Effetti neuroprotettivi acuti dose-dipendenti del poli(pro-17 estradiolo) in un modello murino di lesione da contusione spinale

Astratto

17 -L'estradiolo (E2) conferisce neuroprotezione in modelli preclinici di lesioni del midollo spinale quando somministrato per via sistemica. L'obiettivo di questo studio era quello di applicare l'E2 localmente al midollo spinale ferito per una durata prolungata utilizzando biomateriali in pellicola di poli(pro-E2).

Man mano che le persone apprendono di più sulle lesioni del midollo spinale, stiamo iniziando a renderci conto dell'impatto che hanno sulla salute fisica e mentale delle persone. Sebbene le lesioni del midollo spinale possano causare molti effetti avversi, fortunatamente il loro impatto sulla memoria può essere controllato.

Innanzitutto occorre chiarire cos’è la lesione del midollo spinale. Il midollo spinale è un nervo protetto nella colonna vertebrale che è responsabile della trasmissione delle istruzioni dal cervello a varie parti del corpo. Se il midollo spinale è ferito, alcune parti del corpo perderanno una buona connessione con il cervello, con conseguenti movimenti degli arti, sensibilità e controllo autonomo compromessi.

Le lesioni del midollo spinale possono avere un certo impatto sulla memoria delle persone, soprattutto nelle prime fasi della riabilitazione dei pazienti con lesioni del midollo spinale. Le lesioni del midollo spinale possono causare il deterioramento dell'attenzione, della memoria di lavoro e della capacità di elaborazione emotiva di una persona, il che influenzerà la capacità di memoria di una persona.

Tuttavia, questi effetti negativi diminuiranno gradualmente man mano che i pazienti verranno sottoposti al trattamento riabilitativo. I pazienti possono migliorare la propria memoria partecipando a giochi di memoria e ad altri allenamenti cognitivi. Allo stesso tempo, la riabilitazione fisica contribuisce anche a ripristinare le funzioni motorie e sensoriali del corpo, migliorando così le funzioni emotive e cognitive.

Dovremmo incoraggiare i pazienti con lesioni del midollo spinale a partecipare attivamente al trattamento riabilitativo e a persistere nella formazione riabilitativa per migliorare la salute fisica e mentale. Si prega di credere che con l'aiuto di una corretta cognizione e di un trattamento postoperatorio, i pazienti possono superare l'impatto della lesione del midollo spinale sulla memoria e continuare a vivere una vita attiva. Si vede che abbiamo bisogno di migliorare la memoria, e la Cistanche può migliorare significativamente la memoria perché la Cistanche può anche regolare l'equilibrio dei neurotrasmettitori, come ad esempio aumentare i livelli di acetilcolina e i fattori di crescita, che sono molto importanti per la memoria e l'apprendimento. Inoltre, Cistanche può anche migliorare il flusso sanguigno e promuovere l'apporto di ossigeno, il che può garantire che il cervello ottenga nutrimento ed energia sufficienti, migliorando così la vitalità e la resistenza del cervello.

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In seguito a lesione contusiva del midollo spinale in topi maschi adulti, sono state impiantate pellicole di poli(pro-E2) a livello subdurale e la neuroprotezione è stata valutata mediante immunoistochimica 7 giorni dopo la lesione e l'impianto. In questi studi, le pellicole di poli(pro-E2) hanno migliorato modestamente la neuroprotezione senza influenzare la risposta infiammatoria rispetto ai controlli feriti.

Per aumentare la dose di E2 rilasciata, sono state fabbricate pellicole di poli(pro-E2) a rilascio di bolo incorporando E2 non legato nelle pellicole di poli(proE2).

Tuttavia, rispetto ai controlli feriti, i film di poli(pro-E2) a rilascio di bolo non hanno migliorato significativamente la neuroprotezione o limitato l'infiammazione a 7 o 21 giorni dopo l'infortunio. Il lavoro futuro si concentrerà sullo sviluppo di biomateriali di poli(pro-E2) in grado di più precisamente rilasciando dosi terapeutiche di E2.

INTRODUZIONE

La lesione traumatica del midollo spinale (LM) è una condizione debilitante che colpisce più di 18,000 persone ogni anno negli Stati Uniti,1 mentre si stima che la prevalenza globale della LM sia compresa tra 236 e 1.009 per milione.2

I pazienti affetti da LM vanno incontro a gravi deficit neurologici, tra cui perdita di sensibilità, compromissione della funzionalità intestinale/vescicale e paralisi.3,4 L'impatto primario sul midollo spinale provoca la morte neuronale nel sito della lesione, che viene ulteriormente esacerbata da diverse cascate di lesioni secondarie che coinvolgono astrociti e macrofagi. .

Nel corso del tempo, questi astrociti formano una cicatrice gliale che impedisce l'estensione degli assoni oltre il bordo della lesione.5 Ad oggi non esistono farmaci neuroprotettivi approvati dalla FDA per il trattamento della LM.

La ricerca, durata diversi decenni, si è concentrata sulla somministrazione sistemica di biomolecole per prevenire la perdita neuronale dovuta a lesioni secondarie e/o promuovere la rigenerazione assonale, portando infine al ripristino della funzione perduta.6 Una biomolecola che si è dimostrata promettente nei modelli preclinici di LM è la femmina ormone sessuale, 17 -estradiolo(E2).

La somministrazione di E2 è ampiamente benefica per il sistema nervoso centrale riducendo l'infiammazione,7-9 alleviando la reattività delle cellule gliali,10 limitando lo stress ossidativo,11-14 e mitigando la morte neuronale eccitotossica indotta dal glutammato.15 L'E2 migliora il recupero funzionale in vari modelli di roditori di LM.10, 16,17 È interessante notare che la somministrazione sistemica di dosi multiple di E2 induce un recupero funzionale più rapido18,19 rispetto agli animali che ricevono solo una singola dose.17

Poiché l'E2 promuove il recupero funzionale in modo più efficace attraverso regimi a dosi multiple, il nostro obiettivo era quello di rilasciare stabilmente E2 localmente nel sito della lesione (per prevenire eventuali effetti fuori bersaglio) per aggirare i problemi derivanti da dosaggi multipli/iniezioni sistemiche di E2.

A tal fine, abbiamo impiegato una strategia di biomateriale poli(profarmaco) in cui il farmaco nativo (E2) è stato prima funzionalizzato con gruppi allilici reattivi e poi polimerizzato tramite addizione radicale tiolo-ene fotoiniziato con un oligo-(glicole etilenico) ditiolo flessibile, come descritto in precedenza .20 Abbiamo ottenuto catene polimeriche ad alto peso molecolare, che consistono in un profarmaco E2 come unità ripetitiva all'interno del polimero.

Dopo la degradazione idrolitica, il polimero rilascia gradualmente E2 nei mezzi circostanti. Gli unici altri sottoprodotti del rilascio sono l'anidride carbonica e l'oligo(glicole etilenico) (oEG) (Figura 1). Le catene poli(pro-E2) fabbricate in pellicole o microfibre possono rilasciare E2 a concentrazioni nanomolari in vitro su una scala temporale di mesi o anni .20

L'E2 rilasciato da questi scaffold poli(pro-E2) è bioattivo e questi scaffold promuovono il neurotrofismo e la neuroprotezione in vitro proteggendo i neuroni dallo stress ossidativo indotto dal perossido di idrogeno. Qui, abbiamo applicato i film di poli (pro-E2) in un modello murino di LM con contusione, immediatamente dopo la lesione, e abbiamo valutato la loro capacità neuroprotettiva in vivo.

Il nostro design iniziale della pellicola in poli(pro-E2) ha aumentato la neuroprotezione in modo acuto (7 giorni dopo l'infortunio) nel sito della lesione senza influenzare la risposta infiammatoria. Poiché le pellicole di poli(pro-E2) rilasciano nanogrammi di E2 al giorno, abbiamo sviluppato un'altra strategia di rilascio in cui l'E2 non legato è stato incorporato nella matrice di poli(pro-E2). Abbiamo ipotizzato che il rilascio in bolo di E2 non legato possa fornire ulteriori benefici neuroprotettivi.

Le pellicole di poli(pro-E2) rilasciavano E2 in modo burst seguito da un rilascio prolungato di E2 dal polimero a concentrazioni inferiori. La colorazione immunoistologica ha valutato neuroni, astrociti e macrofagi/microglia presenti nel sito della lesione in modo acuto (7 giorni dopo la lesione) e cronico (21 giorni dopo la lesione) dopo SCI in presenza di questi film poli(pro-E2) a rilascio di bolo.

RISULTATI E DISCUSSIONE

I film di poli(pro-E2) rilasciano E2 a concentrazioni nanomolari, promuovono la crescita neuronale dal ganglio della radice dorsale e proteggono i neuroni dallo stress ossidativo indotto dal perossido di idrogeno in vitro.20 Lo studio qui presentato cerca di determinare la capacità del poli(pro-E2) film per fornire neuroprotezione in vivo utilizzando un modello murino di SCI da contusione.

Una SCI con contusione moderata è stata indotta in topi maschi adulti e, immediatamente dopo la lesione, sono state posizionate pellicole di poli(pro-E2) direttamente sopra la lesione (Figura 2A). Per garantire che le pellicole di poli(pro-E2) rimanessero in sede dopo l'impianto, pellicole di poli(pro-E2) caricate con rodamina B sono state impiantate nel midollo spinale di animali feriti. Sette giorni dopo l'impianto, i midolli spinali sono stati raccolti e sottoposti a imaging utilizzando un microscopio ottico (Figura 2B). In tutti gli animali, i film di poli(pro-E2) caricati con rodamina B sono rimasti al loro posto, convalidando il protocollo di impianto.

Per testare la capacità dei film di poli(pro-E2) di fornire neuroprotezione e alleviare l'infiammazione, i film di poli(pro-E2) (senza rodamina B) sono stati impiantati a seguito di una lesione da contusione spinale e i midolli spinali sono stati raccolti 7 giorni dopo la lesione e l'impianto. Sezioni longitudinali (spesse 10 μm) sono state tagliate, centrate attorno all'epicentro della lesione e immunomarcate per visualizzare neuroni e macrofagi nel midollo spinale (Figura 3).

Le sezioni sono state etichettate per NeuN per valutare la presenza neuronale e l'analisi quantitativa della colorazione ha rivelato che i film poli (pro-E2) hanno aumentato significativamente l'area positiva NeuN attorno all'epicentro della lesione rispetto ai controlli feriti che non hanno ricevuto impianti di film (Figura 3A; p=0.0002). La colorazione aggiuntiva per gli assoni utilizzando NFH (catena pesante dei neurofilamenti) ha rivelato anche l'effetto neuroprotettivo acuto dei film poli(pro-E2) impiantati (Figura 3B; p=0.0017).

Abbiamo osservato che questo cambiamento nella neuroprotezione non era dovuto a un cambiamento nell'apoptosi (caspasi 3) nel sito della lesione (Figura di supporto S1; p=0.9966). Anche la colorazione per i macrofagi attivati ​​(CD68) non ha rivelato alcuna differenze significative tra gli animali trattati con film poli(pro-E2) e gli animali non trattati (Figura 3C; p= 0.7207).

Nel loro insieme, i film di poli(pro-E2) aumentano modestamente la neuroprotezione in modo acuto senza alterare la risposta infiammatoria. I film di poli(pro-E2) hanno aumentato la densità neuronale in modo acuto di quasi il 20%, ma i film non hanno avuto evidenti effetti antinfiammatori (in base alla quantificazione di l'area occupata dai macrofagi attivati) (Figura 3).

Questa mancanza di riduzione dell'infiammazione può indicare che le dosi antinfiammatorie e neuroprotettive di E2 sono distinte e che entrambe non sono state raggiunte con l'attuale formulazione in film.20 Abbiamo ipotizzato che l'aumento del rilascio di E2 dai film poli(pro-E2) in modo acuto possa ridurre l'infiammazione e consentire una risposta neuroprotettiva più robusta.

Per aumentare la dose di E2 rilasciata in modo acuto, i film di poli(pro-E2) sono stati modificati in modo che il rilascio di E2 in bolo avvenisse immediatamente dopo l'impianto. Dopo il rilascio in bolo di E2, seguirebbe la degradazione del polimero per rilasciare E2 alla stessa concentrazione di prima. L'esperimento sopra descritto è stato ripetuto utilizzando queste pellicole di poli(pro-E2) a rilascio di bolo e la neuroprotezione e l'infiammazione sono state valutate 7 giorni dopo l'infortunio (dpi).

Tuttavia, invece di un ulteriore vantaggio, i film di poli(pro-E2) a rilascio di bolo non hanno aumentato significativamente l'area NeuN positiva rispetto ai controlli feriti e non trattati (Figura 4A; p=0.6770). I film di poli(proE2) a rilascio di bolo hanno aumentato l'espressione di CD68, ma l'aumento non era statisticamente diverso (p= 0.1780).

Tendenze crescenti nella reattività gliale e nell'infiammazione microgliale sono state osservate anche in presenza di film di poli(pro-E2) a rilascio di bolo a causa dell'aumento dell'espressione di GFAP (astrociti) e Iba1 (microglia); tuttavia, questi aumenti non sono stati statisticamente maggiori di quanto osservato nei controlli feriti e non trattati (p=0.3233 e p=0.3053, rispettivamente). Nel loro insieme, i film di poli(pro-E2) a rilascio di bolo non hanno migliorato la neuroprotezione e la reattività degli astrociti e la presenza di macrofagi/microglia non sono state ridotte come inizialmente ipotizzato.

Poiché le differenze tra animali feriti, non trattati e animali feriti trattati con film di poli(proE2) a rilascio di bolo non sono state osservate nel momento acuto, a 7 dpi, è stato selezionato un momento cronico per ulteriori indagini poiché i film di poli(pro-E2) può rilasciare E2 a lungo termine.20 L'esperimento sopra descritto è stato ripetuto con le pellicole di poli(pro-E2) a rilascio di bolo, ma gli animali sono stati valutati cronicamente a 21 dpi (Figura 5).

I midolli spinali sono stati etichettati per gli stessi tipi di cellule indicati in precedenza. A seguito dell'analisi, si è verificata una tendenza verso un aumento della frazione di area di NeuN negli animali impiantati con film poli (pro-E2) a rilascio di bolo rispetto agli animali feriti e non trattati (Figura 5A; p=0.0897) Inoltre, sono state osservate tendenze in cui i film di poli(pro-E2) a rilascio di bolo hanno ridotto la frazione di area dell'espressione di CD68 e GFAP rispetto ai dati provenienti da controlli di animali feriti non trattati (Figura 5B, C; p=0.0859 e p=0.2780).

Tuttavia, nessuna delle tendenze era statisticamente diversa. D'altra parte, le sezioni di tessuto marcate con Iba1 provenienti da animali trattati con poli(pro-E2) a rilascio di bolo hanno mostrato una maggiore espressione rispetto ai dati provenienti da controlli feriti non trattati (p <0.0001). Il nostro lavoro precedente mostra che poli(pro -E2) le pellicole proiettate su vetrini coprioggetto da 15 mm × 15 mm rilasciano circa 266 ng di E2 al giorno,20 che si traduce in circa 2 ng di E2 al giorno dalle pellicole (1 mm × 1,8 mm) utilizzate qui. I film di poli(pro-E2) a rilascio di bolo rilasciano ulteriori 40 ug di E2 non legato in modo acuto dopo l'impianto.

La ricerca incentrata sull'uso di E2 nei modelli di SCI dei roditori mostra che basse dosi di estrogeni (10 ug/kg) somministrate per via endovenosa attenuano la gliosi reattiva e forniscono neuroprotezione attenuando al tempo stesso gli eventi infiammatori, inibendo l'apoptosi e aumentando l'angiogenesi.21 Al contrario, alte dosi sistemiche di estrogeni hanno effetti avversi che includono un aumento dei tassi di trombosi venosa profonda e di cancro22,23 e lo sviluppo di tratti fisici femminili nei maschi. Ciò è degno di nota poiché la maggior parte della ricerca sull'E2 si è concentrata sulla somministrazione sistemica di E2 per via endovenosa o intraperitoneale.

Considerando i problemi di sicurezza legati all'uso sistemico di alte dosi di E2, è importante ottimizzare la concentrazione di E2 per il rilascio locale al midollo spinale lesionato per prevenire effetti collaterali. Ad oggi, solo uno studio ha rilasciato E2 da un biomateriale utilizzando nanoparticelle per rilasciare localmente E2 (2,5 ug o 25 ug). Il rilascio di nanoparticelle ha rapidamente ridotto l'infiammazione in modo acuto in un modello di ratto con LM contusivo.9 La mancanza di una risposta statisticamente significativa nei nostri dati (Figure 4 e 5) potrebbe essere dovuta a uno squilibrio nella quantità di E2 che stiamo fornendo localmente al midollo spinale con troppo E2 (40 ug) viene rilasciato in modo acuto mentre molto poco (2 ng) viene rilasciato cronicamente.

Sebbene ciò che osserviamo da questi dati siano tendenze modeste, questo studio evidenzia l’importanza del dosaggio di E2 per promuovere la neuroprotezione in vivo. Ridurre il dosaggio iniziale di E2 e regolare la cinetica di degradazione del biomateriale poli(pro-E2) potrebbe aiutare ad alleviare questo problema e potenzialmente fornire migliori risultati neuroprotettivi.

Sebbene questo studio sia stato condotto esclusivamente su maschi, è fondamentale valutare l'effetto di questi film di poli(pro-E2) in entrambi i sessi per stabilire un potenziale traslazionale valido per questo biomateriale. La ricerca ha dimostrato che dopo la SCI, l'aumento dei livelli di estrogeni nelle donne può essere parzialmente responsabile del miglioramento dei risultati funzionali rispetto agli uomini.24 Poiché vi è una maggiore presenza di estrogeni nelle donne, qualsiasi strategia biomateriale che utilizzi estrogeni deve tenere conto di questo aumento del livello e modificare il materiale rilasciare la cinetica di conseguenza per garantire che la dose erogata rimanga la stessa per maschi e femmine.

METODI

Fabbricazione di pellicole in poli(pro-E2).

Il poli(pro-E2) polimero P1 è stato sintetizzato e caratterizzato come descritto in dettaglio in precedenza.20 Il polimero ha un peso molecolare medio ponderale di MW ~ 80 kDa e una dispersità di Đ ~ 3, secondo la cromatografia a permeazione di gel (GPC). I film di poli(pro-E2) sono stati fabbricati sciogliendo il polimero in cloroformio (5% in peso/peso; polimero/cloroformio), colando a goccia la soluzione su vetrini di vetro da 15 mm × 15 mm (100 μL di soluzione per vetrino) e lasciandoli asciugare durante la notte sotto vuoto (<100 mTorr) at room temperature (RT). In a subset of experiments, the polymer solution was supplemented with rhodamine B (0.005 wt %/wt; rhodamine B/chloroform) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) to verify the presence of the poly(pro-E2) films in animals post-implantation.
Per creare film di poli(pro-E2) con E2 non legato, i film sono stati fabbricati aggiungendo E2 non legato (Abcam, Cambridge, MA) alla soluzione polimerica (0.0625 wt %/wt; E2/cloroformio) prima del drop-casting la soluzione sui vetrini coprioggetto. Prima dell'impianto, i vetrini coprioggetto con le pellicole sono stati sterilizzati utilizzando radiazioni ultraviolette (UV) per 30 minuti e i film sono stati staccati dai vetrini coprioggetto in una cabina di biosicurezza sterile. Le pellicole di poli(pro-E2) sono state quindi tagliate in pezzi da 1 mm x 1,8 mm, adatti per l'impianto in un topo adulto come descritto di seguito.

Contusione del midollo spinale e impianto di pellicole Poly(pro-E2).

Tutte le procedure chirurgiche e di assistenza postoperatoria sono state approvate dal Rensselaer Polytechnic Institute e dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali dell'Ohio State University (IACUC). Per indurre una SCI da contusione, topi maschi adulti C57BL/6 (da 10- a 12- settimane), acquistati dal Jackson Laboratory (codice 000664; Bar Harbor, ME), sono stati anestetizzati con un'iniezione intraperitoneale di ketamina (80 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Il dorso degli animali è stato rasato e preparato asetticamente utilizzando etanolo al 70% e betadina.

Dopo il posizionamento dell'animale su un termoforo mantenuto a 37 gradi, gli strati cutanei e muscolari sono stati aperti per esporre la colonna vertebrale ed è stata eseguita una laminectomia dorsale sulla nona vertebra toracica (T9) per esporre il midollo spinale. Una contusione moderata (75 kdyn) è stata indotta a questo livello utilizzando un impattatore Infinite Horizons (Precision Systems and Instrumentation, Lexington, KY).

Dopo aver ottenuto l'emostasi, la dura è stata aperta (Figura 2) e una pellicola di poli(pro-E2) o una pellicola di poli(pro-E2) a rilascio di bolo (1 mm × 1,8 mm) è stata posizionata sotto la dura e sopra il midollo spinale, coprendo il sito della lesione. Negli animali di controllo, la dura è stata aperta ma i film di poli(pro-E2) non sono stati impiantati. Gli strati muscolari sono stati quindi chiusi utilizzando suture sterili e la pelle è stata chiusa utilizzando clip metalliche sterili.

I topi hanno ricevuto 2 ml di soluzione salina sterile iniettati per via sottocutanea e sono stati riportati nelle loro gabbie e posti su uno scaldavetrini impostato a 37 gradi durante la notte. Per garantire un'adeguata idratazione e prevenire le infezioni, ai topi sono stati iniettati per via sottocutanea 1-2 ml di soluzione salina sterile e Gentocin (1 mg/kg) al giorno per i primi 5 giorni successivi alla lesione (dpi). Le vesciche sono state spremute manualmente due volte al giorno per la durata degli esperimenti. Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni convenzionali con un ciclo luce-buio di 12- ore con accesso ad libitum a cibo e acqua.

Raccolta dei tessuti.

Ai punti temporali terminali designati di 7 o 21 dpi, ai topi è stata iniettata una dose letale di ketamina/xilazina (1,5 volte la dose chirurgica) e perfusi per via transcardiaca con soluzione salina tamponata con fosfato 0.1 M (PBS; pH 7,4). seguito da paraformaldeide al 4% (PFA; pH 7,4). I midolli spinali sono stati rimossi, post-fissati per 2 ore in PFA al 4% e quindi trasferiti in tampone fosfato 0.2M (PB; pH 7,4) durante la notte.

I midolli spinali sono stati crioprotetti in saccarosio al 30% per 48 ore a 4 gradi e quindi bloccati in segmenti di 10 mm centrati attorno al sito della lesione con le colonne dorsali rivolte verso l'alto. Queste sezioni sono state incluse in un mezzo a temperatura di taglio ottimale Tissue-Tek (VWR International, Radnor, PA) e congelate rapidamente su ghiaccio secco. Tutti i midolli spinali sono stati sezionati a 10 μm su un criostato Microm HM505E, posizionati su vetrini ColorFrost Plus (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), quindi conservato a -20 gradi fino all'utilizzo per l'immunocolorazione.

Immunoistochimica e quantificazione.

I vetrini sono stati scongelati su uno scaldavetrini per 1 ora e poi risciacquati 3 volte in 0.1 MPBS. L'attività della perossidasi endogena è stata attenuata incubando i vetrini in H2O2 al 6% diluita in metanolo per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver lavato 3 volte in 0.1 M PBS, le sezioni sono state incubate con 4% BSA e 0.1% Triton X-100 in 0.1 M PBS per 1 h seguita da un'incubazione notturna degli anticorpi primari a 4 gradi o RT (Tabella 1).

I vetrini sono stati incubati con anticorpi secondari biotinilati appropriati (1:1000; Vector Laboratories, Burlingame, CA) a temperatura ambiente per 1 ora. Per visualizzare l'anticorpo legato, i vetrini sono stati incubati con Vectastain Elite-ABC (Vector Laboratories) per 1 ora e sviluppati con ImmPACT3,3′-diaminobenzidina (DAB) o substrato Vector SG (Vector Laboratories) per 10 minuti.

Le sezioni sono state disidratate attraverso incubazioni sequenziali di 2 × 2 minuti in etanolo al 70% e 90%, 2 × 3 minuti in etanolo al 100%, seguite da 3 × 3 minuti in Histoclear e infine coperte con Permount (ThermoFisher Scientific). Per l'analisi di quantificazione sono state utilizzate sei sezioni per animale, distanziate di 100 μm nel midollo spinale danneggiato.

Le sezioni immunomarcate sono state riprese utilizzando un microscopio per immagini Axioplan 2 dotato di fotocamera digitale AxioCam e software AxioVision versione 4.8.2 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Germania) e un obiettivo 5×.

Il numero di pixel positivi in ​​ciascuna sezione è stato conteggiato utilizzando il software di analisi delle immagini MIPAR (MIPAR, Worthington, OH) per calcolare la frazione percentuale di area positiva per sezione. Per ciascuna macchia è stata calcolata e riportata la percentuale media dell'area positiva delle sei sezioni per animale.

Analisi statistica.

Tutti i dati sono riportati come media ± deviazione standard. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software statistico GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, San Diego, CA). In tutti gli esperimenti sono stati utilizzati 5-6 animali per gruppo, provenienti da almeno due lotti diversi. Per testare le differenze tra i gruppi di film di controllo e poli(pro-E2), è stato utilizzato il test t di Student (Figure 3, 4 e 5). La significatività è stata stabilita a p Inferiore o uguale a 0.05.

Materiale supplementare

Fare riferimento alla versione Web su PubMed Central per materiale supplementare.

RICONOSCIMENTI

Gli autori ringraziano Wenmin Lai per la sua assistenza con gli interventi chirurgici sui topi.

Finanziamento

Questo lavoro ha ricevuto il sostegno della Craig H. Neilsen Foundation Fellowship (Grant 468116) e della Paralyzed Veteransof America Research Foundation Fellowship (Grant 3171) a MKG e del NIH R01 (Grant NS092754) e del New York State Spinal Cord Injury Review Board Institutional Support Grant C32245GG a RJG Tutto il lavoro sugli animali è stato eseguito con l'assistenza del centro chirurgico del dipartimento di neuroscienze dell'Ohio State University, supportato dal NINDS Grant P30NS104177.

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