Transizione attiva della fase della memoria della paura dal riconsolidamento all'estinzione attraverso la prevenzione del riconsolidamento mediata da ERK

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Ilrecupero della memoria della paurainduce due processi di memoria opposti, cioè il riconsolidamento e l'estinzione. Un breve recupero induce il riconsolidamento per mantenere omigliora la memoria della paura,mentre il recupero prolungato estingue questa memoria. Sebbene i meccanismi di riconsolidamento ed estinzione siano stati studiati, non è noto come le fasi della memoria della paura siano passate dal riconsolidamento all'estinzione durante il recupero della memoria. Qui, mostriamo che un processo di transizione della memoria dipendente dalla chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK) dopo il recupero regola il passaggio delle fasi della memoria dal riconsolidamento all'estinzione prevenendo l'induzione del riconsolidamento in un'attività di evitamento inibitorio (IA) nei topi maschi. In primo luogo, la fase della memoria di transizione, che annulla l'induzione del riconsolidamento, ma è insufficiente per l'acquisizione dell'estinzione, è stata individuata dopo il riconsolidamento, ma prima delle fasi di estinzione. In secondo luogo, le fasi di riconsolidamento, transizione ed estinzione dopo il recupero della memoria hanno mostrato firme molecolari e cellulari distinte attraverso la proteina legante gli elementi reattiva al cAMP (CREB) e la fosforilazione ERK nell'amigdala, nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale mediale (mPFC). La fase di riconsolidamento ha mostrato una maggiore fosforilazione di CREB, mentre la fase di estinzione ha mostrato diverse popolazioni neurali con varie combinazioni di fosforilazione di CREB e/o ERK, in queste regioni del cervello. È interessante notare che le tre fasi di memoria, inclusa la fase di transizione, hanno mostrato un'attivazione transitoria di ERK immediatamente dopo il recupero. Ancora più importante, il blocco di ERK nell'amigdala, nell'ippocampo o nell'mPFC nella fase della memoria di transizione ha disinibito il miglioramento indotto dal riconsolidamento della memoria IA. Queste osservazioni suggeriscono che il percorso di segnalazione ERK regola attivamente la transizione della fase della memoria dal riconsolidamento all'estinzione e questo processo funziona come un interruttore che annulla il riconsolidamento della pauramemoria.

Parole chiave: ERK; estinzione;paura della memoria; riconsolidamento; transizione

1Dipartimento di Bioscienze, Facoltà di Scienze della Vita, Università di Agraria di Tokyo, Tokyo 156-8502, Giappone e

2Scuola di specializzazione in agraria e scienze della vita, Università di Tokyo, Tokyo 113-8657, Giappone

Dichiarazione di significato

Recupero della memoria della paurainduce due processi di memoria opposti; riconsolidamento ed estinzione. Il riconsolidamento mantiene/migliora la memoria della paura, mentre l'estinzione indebolisce la memoria della paura. Non si sa come le fasi della memoria siano passate dal riconsolidamento all'estinzione durante il recupero. Qui, abbiamo identificato un processo di transizione della memoria attivo che funziona come un interruttore che inibisce il riconsolidamento. Questa fase di transizione della memoria ha mostrato un aumento transitorio della fosforilazione della chinasi regolata dal segnale extracellulare (ERK) nell'amigdala, nell'ippocampo e nella corteccia prefrontale mediale (mPFC). È interessante notare che l'inibizione di ERK in queste regioni nella fase di transizione ha disinibito il potenziamento della memoria di evitamento inibitorio (IA) mediato dal riconsolidamento. Questi risultati suggeriscono che il processo della memoria di transizione regola attivamente il passaggio delle fasi della memoria della paura della memoria della paura, impedendo l'induzione del riconsolidamento attraverso l'attivazione della via di segnalazione ERK.

introduzione

Recupero della memorianon è un processo passivo ma è piuttosto un processo dinamico che consente il mantenimento, il rafforzamento, l'indebolimento o l'alterazione/aggiornamento di una memoria originale (Misanin et al., 1968; Schneider e Sherman, 1968; Lewis, 1979; Mattutus et al. , 1979; Gordon, 1981; Nader et al., 2000; Nader e Hardt, 2009; Dudai, 2012; Fukushima et al., 2014). È importante sottolineare che una memoria di paura condizionata recuperata mediante una breve riesposizione allo stimolo condizionato (CS) diventa labile e richiede il riconsolidamento dipendente dall'espressione genica per il suo mantenimento o miglioramento (Nader et al., 2000; Dudai, 2002; Kida et al., 2002; Suzuki et al., 2004; Tronel et al., 2005; Fukushima et al., 2014). Al contrario, la riesposizione continua o ripetuta al CS induce l'estinzione della memoria, che indebolisce la memoria della paura (Pavlov, 1927; Rescorla, 2001; Myers e Davis, 2002). Così, ilrecupero della memoria della paurainduce due processi di memoria opposti, cioè il riconsolidamento e l'estinzione, sebbene entrambi i processi siano indotti dalla riesposizione a un CS identico, ma differiscano in base alla durata della riesposizione al CS.

La caratteristica biochimica comune e critica del riconsolidamento e dell'estinzione è il requisito per l'espressione genica mediata dalla proteina legante l'elemento cAMP-responsive (CREB) (Mamiya et al., 2009). È interessante notare che abbiamo mostrato firme molecolari, anatomiche e comportamentali contrastanti tra le fasi di riconsolidamento ed estinzione della memoria contestuale della paura (Suzuki et al., 2004; Mamiya et al., 2009). Il blocco della sintesi proteica durante la fase di riconsolidamento interrompe la memoria della paura originale, mentre il blocco della sintesi proteica durante la fase di estinzione non riesce a farlo, sebbene la memoria contestuale della paura sia stata riattivata. Il requisito delle regioni cerebrali che mostrano l'attivazione dell'espressione genica mediata da CREB differisce tra riconsolidamento ed estinzione; il riconsolidamento dipende dall'amigdala e dall'ippocampo, mentre l'estinzione si basa sull'amigdala e sulla corteccia prefrontale mediale (mPFC). Tuttavia, il corso temporale dell'attivazione di CREB dell'amigdaloide differisce tra le fasi della memoria di riconsolidamento e di estinzione. Queste osservazioni hanno suggerito che le fasi di riconsolidamento ed estinzione non sono indipendenti, ma interagiscono tra loro. È interessante notare che studi recenti hanno identificato una finestra temporale (fase di transizione) che non mostra alcuna attivazione extracellulare della chinasi regolata dal segnale (ERK) nell'amigdala dopo il riconsolidamento, ma prima delle fasi di estinzione successive al recupero della memoria uditiva della paura (Merlo et al., 2018 ). Presi insieme, questi risultati suggeriscono i possibili meccanismi attraverso i quali le fasi della memoria passano dal riconsolidamento all'estinzione durante ilrecupero della memoria della paura. In altre parole, è possibile che il processo di transizione della memoria regoli attivamente questo interruttore.

In un'attività di evitamento inibitorio (IA), i topi ricevono uno shock elettrico dopo essere entrati in un compartimento buio da un compartimento luminoso e si formanomemoriaper evitare lo scomparto buio. In precedenza, utilizzando questo compito, abbiamo dimostrato che le fasi di riconsolidamento ed estinzione possono essere discriminate nel momento in cui un topo entra in un compartimento oscuro da un compartimento luminoso durante una sessione di riesposizione (Fukushima et al., 2014). Pertanto, questo compito ci consente di caratterizzare le firme molecolari prospettiche delle fasi di riconsolidamento ed estinzione, in contrasto con il classico paradigma del condizionamento contestuale della paura in cui la riattivazione della memoria della paura condizionata mediante la riesposizione al CS avvia sia il riconsolidamento che l'estinzione; una breve (3 min) riesposizione al contesto condizionato induce il riconsolidamento, mentre una lunga (30 min) o ripetuta riesposizione a questo contesto induce l'estinzione (Eisenberg et al., 2003; Pedreira e Maldonado, 2003; Suzuki et al., 2004; Lee et al., 2008; Mamiya et al., 2009). Inoltre, abbiamo scoperto che la memoria IA recuperata viene migliorata attraverso il riconsolidamento della memoria in questo compito (Fukushima et al., 2014).

Per comprendere il meccanismo per il passaggio dal riconsolidamento all'estinzione durante ilrecupero della memoria della paura, abbiamo mirato a identificare e caratterizzare le firme molecolari, cellulari e comportamentali delle fasi di riconsolidamento, transizione ed estinzione della memoria IA. Abbiamo analizzato l'attivazione di CREB ed ERK nell'amigdala, nell'ippocampo e nell'mPFC nelle fasi di riconsolidamento, transizione ed estinzione ed abbiamo esaminato i ruoli dell'attivazione di ERK in questi processi di memoria.

Materiali e metodi

Topi Tutti gli esperimenti sono stati condotti secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (Japan Neuroscience Society e Tokyo University of Agriculture). Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti in questo studio sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di agricoltura di Tokyo (autorizzazione n. 280037). Tutte le procedure chirurgiche sono state eseguite in anestesia con Nembutal e ogni sforzo è stato fatto per ridurre al minimo la sofferenza. I topi maschi C57BL/6N sono stati ottenuti da Charles River. I topi sono stati alloggiati in gabbie da cinque o sei, mantenute su un ciclo luce/buio di 12/12 ore e consentito l'accesso a cibo e acqua ad libitum. I topi avevano almeno otto settimane di età quando testati. Il test è stato eseguito durante la fase leggera del ciclo. Tutti gli esperimenti sono stati condotti in cieco rispetto alle condizioni di trattamento dei topi.

Test IA L'apparato IA step-through (OHARA Pharmaceutical) consisteva in una scatola con compartimenti chiari e scuri separati (entrambi 15,5 12,5 11,5 cm). Il compartimento luminoso è stato illuminato da una luce fluorescente (2500 lux; Fukushima et al., 2008, 2014; Zhang et al., 2011; Ishikawa et al., 2016). Prima dell'inizio della formazione IA, i topi sono stati trattati individualmente per 2 minuti ogni giorno per una settimana. Durante le sessioni di addestramento, a ciascun topo è stato permesso di abituarsi al compartimento luminoso per 30 s e la porta a ghigliottina è stata sollevata per consentire l'accesso al compartimento buio. La latenza per entrare nel compartimento oscuro era considerata una misura di acquisizione. Non appena il topo è entrato nello scompartimento buio, la porta della ghigliottina è stata chiusa. Dopo 5 s, è stato erogato un footshock (0,2 mA) per un periodo totale di 2 s (allenamento). A 24 ore dopo la sessione di addestramento, il topo è stato riposto nel compartimento chiaro fino a quando non è entrato nel compartimento buio (media 459 6 15,49 s). Immediatamente dopo che il topo è entrato nel compartimento buio, la porta della ghigliottina è stata chiusa e il topo è rimasto nel compartimento buio per un periodo di tempo variabile (0, 1 o 10 minuti) senza shock (riattivazione). La memoria è stata valutata 48 ore dopo [test della memoria a lungo termine post-riattivazione (PR-LTM)] come latenza di crossover per il mouse per entrare nel compartimento oscuro quando sostituito nel compartimento chiaro, come nella riattivazione.

Per il primo esperimento, abbiamo esaminato l'effetto dell'inibizione della sintesi proteica dopo la riattivazione (riesposizione al compartimento scuro per 0, 1 o 10 min; Fig. 1). L'inibitore della sintesi proteica anisomicina (ANI; Wako) è stato sciolto in soluzione salina (pH aggiustato a 7.0-7,4 con NaOH). I topi sono stati addestrati come descritto sopra e, 24 ore dopo, hanno ricevuto veicolo (VEH) o ANI (150 mg/kg, ip) immediatamente dopo la riesposizione al compartimento buio per 0, 1 o 10 minuti senza shock del piede (riattivazione). A questa dose, l'ANI inibisce lo 0,90 percento della sintesi proteica nel cervello durante le prime 2 ore (Flood et al., 1973). A 48 ore dopo la sessione di riattivazione, i singoli topi sono stati nuovamente posti nel compartimento luminoso ed è stata valutata la latenza del crossover.

Per il secondo esperimento [immunoistochimica CREB fosforilata (pCREB) e ERK fosforilata (pERK); Fichi. 2-5], abbiamo esaminato le regioni del cervello che sono state attivate dopo la riesposizione alla luce (fino a quando i topi non sono entrati nel compartimento oscuro, riesposizione al compartimento oscuro per 0 min) o al compartimento oscuro (ri- esposizione al compartimento scuro per 1 o 10 min). I topi sono stati divisi in quattro Fukushima et al. · Transizione delle fasi della memoria della paura dopo il recupero J. Neurosci., 10 febbraio 2021, • 41(6):1288–1300 • 1289gruppi. A 24 ore dopo l'allenamento, i singoli topi sono stati riesposti al compartimento chiaro e poi sono rimasti nel compartimento buio dopo il loro ingresso dal compartimento buio [riattivazione: 0 min nel compartimento buio, gruppo di riconsolidamento (Recon); 1 min, gruppo di transizione (Tran); 10 min, gruppo di estinzione (Est)]. Un altro gruppo di topi non è stato restituito al compartimento chiaro/scuro [gruppo non riattivato (NR)]. I topi sono stati quindi anestetizzati con Nembutal (750 mg/kg, ip) a 5, 15 o 30 minuti dopo la riattivazione.

Per il terzo esperimento (microinfusione di U{{20}}126; Fig. 6,7), abbiamo esaminato gli effetti dell'inibizione di ERK nell'amigdala, nell'ippocampo o nel mPFC sul riconsolidamento/miglioramento della memoria, transizione, ed estinzione. L'inibitore MEK U0126 (Sigma-Aldrich) è stato sciolto in liquido cerebrospinale artificiale contenente tre gocce di Tween 80 (Sigma) in 2,5 ml di dimetilsolfossido al 7,5% (Wako) e regolato a pH 7.4 con NaOH. I topi sono stati addestrati come descritto sopra e 24 ore dopo sono stati rimessi nel compartimento luminoso (riattivazione). I topi sono stati microinfusi con U0126 (1 mg) o VEH nelle varie regioni del cervello subito dopo (Figg. 6A, C, E–H, 7A–C) o 30 minuti dopo (Fig. 6B, D) riattivazione. A 48 ore dalla riattivazione, i singoli topi sono stati nuovamente posti nel compartimento luminoso ed è stata valutata la latenza del crossover (PR LTM). Sono state effettuate microinfusioni nell'ippocampo e mPFC (0,5 ml) a una velocità di 0,25 ml/min. Sono state effettuate microinfusioni nell'amigdala (0,2 ml) a una velocità di 0,1 ml/min. La cannula di iniezione è stata lasciata in posizione per 2 minuti dopo la microinfusione e i topi sono stati quindi riportati nelle loro gabbie di casa. L'inibitore MEK SL327 (Santa Cruz Biotechnology) è stato sciolto in dimetilsolfossido e diluito con soluzione salina. I topi sono stati addestrati come descritto sopra e 24 ore dopo, i singoli topi sono stati rimessi nel compartimento luminoso (riattivazione). I topi sono stati iniettati sistematicamente con SL327 (10 o 20 mg/kg) o VEH subito dopo la riattivazione (Fig. 7D-F). A 48 ore dalla riattivazione, i singoli topi sono stati nuovamente posti nel compartimento luminoso ed è stata valutata la latenza di crossover (PR-LTM).

L'immunoistochimica è stata eseguita come descritto in precedenza (Mamiya et al., 2009; Suzuki et al., 2011; Zhang et al., 2011; Fukushima et al., 2014; Ishikawa et al., 2016; Hasegawa et al., 2019). Dopo l'anestesia, tutti i topi sono stati perfusi con paraformaldeide al 4%. I cervelli sono stati rimossi, fissati durante la notte, trasferiti al 30% di saccarosio e conservati a 4 gradi . Le sezioni coronali (30 mm) sono state tagliate in un criostato.

Per la colorazione pCREB e pERK, le sezioni libere sono state trattate con 1% di H2O2 e incubate per una notte con un anticorpo policlonale di coniglio anti-fosfo-CREB (serina 133; S133) (1:1000; #{{10 }}, Millipore) e/o anticorpo monoclonale di coniglio anti-fosfo-ERK1/2 (T202/Y204) (1:300; #4370; tecnologia di segnalazione cellulare) in soluzione bloccante (soluzione salina tamponata con fosfato più 1% di sieroalbumina di capra, 1 mg/ml di albumina sierica bovina e 0,05% di Triton X-100). Le sezioni sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato e incubate con IgG anti-coniglio di asino coniugato con perossidasi di rafano (1:500; Jackson ImmunoResearch) per pCREB o IgG anti-coniglio di capra coniugato con perossidasi di rafano per pERK per 1 ora a temperatura ambiente. I segnali di pCREB sono stati amplificati dalla biotina tirammide e visualizzati utilizzando la streptavidina coniugata con fluoro Alexa (Invitrogen). I segnali pERK sono stati amplificati con TSA-FCM (Invitrogen). Le sezioni sono state montate su vetrini e coprioggetto utilizzando un mezzo di montaggio (Millipore).

La quantificazione è stata eseguita come descritto in precedenza (Frankland et al., 2006; Fukushima et al., 2014; Mamiya et al., 2009; Zhang et al., 2011; Suzuki et al., 2008). Le strutture sono state definite anatomicamente secondo l'atlante di Franklin e Paxinos (1997). Tutti i neuroni immunoreattivi sono stati contati da uno sperimentatore cieco alla condizione di trattamento

Risultati

Caratterizzazione delle fasi della memoria dopo il recupero nel compito IA

Il compito IA ci consente di discriminare le fasi di riconsolidamento ed estinzione nel momento in cui un topo entra in un compartimento oscuro da un compartimento luminoso (Fukushima et al., 2014). Per comprendere il meccanismo alla base del passaggio delle fasi della memoria dal riconsolidamento all'estinzione, abbiamo caratterizzato le fasi della memoria IA dopo il recupero della memoria esaminando gli effetti dell'inibizione della sintesi proteica necessaria per il riconsolidamento e l'estinzione della memoria IA (Fukushima et al., 2014). I topi sono stati prima collocati nel vano luce. A 5 s dopo essere entrati nel compartimento buio, è stata erogata una breve scossa elettrica (allenamento). I topi sono stati riesposti al compartimento luminoso 24 ore dopo l'allenamento (sessione di riattivazione; Fig. 1A) ed è stata valutata la loro latenza di crossover per entrare nel compartimento scuro (Fig. 1B). I topi sono stati riportati nelle loro gabbie domestiche subito dopo essere entrati nel compartimento buio dal compartimento chiaro (0-minimo riesposizione al compartimento buio; fase di riconsolidamento) o sono rimasti nel compartimento buio per 1, 3 o 10 min senza ricevere un footshock (fase di estinzione; Fig. 1C–E). Immediatamente dopo la sessione di riattivazione, i topi hanno ricevuto un'iniezione sistemica di VEH o dell'inibitore della sintesi proteica ANI. A 48 h dopo, la latenza del crossover è stata valutata PR-LTM.

Coerentemente con il nostro studio precedente (Fukushima et al., 2014), la riesposizione al compartimento luminoso (0 gruppo min) ha indotto il riconsolidamento e il miglioramento della memoria IA. Un'ANOVA a due vie ha rivelato effetti significativi del tempo (F(1,24)=10.433, p=0.{{20}}036), del farmaco (F(1 ,24)=23.197, p , 0,0001) e interazione farmacologica temporale (F(1,24)=25.022, p, 0,0001; Fig. 1B). Il test post hoc di Bonferroni e il t-test accoppiato hanno rivelato che i gruppi VEH e ANI hanno mostrato, rispettivamente, una latenza di crossover significativamente aumentata o diminuita a PR-LTM rispetto alla sessione di riattivazione (ps , 0,05; VEH, t(6) {{28 }} 5.134, p=0.0021, ANI, t(6)=4.804, p=0.003; Fig. 1B). Queste osservazioni indicano che il recupero della memoria dell'IA nel compartimento luminoso ha migliorato la memoria, mentre l'inibizione della sintesi proteica ha interrotto la memoria recuperata, confermando l'osservazione precedente che il recupero della memoria dell'IA migliora la memoria attraverso il riconsolidamento in modo dipendente dalla sintesi proteica.

Al contrario, la riesposizione al compartimento oscuro ha indotto l'estinzione a lungo termine [ANOVA a due vie, tempo (Fig. 1C, F(1,28)=9.575, p=0.{ {50}}04; Fig. 1D, F(1,36)=11.699, p=0.0016), farmaco (Fig. 1C, F(1,28)=4.674, p=0.039; Fig. 1D, F(1,36)=12.285, p {{29 }}.0012), interazione farmacologica temporale (Fig. 1C, F(1,28)=7.916, p=0.009; Fig. 1D, F(1,36) {{41 }}.915, p=0.0079)], come osservato in precedenza (Fukushima et al., 2014). I gruppi VEH che sono rimasti nel compartimento oscuro per 3 o 10 minuti hanno mostrato una latenza di crossover significativamente ridotta a PR-LTM rispetto alla sessione di riattivazione, mentre i gruppi ANI hanno mostrato una latenza di crossover comparabile a PR-LTM rispetto alla sessione di riattivazione e al Gruppi VEH (test di Bonferroni post hoc, ps , 0,05; test t accoppiato, Fig. 1C, VEH, t(7)=4.976, p=0.0016, ANI, t(7) { {59}}.796, p. 0,05; Fig. 1D, VEH, t(9)=10.211, p , 0,0001, ANI, t(9)=1.02, p. 0,05 ). Queste osservazioni indicano che la riesposizione al compartimento oscuro per 3 o 10 minuti ha estinto la memoria dell'IA e che l'inibizione della sintesi proteica ha bloccato l'estinzione a lungo termine. Pertanto, il recupero della memoria dell'IA nel compartimento oscuro estingue la memoria dell'IA in modo dipendente dall'espressione genica.

È importante sottolineare che il gruppo VEH ha mostrato una latenza incrociata comparabile a PR-LTM rispetto alla sessione di riattivazione e al gruppo ANI quando sono rimasti nel compartimento buio per 1 minuto [ANOVA a due vie, tempo (F(1,36) {{ 5}}.03, pag. 0.05), farmaco (F(1,36)=0.019, pag. 0.05), interazione farmacologica temporale (F(1,36)=0.011, p . 0,05); post hoc la prova di Bonferroni, ps . 0,05; t-test accoppiato, VEH, t(9)=0.091, p . 0.05, ANI, t(9)=0.328, pag. 0,05; Fig. 1E]. Queste osservazioni indicano che il gruppo VEH non ha mostrato né potenziamento né estinzione della memoria IA e che il gruppo ANI non ha mostrato alcuna interruzione della memoria IA. Pertanto, la riesposizione al compartimento oscuro per 1 minuto ha bloccato sia il potenziamento che l'interruzione indotta da ANI della memoria IA riattivata, ma non la memoria IA estinta, suggerendo che questa 1-min riesposizione annulla l'induzione del riconsolidamento , ma è insufficiente per estinguere la memoria IA.

In sintesi, questi risultati hanno indicato che la riesposizione al compartimento luminoso induce la fase di riconsolidamento, mentre una riesposizione più lunga al compartimento scuro (3 o 10 min) induce la fase di estinzione. Ancora più importante, rimanere per 1 minuto nel compartimento oscuro induce la fase di transizione dal riconsolidamento all'estinzione, che inibisce il riconsolidamento della memoria della paura senza indurre l'estinzione.

Firme molecolari delle fasi di riconsolidamento, transizione ed estinzione nell'amigdala, nell'ippocampo e nell'mPFC dopo il recupero della memoria dell'IA

Il riconsolidamento e l'estinzione della memoria contestuale della paura mostrano aumenti della fosforilazione di CREB a S133, un marker dell'attivazione dell'espressione genica richiesta per il riconsolidamento e l'estinzione a lungo termine, ma mostrano dinamiche distinte della fosforilazione di CREB (Mamiya et al., 2009 ). È interessante notare che studi recenti hanno dimostrato che non vi è alcun aumento della fosforilazione di ERK, un regolatore a monte di CREB (Impey et al., 1998; Wu et al., 2001), nella regione basolaterale dell'amigdala al passaggio dal riconsolidamento all'estinzione di una memoria di paura scatenata, sebbene questa fosforilazione sia aumentata nella regione basolaterale quando una memoria di paura scatenata viene riconsolidata ed estinta (Merlo et al., 2014, 2018). Un altro studio ha indicato che l'ERK ippocampale si attiva solo quando la memoria della paura contestuale si estingue, ma non si riconsolida (Tronson et al., 2009). Questi risultati suggeriscono che le fasi di riconsolidamento, transizione ed estinzione mostrano firme molecolari e cellulari distinte. Pertanto, abbiamo misurato e confrontato i livelli di pCREB e pERK nelle fasi di riconsolidamento, transizione ed estinzione utilizzando l'immunoistochimica. Abbiamo eseguito programmi sperimentali simili come nella Figura 1B, D, E utilizzando quattro gruppi sperimentali. I topi sono stati riesposti al compartimento luminoso a 24 ore dopo l'allenamento e quindi sono rimasti nel compartimento buio [riattivazione: 0 min nel compartimento buio, gruppo di riconsolidamento (Recon); 1 min, gruppo di transizione (Tran); 10 min, gruppo di estinzione (Est)]. Un altro gruppo di topi non è stato restituito al compartimento chiaro/scuro (gruppo NR non riattivato). Abbiamo contato i neuroni pCREB-positivi (pCREB1), i neuroni pERK-positivi (pERK1) e i neuroni double-positivi (pCREB1/pERK1) nell'amigdala, nell'ippocampo e nel mPFC a 30 minuti dopo la sessione di riattivazione.

L'amigdala (regione laterale) CREB è stata attivata nelle fasi di estinzione e riconsolidamento, mentre ERK è stata attivata solo nella fase di estinzione (Fig. 2A-C). Un'ANOVA unidirezionale ha rivelato un effetto significativo del gruppo (Fig. 2B, F(3,29)=14.85, p , 0.0001). Simile ai risultati precedenti (Mamiya et al., 2009), il test post hoc di Newman-Keuls ha rivelato che i gruppi Recon ed Ext hanno mostrato significativamente più neuroni pCREB1 rispetto agli altri gruppi (p, 0,05). Queste osservazioni hanno indicato che, analogamente alle osservazioni a livello comportamentale (Fig. 1), l'esposizione al compartimento oscuro per 1 minuto (fase di transizione) annulla l '"accensione" della fosforilazione di CREB che sarebbe aumentata nella fase di riconsolidamento. Al contrario, sono stati osservati significativamente più neuroni pERK1 nel gruppo Ext rispetto agli altri gruppi, sebbene ci fossero molti meno neuroni pERK1 rispetto ai neuroni pCREB1 nel gruppo Ext (F(3,29)=3.793, p { {23}}.0207; Fig. 2C).

Coerentemente, sono stati osservati significativamente più neuroni doppi positivi (pCREB1/pERK1) nel gruppo Ext (F(3,29)=6.698, p=0.00 14; Fig. 2D), mentre nei gruppi Recon ed Ext sono stati osservati un numero significativamente maggiore di neuroni pCREB1/ pERK– (pCREB singolo positivo) (F(3,29)=13.689, p , 0 .0001; Fig. 2E). Pertanto, la fase di riconsolidamento ha mostrato solo una singola popolazione di neuroni pCREB1/pERK–. Al contrario, la fase di estinzione ha mostrato due popolazioni di neuroni pCREB1/pERK– e pCREB1/pERK1, indicando che ERK è attivato solo in un sottoinsieme di neuroni pCREB1. È importante sottolineare che risultati simili sono stati osservati nella regione basolaterale dell'amigdala (Fig. 2G, F(3,29)=13.042, p , 0,0001; Fig. 2H, F(3,29) {{32} }.824, p=0.0201; Fig. 2I, F(3,29)=12.633, p , 0.0001; Fig. 2J, F(3,29)=12 .505, p, 0,0001).

Attivazione bifasica di ERK nella fase di estinzione ERK è un attivatore a monte di CREB e, quindi, l'attivazione di ERK è necessaria per il consolidamento e il riconsolidamento della memoria della paura (Schafe et al., 200{{31 }}; Duvarci et al., 2005). Tuttavia, in modo incoerente, non è stata osservata alcuna attivazione di ERK nell'amigdala, nell'ippocampo o nell'mPFC nella fase di riconsolidamento quando il pERK è stato misurato a 30 min dopo la sessione di riattivazione (Figg. 2-4). Pertanto, abbiamo esaminato i corsi temporali della fosforilazione di ERK e CREB. Abbiamo eseguito un esperimento simile a quello delle Figure 2-4, tranne per il fatto che i livelli di pCREB e pERK sono stati misurati a 5, 15 e 30 minuti dopo la sessione di riattivazione (riesposizione al compartimento scuro per {{ 66}}, 1 o 10 min; Fig. 5A). Coerentemente con i dati mostrati nelle Figure 2-4, sono stati osservati aumenti significativi dei neuroni pCREB1 a 30 min, ma non a 5 min, dopo la sessione di riattivazione in Recon (amigdala, mPFC e ippocampo) ed Ext (amigdala e mPFC ) gruppi, ma non il gruppo Tran (Fig. 5E, ANOVA unidirezionale, amigdala, 5 min, F(3,23)=0.346, p . 0,05, 30 min, F(3,23)=15.272, p , 0,0001; mPFC, 5 min, F(3,23)=1.169, p . 0,05, 30 min, F(3,23)=32. 346, p , 0,0001;ippocampo, 5 min, F(3,23)=0.154, p.0,05, 30 min, F(3,23)=16.197, p, 0,0001; test t spaiato, amigdala, riconsolidamento, 5 vs 30 min, t(12)=7.807, p , 0,0001, estinzione, 5 vs 30 min, t(12)=5.405, p { {73}}.0002; mPFC, riconsolidamento, 5 vs 30 min, t(12)=5.727, p , 0.0001, estinzione, 5 vs 30 min, t(12)=4.188 , p=0.0013; regione CA1 dell'ippocampo, riconsolidamento, 5 vs 30 min, t(12)=2.339, p=0.0374).

È interessante notare che aumenti significativi dei neuroni pERK1 sono stati osservati nell'amigdala, mPFC e ippocampo dei gruppi Recon, Tran ed Ext a 5 minuti dopo la sessione di riattivazione rispetto al gruppo NR (Fig. 5F, amigdala, F (3,23)=10.961, p=0.0001; mPFC, F(3,23)=7.525, p { {13}}.0011; ippocampo, F(3,23)=6.924, p=0.0017). Queste osservazioni hanno indicato che ERK si attiva immediatamente dopo la sessione di riattivazione in tutte le fasi della memoria. Tuttavia, questi aumenti del numero di neuroni pERK1 sono tornati ai livelli basali (paragonabili con il gruppo NR) a 15 minuti dopo la sessione di riattivazione (Fig. 5F, amigdala, F(3,20)=2.676, p 0,05; mPFC, F(3,23)=0.683, p. 0,05; ippocampo, F(3,20)=0.74, p. 0,05). Inoltre, coerentemente con i risultati mostrati nelle Figure 2-4, sono stati osservati significativamente più neuroni pERK1 nell'amigdala, nell'mPFC e nell'ippocampo a 30 minuti dopo la sessione di riattivazione solo nel gruppo Ext (Fig. 5F, amigdala, F( 3,23)=6.616, p=0.022; mPFC, F(3,23)=8.012, p=0.0008; ippocampo, F( 3,23)=6.206, p=0.003). Pertanto, le fasi di riconsolidamento e transizione mostrano un'attivazione transitoria di ERK solo nel punto temporale iniziale (5 min), mentre la fase di estinzione mostra un'attivazione bifasica di ERK nei punti temporali precoci (5 min) e tardivi (30 min) dopo la riattivazione sessione. Queste osservazioni hanno indicato che i meccanismi per la regolazione dell'attivazione di ERK differiscono nelle fasi di riconsolidamento/transizione ed estinzione. Nel complesso, le nostre osservazioni hanno dimostrato che le fasi di riconsolidamento, transizione ed estinzione mostrano firme molecolari distinte.

Ruoli dell'attivazione di ERK nelle fasi di riconsolidamento ed estinzione della memoria IA

Le fasi di riconsolidamento/transizione ed estinzione hanno mostrato rispettivamente l'attivazione di ERK monofasica e bifasica. Successivamente abbiamo studiato e confrontato i ruoli dell'attivazione precoce (5 min) e tardiva (30 min) di ERK nell'mPFC nelle fasi di riconsolidamento ed estinzione esaminando gli effetti dell'inibizione di ERK (Fig. 6).

Discussione

In questo studio, abbiamo studiato i meccanismi per la transizione della memoria dal riconsolidamento alle fasi di estinzione dopo il recupero della memoria IA. Abbiamo prima caratterizzato le firme comportamentali delle fasi di memoria IA dopo il recupero. Coerentemente con il nostro studio precedente (Fukushima et al., 2014), il riconsolidamento e l'estinzione indotti dal recupero della memoria di IA mediante riesposizione alla luce (0 min nel compartimento oscuro) e al buio ( rispettivamente di 3 o 10 minuti). È interessante notare che la memoria IA non è stata né migliorata né estinta e ha mostrato resistenza all'inibizione della sintesi proteica quando i topi sono stati riesposti al compartimento oscuro per solo 1 minuto. Pertanto, queste osservazioni suggeriscono che un 1-min riesposizione al compartimento oscuro annulla l'induzione del riconsolidamento, ma è insufficiente per estinguere la memoria IA. Inoltre, abbiamo scoperto che ERK è stato attivato nell'amigdala, nell'ippocampo e nell'mPFC in un momento iniziale (5 min) dopo la riesposizione al compartimento scuro per 0, 1 o 10 min. Coerentemente, l'inibizione di ERK in queste regioni del cervello ha bloccato il riconsolidamento/miglioramento e l'estinzione della memoria IA. Ancora più importante, l'inibizione di ERK nell'amigdala, nell'ippocampo e nell'mPFC dopo 1-min riesposizione al compartimento oscuro ha disinibito il miglioramento mediato dal riconsolidamento della memoria IA, suggerendo che l'attivazione di ERK dopo brevi (1 min) riesposizioni al compartimento oscuro è necessario per l'inibizione del riconsolidamento della memoria IA. Al contrario, una 1-riesposizione minima al compartimento oscuro non è stata sufficiente per estinguere la memoria IA, sebbene la riesposizione prolungata al compartimento oscuro (3 o 10 minuti) abbia estinto questa memoria. Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che una 1-minima riesposizione al compartimento oscuro induce un processo di transizione della memoria che annulla il riconsolidamento/miglioramento ma non avvia l'apprendimento per estinzione. Collettivamente, suggeriamo che il processo di transizione della memoria contribuisce al passaggio delle fasi della memoria dal riconsolidamento all'estinzione attraverso la prevenzione del riconsolidamento mediata da ERK.

Simile alle nostre attuali osservazioni, un recente studio che utilizza il condizionamento uditivo della paura ha mostrato che presentazioni CS singole (1) o prolungate (10) inducono rispettivamente il riconsolidamento e l'estinzione della memoria attraverso un aumento dei livelli di pERK nella regione basolaterale dell'amigdala. Al contrario, le presentazioni CS intermedie (4-7) non cambiano i livelli di pERK nella regione basolaterale dell'amigdala. È importante sottolineare che l'inibizione di ERK alle presentazioni CS intermedie non ha influenzato la memoria della paura. Questo studio ha suggerito che c'è una transizione della fase della memoria dal riconsolidamento all'estinzione dopo il recupero della memoria della paura (Merlo et al., 2018). Nel presente studio, abbiamo esteso questa scoperta e suggerito che la fase di transizione commuta attivamente le fasi della memoria dal riconsolidamento all'estinzione attraverso l'attivazione della via di trasduzione del segnale ERK. Contrariamente ai risultati precedenti (Merlo et al., 2018), abbiamo scoperto che la fase di transizione coinvolge la fosforilazione di ERK nell'amigdala, nell'ippocampo e nell'mPFC. Queste discrepanze forse a causa della differenza di punti temporali che esaminano la fosforilazione di ERK; lo studio precedente ha misurato i livelli di pERK a; 12 minuti dopo la presentazione di CS (Merlo et al., 2018), mentre il nostro studio ha mostrato che l'aumento dei livelli di pERK è tornato al livello basale intorno a questo punto temporale (15 minuti dopo la riesposizione). Inoltre, è importante notare che il compito IA consente l'osservazione del miglioramento della memoria IA attraverso il riconsolidamento, portando così alla nostra scoperta che l'inibizione di ERK nella fase di transizione disinibisce il miglioramento della memoria IA.

Precedenti studi hanno dimostrato che la fosforilazione di ERK è aumentata nella regione basolaterale dell'amigdala a 20-60 minuti dopo l'estinzione dell'apprendimento della memoria della paura (Herry et al., 2006; Merlo et al., 2014, 2018), mentre l'ippocampo mostra questa attivazione a 1 ora dopo l'estinzione dell'apprendimento della memoria contestuale della paura (Fischer et al., 2007; Tronson et al., 2009). Nel presente studio, abbiamo ottenuto osservazioni simili sul fatto che pERK è aumentato a 30 minuti dopo la sessione di riattivazione nella fase di estinzione. Questi risultati suggeriscono che la fosforilazione di ERK è una firma molecolare comune della fase di estinzione tardiva (20-60 min).

Inoltre, abbiamo osservato che l'attivazione di ERK si verifica bifasicamente nei punti temporali precoci e tardivi (5 e 30 min) dopo la sessione di riattivazione nella fase di estinzione, mentre questa attivazione si verifica monofasicamente nel momento iniziale nella fase di riconsolidamento (Fig. 5) . Coerentemente, l'inibizione dell'ERK nelle regioni del cervello in questi momenti delle fasi di riconsolidamento ed estinzione ha bloccato rispettivamente il riconsolidamento/miglioramento e l'estinzione a lungo termine (Fig. 6A, C–H). Queste osservazioni suggeriscono che l'attivazione monofasica e bifasica di ERK è necessaria rispettivamente per il miglioramento e l'estinzione della memoria IA mediata dal riconsolidamento. È importante notare che ERK funziona come regolatore a monte della fosforilazione di CREB. Pertanto, l'attivazione transitoria di ERK nella fase di memoria precoce può, almeno in parte, contribuire a questa fosforilazione di CREB, che attiva l'espressione dei geni necessari per il riconsolidamento e l'estinzione a lungo termine.

Simile ai nostri risultati precedenti utilizzando il condizionamento contestuale della paura (Mamiya et al., 2009), CREB è stato attivato nelle fasi di memoria di riconsolidamento (amigdala/ippocampo/mPFC) ed estinzione (amigdala/mPFC), mentre ERK è stato attivato solo nella fase di estinzione a 30 minuti dalla sessione di riattivazione. Coerentemente, nella fase di riconsolidamento è stata osservata solo una singola popolazione di neuroni pCREB1/pERK–, mentre nella fase di estinzione sono state osservate popolazioni di neuroni distinte: neuroni pCREB1/pERK– e pCREB1/pERK1 nell'amigdala (Fig. 2); neuroni pCREB– /pERK1 nell'ippocampo (Fig. 3); e neuroni pCREB1/pERK–, pCREB–/pERK1 e pCREB1/pERK1 nel mPFC (Fig. 4). Queste osservazioni, in particolare l'osservazione contrastante dei neuroni pCREB–/pERK1 e pCREB1/pERK–, suggeriscono che l'attivazione di CREB ed ERK è regolata in modo diverso in ciascuna area del cervello quando la memoria si estingue e che l'attivazione della fase tardiva di ERK gioca in modo specifico e distinto ruoli per l'estinzione della memoria della paura rispetto ad altri processi di memoria come il consolidamento e il riconsolidamento come discusso di seguito. È interessante notare che abbiamo osservato che i neuroni pERK1 erano più abbondanti nell'mPFC rispetto all'ippocampo e all'amigdala, poiché l'mPFC mostrava un rapporto più elevato di neuroni pERK1 (fase di estinzione) e neuroni pCREB1 (fase di riconsolidamento) rispetto all'ippocampo e all'amigdala, suggerendo che l'attivazione di ERK nell'mPFC gioca un ruolo più specifico nell'estinzione della memoria.

Non è chiaro se le stesse o diverse popolazioni di neuroni vengano attivate nelle fasi di riconsolidamento, transizione ed estinzione della memoria. Uno studio precedente ha identificato l'attivazione di "neuroni della paura" e "neuroni di estinzione" nell'amigdala quando la memoria della paura viene riattivata o estinta, rispettivamente (Herry et al., 2008). Pertanto, è possibile che ERK e CREB si attivino nelle diverse popolazioni di neuroni con differenti profili temporali (es. "neuroni di riconsolidamento" e neuroni di estinzione). Come discusso in precedenza, i neuroni pCREB1, inclusi i neuroni pCREB1/pERK1, possono regolare il riconsolidamento e l'estinzione a lungo termine della memoria IA attraverso l'attivazione dell'espressione genica rispettivamente come neuroni di riconsolidamento e di estinzione. Al contrario, l'attivazione di ERK nei neuroni pCREB– /pERK1 può contribuire alla cancellazione dell'attivazione trascrizionale mediata da CREB che sarebbe necessaria per il riconsolidamento poiché questa attivazione di ERK è specificamente osservata nella fase di estinzione tardiva; ERK si è attivato nei neuroni di riconsolidamento per annullare l'attivazione dell'espressione genica nella fase di estinzione. È interessante notare che uno studio precedente ha mostrato che l'attivazione dell'ERK dell'ippocampo blocca l'induzione di c-fos quando la memoria della paura contestuale si estingue (Guedea et al., 2011), sollevando la possibilità che questa attivazione di ERK antagonizza il percorso di segnalazione CREB. È importante identificare le popolazioni neuronali che regolano il riconsolidamento, la transizione e l'estinzione e studiare le firme molecolari e il significato funzionale di quei neuroni. Inoltre, le interazioni tra le popolazioni neurali identificate in questo studio rimangono sconosciute. È possibile che i "neuroni di estinzione (transizione)" modulino la funzione dei neuroni di riconsolidamento per annullare la prevenzione del riconsolidamento attraverso interazioni tra di loro (Eisenberg et al., 2003; Merlo et al., 2014). Pertanto, è anche importante esaminare queste interazioni all'interno e tra l'amigdala, l'mPFC e l'ippocampo.

In precedenza, abbiamo dimostrato che l'ippocampo non mostra alcun cambiamento della fosforilazione di CREB e dell'espressione dell'arco dopo l'estinzione dell'apprendimento della paura contestuale e, coerentemente, l'inibizione della sintesi proteica nell'ippocampo nella fase di estinzione non riesce a bloccare l'estinzione a lungo termine (Mamiya et al. , 2009). Queste osservazioni hanno sollevato la possibilità che l'ippocampo non sia necessario per l'estinzione a lungo termine. Tuttavia, abbiamo dimostrato che ERK viene attivato nell'ippocampo dopo l'estinzione dell'apprendimento della memoria IA e, in modo coerente, il blocco dell'attivazione di ERK nell'ippocampo compromette l'estinzione a lungo termine. Pertanto, le nostre attuali osservazioni indicano ruoli essenziali per l'ippocampo nell'estinzione della memoria. Insieme ai nostri risultati precedenti, suggeriamo che l'ippocampo è necessario per l'estinzione della memoria ma non per un processo simile al consolidamento per stabilizzare una "memoria di estinzione" attraverso l'attivazione dell'espressione genica.