out in this study. Rats having consistent FBG(11.1 mmol/L or >250 mg/dl) su misurazioni multiple sono stati considerati come affetti da diabete mellito (iperglicemia) [1,35]. I ratti diabetici confermati sono stati assegnati in modo casuale in cinque gruppi. I ratti di controllo non sono stati esposti ad Alloxan; invece, gli è stata somministrata una soluzione salina normale. Tutti i gruppi sono stati trattati per un periodo di 18 giorni come mostrato di seguito:

Controllo: soluzione fisiologica normale (5 ml/ratto/giorno; po) più cibo per roditori più acqua

Modello: nicotinamide (48 mg/kg ip) più alloxan (120 mg/kg; ip) più cibo per roditori più acqua

Metformina: nicotinamide (48 mg/kg; ip) più alloxan (120 mg/kg; ip) più metformina (300 mg/kg; po) più cibo per roditori più acqua

APLE (100 mg/kg): nicotinamide (48 mg/kg; ip) più alloxan (120 mg/kg; ip) più APLE (100 mg/kg; po) più cibo per roditori più acqua

APLE (200 mg/kg): nicotinamide (48 mg/kg; ip) più alloxan (120 mg/kg; ip) più APLE (200 mg/kg; po) più cibo per roditori più acqua

APLE (400 mg/kg): nicotinamide (48 mg/kg; ip) più aloxan (120 mg/kg; ip) più APLE (400 mg/kg po) più cibo per roditori più acqua

2.11. Misurazione del peso corporeo.Il peso corporeo dei ratti è stato misurato prima dell'inizio di tutti gli esperimenti sugli animali. Successivamente, il peso corporeo dei ratti in tutti i gruppi è stato misurato ogni 3 giorni per 18 giorni. Le dosi sono state aggiustate per riflettere le variazioni del peso corporeo ogni 3 giorni. Infine, il peso corporeo dei ratti in tutti i gruppi è stato misurato prima del loro sacrificio.

2.12. Raccolta del sangue, preparazione dei sieri e isolamento degli organi.Dopo aver pesato i ratti il ​​giorno 18, i ratti sono stati sacrificati in anestesia profonda con cloroformio. I campioni di sangue sono stati raccolti tramite puntura cardiaca e quindi dispensati in provette vuote etichettate. Campioni di sangue rappresentativi per ciascun gruppo sono stati centrifugati a 3000 giri/min (centrifuga Eppendorf 5702,4 gradi) per 5 minuti. Per ottenere sieri, il surnatante è stato raccolto in provette campione rispettivamente etichettate. Il fegato, il rene, la milza e il pancreas sono stati prelevati, pesati di fresco e fissati in formalina al 10%.

2.13.Misurazione di insulina, glucagone e GLP sierici-1.I livelli sierici di insulina, glucagone e GLP-1 sono stati, rispettivamente, misurati utilizzando ELISA di insulina di ratto (Wuxi Donglin Sci &Tech Development Co. Ltd, Cina), ELISA di glucagone di ratto (Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd. , Cina) e rat GLP-1 ELISA(Wuxi Donglin Sci & Tech Development Co.Ltd., Cina) rigorosamente secondo le istruzioni del produttore.

2.14.Determinazione dell'area mediana delle isole pancreatiche di Langerhans.Dopo l'elaborazione istologica del pancreas rappresentativo, le fotomicrografie risultanti per i rispettivi gruppi sono state scansionate utilizzando la telecamera oculare Amscope MD35 come descritto in precedenza[1]. Ciascuna microfotografia è stata caricata su Adobe Photoshop CS6 e successivamente sovrapposta a una griglia stereologica. È stato contato il numero di intersezioni sovrastanti lo stroma degli isolotti pancreatici. L'area della sezione trasversale delle isole pancreatiche di Langerhans del pancreas rappresentativo è stata determinata utilizzando il metodo Cavalieri e il conteggio dei punti [36]. L'area della sezione trasversale è stata determinata dalla formula:

dove

A rappresenta l'area della sezione trasversale delle isole pancreatiche di Langerhans

XP rappresenta il numero totale di intersezioni sovrastanti lo stroma delle isole pancreatiche

a/p rappresenta l'area per punto della griglia stereologica M rappresenta l'ingrandimento lineare.

2.15. Estrazione di -amilasi dal pancreas di cavie.Dopo 20 ore di fame, una cavia è stata sacrificata in anestesia profonda e il pancreas è stato rimosso chirurgicamente. Il pancreas è stato ripulito dal grasso e da qualsiasi altro tessuto e immediatamente lavato in tampone fosfato di sodio (pH7,4). Dopo aver pesato il pancreas, è stato conservato in congelatore a 4 gradi. Il pancreas congelato è stato quindi omogeneizzato (1 g di pancreas: 5 mL di tampone) con tampone fosfato di sodio ghiacciato, 0,1 M (pH di 7,4) utilizzando un omogeneizzatore (omogeneizzatore WiseTis HG-15D) e quindi centrifugato a 4400 giri/min per 30 minuti a 4 gradi. Il supernatante è stato pipettato in provette per microcentrifuga separate e conservato in un congelatore a-20 gradi . Per confermare l'enzima estratto (-amilasi), una -amilasi disponibile in commercio è stata confrontata con l'enzima estratto (-amilasi) utilizzando amido e iodio. La debole o scomparsa della colorazione blu-nera considerata come un'indicazione dell'attività dell'amilasi è stata confrontata con una configurazione di controllo (nessun enzima più amido più iodio) dove c'era una profonda colorazione blu-nera.

2.16.Effetto dell'APLE sull'attività enzimatica dell'amilasi.L'inibizione dell'attività enzimatica dell'alfa ( )-amilasi è stata saggiata con un metodo precedente [37] con alcune modifiche. In breve, APLE (125 uL) o acarbosio a concentrazioni crescenti (100-1500 ug/mL) è stato aggiunto a un set di provette etichettate contenenti 125 ul di soluzione di -amilasi in tampone fosfato di sodio 20 mM (pH6,9). La miscela APLE o acarbosio/-amilasi è stata preincubata a 25 gradi per 10 minuti. Successivamente, sono stati aggiunti 125 ul di amido all'1% (preparato in tampone fosfato 20 mM, pH=6.9) a intervalli di tempo selezionati. La miscela di reazione in ciascun caso è stata incubata a 25 gradi per 10 minuti. La conclusione di ciascuna reazione è stata effettuata a intervalli di tempo aggiungendo 250 ul di 3,{21}}reattivo acido dinitrosalicilico (DNSA) e ulteriormente riscaldato a bagnomaria a 100 gradi C per 5 minuti, quindi lasciato raffreddare a temperatura ambiente. Ciascuna reazione è stata preparata fino a 2,5 mL con acqua distillata e l'assorbanza è stata misurata a 540 nm utilizzando uno spettrofotometro (UV-vis, T70 PG Instruments). È stata preparata una configurazione di controllo utilizzando la stessa procedura, tranne per il fatto che -amilasi è stata preincubata con acqua distillata invece di APLE. L'attività inibitoria dell'alfa( )-amilasi è stata calcolata come segue:

2.17. Modalità di inibizione dell'attività enzimatica dell'amilasi da parte di APLE.La modalità di inibizione dell'attività enzimatica dell'amilasi da parte dell'APLE è stata eseguita secondo un metodo precedente [38] con alcune modifiche. In breve, 125 μL di APLE（5mg/mL） sono stati prima preincubati con 125 μL di soluzione di -amilasi in 20mM di fosfato a 25 gradi per 10 minuti in un set di provette etichettate. Successivamente, alle miscele di reazione sono stati aggiunti 125 ul di soluzione di amido a concentrazioni variabili (0.{11}} mg/mL)

iniziare la reazione. La miscela di reazione è stata quindi incubata a 25 gradi per 10 minuti prima dell'aggiunta di 250 ul di acido 3,{4}}dinitrosalicilico (DNSA) per fermare la reazione. La quantità di prodotto formato è stata misurata misurando l'assorbanza a una lunghezza d'onda di 540 nm utilizzando uno spettrofotometro (UV-vis, T70 PG Instruments). La procedura è stata ripetuta per il controllo impostato mediante preincubazione di -amilasi con un tampone invece di APLE. La trama di Lineweaver-Burk dalla trama di Michaeles-Menten è stata eseguita utilizzando il prisma Graph-Pad versione 8 (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA) per la stima di Km e Vmax. La modalità di inibizione dell'attività enzimatica dell'amilasi da parte dell'APLE è stata dedotta dai Km e Vmax stimati.

2.18. Estrazione della -glucosidasi dall'intestino tenue di cavie.L'estrazione della -glucosidasi dall'intestino delle cavie è stata eseguita secondo un metodo precedente [39] con alcune modifiche. In breve, i porcellini d'India sono stati prima fatti morire di fame per 20 ore e poi sacrificati in anestesia profonda. L'intestino tenue situato immediatamente sopra il cieco e immediatamente sotto il duodeno è stato rimosso chirurgicamente e accuratamente risciacquato in tampone fosfato di sodio 0,02 M ghiacciato (pH6,9) prima di immergerlo in una soluzione tampone fresca. A una proporzione di 1 g di intestino-ne: 5 ml di tampone, l'intestino isolato è stato omogeneizzato (omogeneizzatore WiseTis HG-15D, Germania) a 4400 giri/min per 10 minuti a 2 minuti di arresto intermittente sul ghiaccio. L'omogeneizzato è stato centrifugato (centrifuga Eppendorf 5430R) per 30 minuti a 4 gradi e il supernatante è stato raccolto delicatamente. Le aliquote sono state messe in criotubi da 2 ml e mantenute a-20 gradi per l'uso immediato negli esperimenti. Per confermare l'enzima estratto (-glucosidasi), una -glucosidasi disponibile in commercio è stata confrontata con l'enzima estratto (a-glucosidasi) incubando 50 μL di p-nitrofenil glucopiranoside 3 mM (pNPG) con 25 μL di -glucosidasi disponibile in commercio o 25 μL dell'enzima estratto (a-glucosidasi) a 25 gradi. L'osservazione di un prodotto di p-nitrofenolo giallo dopo 5 minuti in ciascun caso è stata considerata una conferma dell'attività della -glucosidasi.

2.19.Effetto dell'APLE sull'attività enzimatica della glucosidasi.Gli effetti inibitori dell'APLE e dell'acarbosio (un inibitore della glucosidasi standard) sono stati valutati in base a un metodo precedente [40]con alcune modifiche. In breve, il tampone fosfato (20 mM; pH =6.9) è stato utilizzato per preparare la p-nitrofenil glucopiranosio (pNPG) (substrato per -glucosidasi). In esperimenti separati, l'a-glucosidasi (50 μL) è stata preincubata con concentrazioni crescenti di APLE (25 μL in ciascun caso), acarbosio o tampone per 10 minuti in ciascun caso. Successivamente, 25 ul di 3 mM di p-nitrofenil glucopiranoside sono stati aggiunti alla miscela preincubata APLE/a-glucosidasi o acarbosio/a-glucosidasi per avviare una reazione. La miscela di reazione in ciascun caso è stata incubata a 25 gradi per 20 minuti. Dopo 20 minuti di incubazione, la reazione è stata interrotta aggiungendo 0,1 M Na,CO,(1 mL). È stato preparato un controllo utilizzando la stessa procedura, tranne per il fatto che la -glucosidasi è stata preincubata con un tampone invece di APLE o acarbosio. Il prodotto di reazione (un p-nitrofenolo di colore giallo) dopo la fine della reazione è stato misurato utilizzando uno spettrofotometro (UV-vis, T70 PG Instruments) a 405 nm per la determinazione dell'attività dell'a-glucosidasi. I risultati sono stati espressi in percentuale del controllo. In ogni caso, gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte. La percentuale (percentuale) di inibizione dell'attività della glucosidasi è stata stimata utilizzando la formula:

2.20. Modalità di inibizione della -glucosidasi da parte di APLE.La modalità di inibizione dell'attività enzimatica della -glucosidasi da parte dell'APLE è stata condotta secondo una precedente procedura [41] con alcune modifiche. In breve, in un set di provette, esattamente 25 μL di 5 mg/mL di APLE sono stati preincubati con una soluzione di -glucosidasi (50 μL) a 25 gradi per 10 minuti. Nel secondo set di provette, una -glucosidasi è stata preincubata con 50 μL di tampone fosfato 20 mM (pH=6.9). Quindi, 25 ul di p-nitrofenil glucopiranoside (PNP) a concentrazioni variabili (0,3-3,0 mg/mL) sono stati aggiunti a entrambi i set di provette per avviare la reazione. Le miscele di reazione sono state quindi incubate a 25 gradi per 20 minuti dopo di che è stato aggiunto Na, CO, （1000μL） per terminare la reazione. La quantità di prodotto rilasciata è stata misurata spettrofotometricamente utilizzando una curva standard di p-nitrofenolo e convertita in velocità di reazione, (v). È stato tracciato un doppio diagramma reciproco (1/v contro 1/S) in cui S è la concentrazione del substrato. La modalità di inibizione dell'attività della -glucosidasi da parte dell'APLE è stata determinata mediante analisi del grafico Line weaver-Burk.

2.21. Valutazione dell'attività di scavenging radicale di 2,2-difenile-1-Picrylhydrazy(DPPH).L'attività di scavenging dei radicali DPPH è stata condotta secondo un metodo precedente [42] con alcune modifiche. In breve, è stata preparata una miscela di reazione da 2 ml mescolando DPPH(1.{3}} ml di 0.135 mM) preparato in metanolo e 1.{7}} ml di concentrazioni variabili di APLE (40,80,120,160 e 200 ug/mL) o acido ascorbico. La miscela di reazione è stata agitata vigorosamente e lasciata al buio a temperatura ambiente per 30 minuti. L'assorbanza è stata misurata (UV-vis, strumenti T70 PG) a 517 nm rispetto a un bianco. Tutti i test sono stati eseguiti in triplicato. Una uguale quantità di soluzione di metanolo e DPPH fungeva da controllo. L'attività di scavenging dei radicali DPPH è stata stimata utilizzando la formula:

2.22. Saggio di scavenging radicale dell'ossido nitrico (NO).NESSUNA attività di scavenging dei radicali dell'APLE e degli standard è stata stimata utilizzando la reazione di Griess Illosvory come precedentemente descritto [43] con alcune poche modifiche. In breve, il reagente Griess Ilosvory utilizzava 0,1 percento (p/v) di naftil etilendiammina dicloridrato invece del 5 percento 1- di naftilammina. Concentrazioni variabili

({{{{10}}}}ug/mL) di APLE e standard (acido gallico e acido ascorbico) preparati e composti fino a 167 ul sono stati posti in provette etichettate, quindi, 667 ul di È stato aggiunto 10 mM di nitroprussiato di sodio. È stato quindi aggiunto tampone fosfato di sodio (167uL, pH7,4) e la miscela è stata incubata a 25 gradi per 150 minuti. Successivamente, è stato aggiunto un reagente di acido sulfanilico da 2000 μL (0,33% in acido acetico glaciale 20%) e lasciato riposare per 5 minuti per il completamento della reazione di diazotizzazione. Infine, sono stati aggiunti, miscelati e poi lasciati riposare per 30 minuti a 25 gradi. La concentrazione di nitriti è stata misurata (UV-vis, T70 PG Instruments) a 546 nm ed è stata calcolata con la soluzione di nitrato di controllo che non aveva APPLE/o standard ma aveva tutti gli altri componenti della miscela di reazione. Come soluzione in bianco è stato utilizzato il tampone fosfato di sodio. Percentuale (percentuale) NESSUNA capacità di scavenging di APLE e standard è stata calcolata utilizzando la formula:

dove Ac è l'assorbanza del controllo e At è l'assorbanza del test (APLE/standard).

2.23. Saggio FRAC (Ferric Riducendo la Capacità Antiossidante).FRAC è stato analizzato secondo il metodo precedente [44] con poche modifiche. In breve, la reazione comprendeva 250uL APLE/soluzione standard a diversa concentrazione (12.5-200ug/mL), 625 ul di tampone fosfato di sodio (0.2M a pH6,6 ), e 625 ul di cianuro ferrico di potassio all'1%, [K,Fe(CN)] in varie provette. Questi sono stati incubati per 20 minuti a 50 gradi per completare la reazione. Quindi, alle provette sono stati aggiunti 625 ul di una soluzione di acido tricloroacetico (TCA) al 10%. La miscela totale è stata centrifugata a 3000 rpm per 10 minuti, dopodiché sono stati prelevati 1800 ul di supernatante e miscelati con 1800 μl di acqua distillata. Successivamente, sono stati aggiunti 360 μL di soluzione di cloruro ferrico allo 0,1 percento (FeCl) e accuratamente miscelati. L'assorbanza della soluzione è stata misurata a 700 nm utilizzando uno spettrofotometro (strumenti UV-vis, T70 PG) rispetto al bianco di reazione. Una tipica soluzione in bianco contenente la stessa miscela di soluzioni senza APLE/o quercetina è stata incubata in condizioni simili. Una maggiore assorbanza della miscela di reazione indica una maggiore capacità riducente. L'esperimento è stato ripetuto tre volte a ciascuna concentrazione. Il FRAC è stato misurato come quercetina equivalente (QE).

2.24. Stima di IC e EC0 Per determinare IC ed ECsoof APLE con rispettivo effetto antiossidante, scavenging dei radicali liberi e inibitorio sull'attività enzimatica di -amilasi e -glucosidasi, è stata testata una serie di concentrazioni crescenti di APLE rispetto al rispettivo attività. Dopo aver convertito le concentrazioni in logout è stato tracciato sull'asse orizzontale rispetto alle attività massime percentuali (antiossidante, scavenging dei radicali liberi e effetto inibitorio sull'attività enzimatica dell'amilasi e dell'a-glucosidasi) sull'asse verticale. La concentrazione di APLE che ha prodotto il 50 percento delle attività massime (antiossidante,

lo scavenging dei radicali liberi e l'effetto inibitorio sull'attività enzimatica dell'amilasi e dell'a-glucosidasi) è stato determinato graficamente utilizzando il software statistico GraphPad prism versione 8.

2.25. Analisi statistica.I dati ottenuti sono stati presentati come media ± DS. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando Graph Pad Prism versione 8 per Windows (Graph Pad Software, San Diego, CA, USA). Il confronto medio tra i gruppi è stato effettuato utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dai test di confronto multiplo di Tukey. P Minore o uguale a 0.05 è stato considerato statisticamente significativo in tutte le analisi.

Questo articolo è estratto da Hindawi BioMed Research International Volume 2021, ID articolo 9920826, 17 pagine https://doi.org/10.1155/2021/9920826