Il vaccino contro l'adenovirus contenente la subunità S1 della proteina Spike troncata del SARS-CoV-2 porta a una risposta immunitaria specifica nei topi

AstrattaCT:Lo sviluppo di un vaccino efficace e sicuro contro la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) rappresenta un approccio cruciale per la gestione della pandemia di grave malattia respiratoria acuta da coronavirus 2 (SARS-CoV-2) alla luce delle condizioni attuali. In questo studio, abbiamo prodotto un segmento accorciato del gene ottimizzato del picco SARS-CoV-2 (2043 bp, denominato S1) che era in grado di codificare una proteina S1 troncata. La proteina è stata testata per determinare se potesse suscitare un'immunizzazione efficace nei topi contro la SARS-CoV-2. La presenza della proteina S1 è stata confermata mediante immunofluorescenza e Western blotting. Un vaccino contro l'adenovirus recante il frammento del gene S1 (Ad-S1) è stato somministrato per via intramuscolare ai topi quattro volte nell'arco di 4 settimane. L’immunità umorale alla proteina SARS-CoV-2 S1 è stata dimostrata in tutti i topi immunizzati. Il siero dei topi immunizzati ha dimostrato un'eccellente attività anti-infettiva in vitro. Una robusta risposta immunitaria umorale contro il SARS-CoV-2 è stata osservata nei topi dopo la vaccinazione con Ad-S1, suggerendo che il vaccino adenovirus può aiutare lo sviluppo di vaccini contro il SARS-CoV-2 e altri virus geneticamente distinti virus.

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Parole chiave: SARS-CoV-2; vaccini; vettore adenovirale; gene S1; immunità

1. Introduzione

La malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) è spesso associata a insufficienza multiorgano e tassi di mortalità elevati [1] e rappresenta una grave minaccia per la sicurezza pubblica in tutto il mondo. Al 15 luglio 2022, la pandemia di COVID-19 persisteva a livello globale, con 557.917.904 casi confermati, inclusi 6.358.899 decessi, segnalati all'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Inoltre, all’11 luglio 2022 sono state somministrate un totale di 12.130.881.147 dosi di vaccino. Pertanto, la progettazione e lo sviluppo di nuovi vaccini contro il coronavirus (nCoV) sono di grande importanza e una delle massime priorità sanitarie globali. La proteina S è un fattore chiave nell’ingresso della malattia respiratoria acuta grave coronavirus 2 SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) nelle cellule ospiti [2,3]. La proteina si lega al recettore ospite e consente al virus di entrare senza problemi nella cellula ospite [4]. I glicani N-legati sporgono dalla superficie del trimero e decorano ampiamente la proteina S, influenzando il ripiegamento della proteina S, l'immunità umorale e l'elaborazione della proteasi della cellula ospite [5]. La proteina S di SARS-CoV-2 ha una densità di glicani legati all’N inferiore rispetto ad altre proteine ​​S indotte da coronavirus patogeni umani [6]. Pertanto, la proteina S può essere altamente immunogenica ed è un obiettivo importante degli anticorpi neutralizzanti. La proteina S ha tre domini strutturali, tra cui il dominio S1 è il più importante antigene di superficie della proteina S [4]. A causa della difficoltà di produrre grandi proteine ​​ricombinanti (il dominio extracellulare della proteina S è di circa 1300 aminoacidi) e del rischio di potenziamento anticorpo-dipendente (ADE) dell'infezione, S1 (circa 700 aminoacidi) e il suo dominio di legame con il recettore (RBD, circa 200 aminoacidi) sono ampiamente considerati come i potenziali bersagli più attraenti per un vaccino contro il coronavirus [7,8]. Il sierotipo 5 dell’adenovirus umano (HAdV-C5) è ampiamente utilizzato nella virologia di base come terapia genica e vettore di somministrazione di vaccini [9]. HAdV-C5 presenta una diversità naturale e può parassitare la maggior parte degli ospiti, il che costituisce la base per lo sviluppo di esperimenti sugli animali. I vettori di adenovirus ricombinanti con replicabilità e difetti di replicazione costruiti a partire da HAdV-C5 sono stati ampiamente utilizzati nella somministrazione di vaccini e nella terapia genica [9,10]. Attualmente, gli adenovirus sono stati approvati come vaccini contro le infezioni respiratorie acute e sono stati condotti numerosi studi su tali vaccini, ad esempio contro la malaria e l'HIV-1 [9]. In questo articolo descriviamo un vaccino vettoriale adenovirus carente di replicazione umana della SARS-CoV-2 e la sua preparazione e applicazione. In questo studio, il vaccino contro l'adenovirus è stato costruito come segue: il vettore era un adenovirus umano HAdV-C5 difettoso nella replicazione con delezione E1 ed E3, il plasmide scheletrico era un adenovirus ricombinante con pBHGlox∆E1,3Cre, la linea cellulare di confezionamento era costituita da cellule HEK293, e il gene bersaglio era il gene della proteina S1 troncata di SARS-CoV-2. L'espressione della proteina S1 nel vaccino è stata identificata mediante test Western blot e immunofluorescenza. Per determinare la qualità delle risposte immunitarie indotte dai candidati vaccini basati su spike, la risposta anticorpale post-vaccinazione è stata esaminata in dettaglio. Il beneficio immunitario del vaccino è stato valutato con un test anticorpale legante (saggio immunoassorbente legato all’enzima [ELISA]) e un test anticorpale di neutralizzazione. I nostri risultati forniscono la base per lo sviluppo e la valutazione di vaccini e trattamenti COVID-19 basati sulla proteina S1.

2. Materiali e metodo

2.1. Cellule e animali

In questo studio sono state utilizzate le linee cellulari renali di scimmia HEK293 e Vero E6. Entrambe le linee cellulari sono state coltivate nel terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 2% di siero bovino fetale (FBS) e l'1% di penicillina e streptomicina a 37 ◦C con il 5% di CO2 e umidità satura. Venti topi C57BL/6 femmine (6-8 settimane) sono stati acquistati dal Zhejiang Animal Experimental Center, provincia di Zhejiang. I topi sono stati divisi casualmente in due gruppi con 10 topi in ciascun gruppo. Un gruppo è stato immunizzato (iniezione intraperitoneale da 100 µL) con un vettore Ad5 che esprime la proteina spike SARS-CoV-2 (Ad5-S) e l'altro con PBS (iniezione intraperitoneale da 100 µL) come controllo. La quantità totale di virus era 5 × 109 VP. Tutti i topi sono stati immunizzati con iniezione intramuscolare D0/D14 [11,12]. Al giorno 14, è stato prelevato 100 µl di sangue periferico, il siero è stato separato e la seconda iniezione è stata somministrata due ore dopo il prelievo del sangue. Al giorno 28, il sangue è stato raccolto mediante puntura retroorbitaria e il siero è stato separato. Gli anticorpi leganti sono stati rilevati 3 giorni dopo ogni prelievo di sangue, gli anticorpi neutralizzanti sono stati rilevati 7 giorni dopo ogni prelievo di sangue e le citochine sono state rilevate 7 giorni dopo il secondo prelievo di sangue. Tutti i topi sono stati soppressi; tutti i test sono stati condotti in stretta conformità con le "Linee guida per la cura e l'uso degli animali da esperimento della Repubblica popolare cinese" e approvati dal Consiglio etico dell'Università di Zhejiang Shuren.

2.2. Vaccini

Tutti i ceppi SARS-CoV-2 utilizzati in questo studio sono stati raccolti da pazienti COVID-19 con consenso. Il Laboratorio statale per la diagnosi e il trattamento delle malattie infettive ha sviluppato un vaccino contro l'adenovirus (cellule Vero, ceppo WuHan, numero GISAID: EPI_ISL_415711) contro la SARS-CoV-2 e poi il il vaccino è stato prodotto in un ambiente conforme al livello di biosicurezza (BSL). La specifica del vaccino è 0,5 ml/dose e contiene Tris, NaCl, zucchero di canna, MgCl2,6H2O, C6H9N3O2, etanolo assoluto e la proteina SARS-CoV-2 S1.

2.3. Costruzione di adenovirus ricombinante

La sequenza proteica SARS-CoV-2 S1 (n. QRU91950.1) è stata ottenuta da PubMed. Secondo la degenerazione genetica, la sequenza nucleotidica del codone ottimizzata adatta per l'espressione nelle cellule di mammifero è stata progettata sulla base della premessa che la sequenza aminoacidica della proteina prodotto codificata dalla proteina SARS-CoV-2 S1 rimaneva invariata. La lunghezza totale era di 2043 bp. La sequenza precursore 50 è stata sintetizzata con l'attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) e la sequenza che codifica l'amminoacido 2–688 di SARS-CoV-2 S1 e la sequenza precursore del tPA sono state legate. Una sequenza Kozak e un sito di restrizione SpeI sono stati aggiunti davanti al codone di inizio e il sito di restrizione XbaI è stato aggiunto dopo il codone di terminazione. Le sequenze nucleotidiche dei geni sopra indicati sono state sintetizzate e clonate in pUC18 dalla Sangon Biotech per ottenere il plasmide clonato del gene sintetico. La sequenza del gene S1 sintetizzato e il vettore pDC316 sono stati digeriti con endonucleasi di restrizione SpeI e XbaI. Il frammento bersaglio e il vettore sono stati recuperati dal gel e collegati per formare un plasmide navetta. Il plasmide navetta SARS-CoV-2 è stato confezionato con il plasmide scheletrico del sistema adenovirus AdMax pBHGloxd∆E1 e 3Cre mediante co-trasfezione di cellule HEK293. La soluzione del virus primario è stata ottenuta dopo ripetuti congelamento-scongelamento e centrifugazione, e il virus è stato amplificato e coltivato dopo la purificazione della placca.

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2.4. Determinazione del titolo dell'adenovirus

Le cellule HEK293 in buona salute sono state selezionate e risospese per preparare una sospensione cellulare da 5,0 × 105 cellule/ml, che è stata seminata in una piastra a 24-pozzetti (1 ml/pozzetto ) e coltivati ​​a 37 ◦C in un ambiente al 5% di CO2. Il campione è stato diluito in serie dieci volte e un campione diluito (0,1 mL) da 10−5 a 10−8 cellule è stato inoculato su una piastra a pozzetti 24- . Quindi, le piastre sono state esposte all'infezione a 37 ◦C con il 5% di CO2 per 48 ore. Successivamente, il terreno di coltura è stato rimosso, è stato aggiunto metanolo preraffreddato (0,5 mL) e i campioni sono stati fissati a -20 ◦C per 20 minuti. Dopo la fissazione, i campioni sono stati lavati con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e bloccati con albumina di siero bovino all'1% (BSA, 0,2 mL) a 37 ◦C per 1 ora. Successivamente, gli anticorpi primari (Mouse Anti-Adenovirus Hexon, AbD Serotec 04000079, 1:2000) e secondari (Goat pAb to MS IgG2a(HRP), Abcam ab97245, 1:1000) sono stati aggiunti e incubati per 1 ora, durante la quale PBS serviva per lavarsi. Dopo l'incubazione, è stata aggiunta una soluzione di lavoro appena preparata (0,2 mL) e incubata per 5–10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, la soluzione di lavoro è stata scartata, i campioni sono stati lavati con PBS ed è stato aggiunto nuovamente PBS (1 mL). È stato calcolato il numero medio di cellule positive nel campo microscopico (cat. CKX53, OLYMPUS Research Inverted System Microscope), selezionando un gradiente con 5-50 cellule positive nel campo visivo e almeno cinque aree sono state selezionate casualmente per il conteggio . È stato calcolato il numero di campi visivi in ​​ciascun pozzetto della piastra a pozzetti 24-. Quindi, il titolo del virus è stato calcolato secondo la seguente formula (1):

2.5. PCR in tempo reale

Per rilevare l'espressione dell'mRNA delle cellule HEK293 in seguito a un'infezione virale, abbiamo estratto l'RNA intermedio secondo le istruzioni operative TRIzol (Invitrogen, Waltham, MA, USA). L'RNA totale è stato estratto utilizzando TRIzol ed elaborato con DNasi I priva di RNasi RQ1 (Promega, Madison, WI, USA) per eliminare il DNA residuo. Il DNA complementare (cDNA) è stato ottenuto mediante trascrizione inversa dell'RNA estratto utilizzando un kit di reagenti PrimerScript™ RT con gDNA Eraser Kit (Takara, Kusatsu, Giappone). I frammenti di DNA sono stati generati con i primer specifici P1 (50 -GGTGATTCTTCTTCAGGTTGGA-30) e P2 (50 - GTTTCTGAGAGAGGGTCAAGTG-30) ​​del gene bersaglio (S1). Il gene è stato amplificato con i primer P3 (50 -GTCTTCACCACCATGGAGAA-30 ) e P4 (50 -TAAGCAGTTGGTGGTGCAG-30 ) come controllo interno (GAPHD).

2.6. Western Blot

Il lisato cellulare e il surnatante sono stati separati mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e quindi trasferiti su membrane di polivinilidene fluoruro (PVDF). Le macchie sono state visualizzate con apparecchiature di imaging Western blot (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). In breve, le membrane sono state trasferite in TBST (50 mL Tris-HCl, pH 7,5, 8 g NaCl [0,5 mL], 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween -20) con il 5% di latte in polvere scremato in polvere e agitato su uno shaker decolorante a temperatura ambiente per 1 ora. Le membrane dei gruppi sperimentale e di controllo sono state rimosse dalla soluzione sigillante e incubate con l'anticorpo primario: [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:5000, cat. #40591- T62, Sino Biological, Pechino, Cina)] a temperatura ambiente. Gli anticorpi primari sono stati agitati e incubati per una notte su un agitatore decolorante a 4 ◦C. La macchia è stata risciacquata con una soluzione TBST e incubata per 2 ore con l'anticorpo secondario [immunoglobulina G (IgG) H&L (HRP) anti-coniglio di capra (1:10.000, cat. # ab6721, Abcam, Cambridge, UK)]. Dopo il risciacquo, le macchie sono state incubate per 1 minuto con un kit di soluzioni di substrato ECL LumiBest (cat. #4AW011-100, 4A Biotech) e quindi osservate in un imager.

2.7. Saggio di immunofluorescenza

Le cellule HEK293 (3 × 106/pozzetto) sono state seminate in piastre a pozzetti 12-. Dopo 48 ore, le cellule sono state infettate con adenovirus contenente il gene S1 (Ad-S1). Dopo 48 ore, il mezzo è stato aspirato e le cellule sono state lavate una volta con PBS contenente il 2% di BSA e fissate per 15 minuti con metanolo pre-raffreddato per 15 minuti a -20 ◦C. Dopo tre lavaggi con BSA al 2% in PBS, le cellule sono state permeabilizzate con Triton X-100 allo 0,5% per 10 minuti. Quindi, le cellule sono state bloccate per 1 ora con 2 mL di BSA al 2%, la soluzione bloccante è stata scartata e le cellule sono state lavate tre volte con PBS. Successivamente, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 2 ml di anticorpo primario [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] e incubato a temperatura ambiente per 1 ora o 4 ◦C durante la notte. Quindi, il campione è stato risciacquato tre volte con BSA al 2% per 5 minuti per risciacquo. Successivamente, 2 mL di anticorpo secondario [IgG anti-coniglio di capra H&L (Alexa Fluor 488) (1:1000, cat. n. 550037, ZenBio)] sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e incubati a temperatura ambiente per 1 ora. Successivamente, i campioni sono stati risciacquati tre volte con BSA al 2% per 5 minuti per risciacquo. A ciascun pozzetto è stata aggiunta una soluzione di 40,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (2 mL, 1 mg/mL) (1:400, cat. #S0001, Bioss, Woburn, MA, USA) e ha reagito per 10 minuti al buio. L'analisi è stata osservata con un sistema di imaging EVOS™ M7000 (cat. #AMF7000, Invitrogen).

2.8. ELISA

La proteina SARS-CoV-2 S (1 µg/mL) è stata rivestita durante la notte in piastre a 96-pozzetti (100 µL/pozzetto) con 0. 0Tampone bicarbonato 5 M. Dopo il lavaggio con PBST (0,2 g KH2PO4, 2,9 g Na2HPO4·12H2O, 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 0,5 mL Tween-20, aggiungere acqua a 1000 mL) cinque volte, è stata aggiunta la soluzione bloccante e incubata a 37 ◦C per 1 ora. Il campione di siero è stato diluito e aggiunto a ciascun pozzetto (100 µl/pozzetto). Dopo 1 ora di incubazione a 37 ◦C, i campioni sono stati lavati con PBST cinque volte. L'anticorpo primario [SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Antibody (1:2000, cat. #40591-T62, Sino Biological)] è stato aggiunto e incubato per 1 ora, quindi i campioni sono stati lavati cinque volte con PBST, seguiti da 1 ora di incubazione a 37 ◦C con anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano [IgG anti-coniglio di capra H&L (HRP) (1:10.000, cat. #ab6721, abcam)] e cinque si lava con PBST. Dopo aver aggiunto 3, 30, 5 e 50-tetrametilbifenilanidride per 5 minuti, la reazione è stata interrotta con acido solforico 2 M. La densità ottica è stata misurata a 450 nm e 630 nm mediante uno strumento di marcatura enzimatica (Molecular Devices, SpectraMax 190) e quindi adattata a una curva standard.

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2.9. Determinazione delle citochine 

La piastra (cat. #T-k15048D-1, MSD) è stata lavata tre volte con 150 µL/pozzetto di tampone di lavaggio e a ciascun pozzetto è stato aggiunto un campione preparato da 50 µL. Quindi, la piastra è stata sigillata con un sigillo adesivo e incubata a temperatura ambiente agitando per 2 ore. Successivamente, la piastra è stata lavata tre volte con 150 µl di tampone di lavaggio per pozzetto e a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 25 µl di soluzione di anticorpo di rilevamento. La piastra è stata nuovamente sigillata e incubata a temperatura ambiente sotto agitazione per 2 ore. Successivamente, la piastra è stata lavata tre volte con almeno 150 µl/pozzetto di tampone di lavaggio; A ciascun pozzetto sono stati aggiunti 150 µl di 2× Read Buffer T (MSD) e la piastra è stata analizzata su uno strumento MSD.

2.10. Anticorpo neutralizzante

2.10.1. Saggio di neutralizzazione dello pseudovirus

L'attività di neutralizzazione del siero murino è stata testata utilizzando un sistema pseudovirale del virus della stomatite vescicolare (VSV). Il siero è stato inattivato a bagnomaria per {{0}},5 ore a 56 ◦C, quindi diluito in serie fino all'intervallo richiesto. Le cellule HEK293 sono state piastrate in una piastra a pozzetti 96-. Il siero diluito è stato miscelato con 200 CCID50 (la dose virale che può infettare il 50% della coltura cellulare)/100 µL della sospensione virale in un rapporto di 1:1 e posto in un incubatore a CO2 (37 ± 1 ◦C) per 2 ore Successivamente, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 µl di soluzione di mantenimento del virus contenente doppio anticorpo penicillina-streptomicina allo 0,5% e la miscela neutralizzata è stata inoculata in una piastra a pozzetti 96- contenente cellule a 100 µl per pozzetto, con due pozzetti ripetuti per ogni diluizione. Allo stesso tempo, è stato impostato un controllo cellulare normale e le cellule sono state incubate in un incubatore a CO2 (37 ± 1 ◦C) per 96 ore. Quindi, 200 CCID50/100 µL di soluzione virale sono stati diluiti in 10-1~10-3. Il terreno di coltura cellulare nella piastra a pozzetti 96- è stato scartato, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 150 µl della soluzione di mantenimento del virus e la diluizione della soluzione virale è stata inoculata a una concentrazione di 10-1~{{33} } nei pozzetti della piastra a pozzetti 96- (50 µl per pozzetto). Ciascuna diluizione è stata ripetuta in 8 pozzetti; Allo stesso tempo è stato impostato un controllo cellulare normale, seguito da coltura per 96 ore. I cambiamenti nel CPE cellulare sono stati osservati al microscopio invertito. Il controllo cellulare normale non dovrebbe presentare cambiamenti citopatici e il controllo positivo dovrebbe presentare cambiamenti CPE. Gli endpoint di neutralizzazione (diluizioni di siero convertite in logaritmi) sono stati calcolati osservando il CPE. Il criterio sieronegativo/positivo era 1:12 come criterio positivo/negativo,<1:12 was negative, and ≥1:12 was positive. 

2.10.2. Saggio di neutralizzazione dal vivo

L'attività di neutralizzazione del siero murino è stata valutata mediante un test di neutralizzazione in vivo. Il siero diluito è stato miscelato con SARS-CoV-2 e incubato a 37 ◦C per 1 ora. La miscela è stata aggiunta a una piastra a pozzetti 96- per infettare le cellule Vero E6. Dopo 72- ore di incubazione a 37 ◦C, l'effetto citopatico del virus (CPE) è stato osservato con un ingrandimento x40 ed è stato calcolato il titolo di neutralizzazione (il reciproco della diluizione del siero al 50% richiesta per neutralizzare l'infezione virale). Le procedure di cui sopra sono state tutte eseguite in un ambiente di livello 3 di biosicurezza.

2.11. Analisi statistica

Le analisi statistiche sono state eseguite mediante un t-test a due campioni utilizzando SPSS 26. I valori p inferiori o uguali a 0,05 sono stati considerati significativi. La tendenza centrale è stata misurata con la media geometrica del titolo (GMT).

3. Risultati

3.1. Costruzione di adenovirus ricombinante

È stato ottenuto il plasmide navetta dell'adenovirus ricombinante pAdeno-CMV-S1 con inserimento corretto; il suo diagramma strutturale è mostrato nella Figura 1. L'adenovirus ricombinante conteneva il genoma HAdV-C5 privo della regione E1/E3. Un diagramma schematico del vettore dell'adenovirus ricombinante ottenuto dalla trasfezione del plasmide navetta e del plasmide citoscheletro nelle cellule HEK293 è mostrato nella Figura 1.

3.2. Caratterizzazione dell'adenovirus ricombinante

Il plasmide ricombinante contenente il gene bersaglio è stato identificato mediante PCR (vedere la Figura 2A per i risultati dell'elettroforesi su gel). Questo è stato un esperimento ripetuto. Le sequenze di primer erano MCMV-F ggtataagaggcgcgaccag e S1-R acaataagtagggactgggtc e il sequenziamento ha confermato che la sequenza era coerente con il disegno. L'espressione di SARS-CoV-2 S1 nelle cellule è stata rilevata con Western blotting (Figura 2B) e immunofluorescenza indiretta (Figura 2C). La colorazione della banda (~75 kDa) è stata rilevata mediante Western blotting ed era coerente con la posizione prevista della banda. A livello trascrizionale, l'espressione in vitro di S1 ​​è stata rilevata mediante PT-PCR. I risultati hanno mostrato che l'espressione dell'mRNA S1 nelle cellule HEK-293 era significativamente più alta rispetto a quella del gruppo di controllo.

Figura 1. Costruzione del vaccino contro l'adenovirus ricombinante e strategia sperimentale. (A) pAdeno-CMV-S1 è un plasmide navetta di adenovirus ricombinante contenente il gene bersaglio S1. pBHGlox∆E1,3Cre è il plasmide dello scheletro dell'adenovirus. pBHGlox∆E1,3Cre e pAdeno-CMV-S1 sono stati estratti con un kit di estrazione del plasmide QIAGEN (Beijing North Yitao Trading Co., LTD., Pechino, Cina). Un giorno prima della trasfezione, le cellule HEK293 sono state fatte passare in una fiasca di coltura cellulare da 25 cm2. Il terreno di coltura era DMEM contenente il 5% di FBS senza antibiotici. Il secondo giorno, è stato selezionato il 60-80% delle cellule e alle cellule è stata aggiunta la soluzione di trasfezione. Dopo 7 giorni di trasfezione, le cellule sono state raschiate via, centrifugate, il surnatante scartato e le cellule sono state rianimate con PBS. Le cellule sono state congelate e scongelate ripetutamente a -80 ◦C e 37 ◦C. Dopo la centrifugazione, il surnatante conteneva la soluzione del virus primario. Il ceppo di adenovirus ricombinante è stato purificato, amplificato e ottenuto dopo ulteriore elaborazione e designato Ad-S1. Il vaccino è stato iniettato per via intramuscolare nei topi per studi di follow-up. (B) La scala temporale rappresentata dell'immunizzazione e del prelievo di sangue.

3.3. Titolo dell'adenovirus

In questo esperimento, è stata calcolata una media di sei cellule positive in cinque campi microscopici e il virus nel pozzetto è stato diluito 108 volte. In base alla formula descritta nella sezione Materiali e metodi, il titolo dell'adenovirus era 4,74 × 1011 unità formanti placca (pfu)/mL (Figura 2D).

3.4. Immunità cellulare post-vaccinazione

Durante il periodo di test, si sono verificati cambiamenti statisticamente significativi nelle citochine sieriche (p inferiore o uguale a 0.05), che hanno dimostrato principalmente che la concentrazione del chemoattrattante dei cheratinociti/oncogene regolato dalla crescita umana (KC/GRO) era diminuite e le concentrazioni di IFN- , IL-10, IL-12p70, IL-1 , IL-2, IL-4, IL{{10} } e TNF- sono aumentati, mentre la concentrazione di IL-6 non è stata modificata in modo significativo (Figura 3).

Figura 2. Identificazione della proteina ricombinante HAdV-C5–SARS-CoV-2 S1 e determinazione del titolo dell'adenovirus. (A) Rilevazione tramite PCR del plasmide ricombinante con il gene bersaglio S1. (B) Rilevamento Western blot di SARS-CoV-2. Le cellule HEK293 a crescita esponenziale sono state infettate con SARS-CoV-2 per 48 ore, quindi la proteina cellulare è stata estratta e separata mediante SDS-PAGE. L'espressione di SARS-CoV-2 è stata confermata mediante Western blotting con IgG anti-coniglio di capra. (C) Microscopia a immunofluorescenza di cellule HEK-293 infettate con Ad-S1 (verde). Le cellule sono state controcolorate con 40, 6-diamidino- 2-fenilindolo (DAPI) per colorare i nuclei. Barra della scala 1000 µm. (D) Per la misurazione è stato utilizzato il test della placca. Micrografie raffiguranti la diluizione 10-5, 10-6, 10-7 e 10-8 (da sinistra a destra).

Figura 3. Ad-S1 ha indotto livelli plasmatici alterati di citochine di tipo 1/2, interferoni di tipo 1 e altre citochine. I risultati sono stati rilevati prelevando il sangue dai topi 7 giorni dopo la prima immunizzazione. I dati sono presentati come grafici a dispersione a scatola e baffi. Ogni cerchio rappresenta un singolo individuo. I valori p sono stati calcolati utilizzando un test t a due campioni.

3.5. Rilevazione degli anticorpi anti-SARS-CoV-2 S1 post-immunizzazione

ELISA ha rivelato che anticorpi specifici per SARS-CoV-2- erano presenti nei topi a cui era stato iniettato il primo e il secondo Ad-S1, ma non in quelli a cui era stato iniettato il capside dell'adenovirus di controllo o la soluzione PBS (Ad/PBS) (Figura 4A). Titoli di IgG pari a 1:210 e 1:212 sono stati rilevati nei topi vaccinati con Ad-S1- due settimane dopo rispettivamente la prima e la seconda immunizzazione. Il titolo di diluizione a 28 giorni dopo la vaccinazione (D28, GMT 2297.4) era 6.1-volte superiore a quello del D14 (GMT 378.9).

Figura 4. Ad-S1 ha indotto titoli elevati di anticorpi (A) e attività di neutralizzazione (B, C) nei topi. (A) ELISA di IgG sieriche specifiche per SARS-CoV-2-da topi immunizzati con Ad-S1-. (B) Analisi delle attività dello pseudovirus nel siero dei topi immunizzati con Ad-S1-. (C) Analisi delle attività neutralizzanti del siero dei topi immunizzati con Ad-S1-

3.6. Saggio degli anticorpi neutralizzanti

Il test SARS-CoV-2 delle cellule Vero E6 ha consentito il rilevamento dell'attività neutralizzante nel siero di topo immunizzato (Figura 4B, C). I titoli di neutralizzazione D14 e D28 delle cellule Vero E6 immunizzate con Ad-S1- contro il virus vivo SARS-CoV{{10}} in vitro erano rispettivamente 1:24,3 e 1:26,3. Il test dello pseudovirus ha prodotto risultati simili a quelli del test del virus vivo, con titoli di neutralizzazione fino a 1:28,1 e 1:29,6 al D14 e al D28, rispettivamente. Il titolo neutralizzante dello pseudovirus D28 (GMT 769.0) era 2.7-volte superiore a quello del D14 (GMT 283.7).

4. Discussione

We have been working to develop vaccines to stop the COVID-19 pandemic and its rapid spread. The hunt for an effective vaccination against SARS-CoV-2 continues and existing vaccine development strategies include whole virus particle vaccines, live attenuated virus vaccines, purified virus subunit vaccines, and genetic vaccines [13–17]. The epitopes on spike proteins detected in infected serum are highly antigenic, with the ability to induce a strong humoral immune response and neutralize antibodies in individuals infected with SARS-CoV-2 and recovered from COVID-19 [18,19]. The S protein appears to be an ideal target for vaccination against SARS-CoV-2 infection [20]. The S protein S1 subunit induced effective immunity against SARS-CoV-2 and protected against SARS-CoV-2 in animal models [21,22]. The SARS-CoV-2 truncated N protein has a better expression effect than the N protein [23]. Based on this, we selected the truncated S1 protein in this experiment. In other studies, more than 90% of the neutralization activity of the Moderna mRNA vaccine was caused by the RBD antibody, and the neutralization titer directly decreased from >1000 a<25 after the RBD antibody had been eliminated [24]. Higher levels of RBD-specific IgG were associated with increased serum neutralization [25]. Evidently, the S protein demonstrates a greater immune response to the RBD region, and the S1 protein containing RBD can induce neutralizing antibodies with a higher titer than the S protein [26]. Antigens delivered by adenovirus vectors induce strong cellular and humoral immunity after a single immunization, making them useful as an emergency prevention tool in a pandemic [27]. Adenovirus-based vaccine strategies are therefore an important part of the fight against SARS-CoV-2 infection.

In questo studio, abbiamo costruito un vaccino ricombinante dell'adenovirus SARS-CoV-2 contenente la subunità S1 del SARS-CoV-2 e lo abbiamo designato Ad-S1. Come CanSinoBIO, che è stato approvato per la commercializzazione [28], in questo vaccino abbiamo utilizzato HAdV-C5. L'adenovirus è ampiamente utilizzato nella terapia genica ricombinante e come vettore di vaccini. Tuttavia, il tasso sieropositivo di HAdV-C5 raggiunge il 75-80% nella popolazione normale [29]. Ciò implica che l’immunità pre-immagazzinamento contro i vettori HAdV-C5 riduce significativamente l’immunità indotta dal vaccino. Sviluppato presso l’Università di Oxford nel Regno Unito, ChAdOx1 nCoV-19 utilizza un vettore di adenovirus dello scimpanzé che, al contrario, ha un tasso sieropositivo inferiore negli esseri umani e, quando positivo, di solito presenta un titolo anticorpale sierico inferiore [30] . Pertanto, i vettori di adenovirus che possono eludere l’immunità preesistente possono essere esplorati per migliorare l’efficacia protettiva del vaccino contro l’adenovirus. Nel presente studio, lo stato del siero dei topi prima e dopo l'immunizzazione è stato determinato mediante ELISA e test di neutralizzazione e ha fornito prove di immunità umorale per i candidati al vaccino. Il siero prodotto dopo l'iniezione intramuscolare del vaccino nei topi ha protetto efficacemente le cellule Vero E6 dall'infezione da SARS-CoV-2 in vitro (Figura 4). Abbiamo anche rilevato una risposta immunitaria più forte e una migliore protezione nei topi dopo una seconda immunizzazione (Figura 4). I nostri risultati sperimentali sono simili ai risultati sperimentali tradizionali.

Mentre la ricerca sulla SARS-CoV-2 continua, diversi studi hanno dimostrato che la tempesta di citochine secondaria all'infezione da SARS-CoV-2 può influenzare la produzione di cellule T, rendendo difficile per i pazienti mantenere l'immunità a lungo termine verso SARS-CoV-2 [31]. Pertanto, è necessario determinare se Ad-S1 può indurre l'immunità mediata dalle cellule T nei topi. I nostri risultati hanno dimostrato che le concentrazioni di IFN e IL-12 sono aumentate e le concentrazioni di IL-4 sono diminuite nel gruppo Ad-S1, indicando che la sopravvivenza e la crescita delle cellule Th1 indotte dal vaccino nei topi. La secrezione di IL-12, IL-10 e TNF da parte delle cellule Th1 è aumentata leggermente nel gruppo sperimentale. Questi risultati hanno indicato che Ad-S1 ha effettivamente indotto una risposta delle cellule T Th1-distorta nei topi [32]. L'aumento dell'IL-5 indica che anche le cellule Th2 partecipano alla risposta immunitaria e producono determinati effetti. La concentrazione di KC/GRO nel gruppo sperimentale era significativamente ridotta rispetto a quella del gruppo di controllo PBS, il che potrebbe essere dovuto alla ridotta chemiotassi dei neutrofili che ha soppresso la risposta infiammatoria e ha consentito di controllare leggermente gli effetti collaterali del vaccino. Ciò sarebbe più vantaggioso per le persone immunocompromesse, come gli anziani o i pazienti sottoposti a chemioterapia. Li M., et al. [29] hanno sviluppato un vaccino contro l'adenovirus utilizzando l'Ad68 come vettore. I risultati hanno mostrato che l’attività neutralizzante in vivo del SARS-CoV-2 poteva essere rilevata entro due settimane dall’immunizzazione intramuscolare dei topi BALB/c e poi continuava ad aumentare, e il titolo anticorpale di neutralizzazione (PRNT ID50) raggiungeva 957,3 all’ottavo settimane. Nel frattempo, nello studio di Liu J., et al. [33], sono stati sviluppati vaccini che utilizzano AdC6 e AdC68 come vettori; sia la risposta anticorpale legante che quella neutralizzante dopo l'immunizzazione sono state generate 14 giorni dopo la dose, con un titolo IgG di 7108 (titolo medio geometrico, GMT; AdC6) e 5489 (GMT, AdC68). Il titolo di neutralizzazione 50 (NT50) del test di neutralizzazione dello pseudovirus era 125 (GMT, AdC6) e 67 (GMT, AdC68).

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

Nel presente studio, i topi vaccinati con Ad-S1 avevano titoli IgG di 1:1010 e 1:122 rilevati mediante ELISA due settimane dopo la prima e la seconda immunizzazione, rispettivamente. Il titolo di diluizione di ad-s1 era 378,9 (GMT) a 14 giorni dopo l'inoculazione e 2297,4 (GMT) a 28 giorni dopo l'inoculazione. Nel test sugli anticorpi di neutralizzazione, le cellule Vero E6 immunizzate con Ad-S1 hanno mostrato una neutralizzazione 1:24,3 e 1:26,3 al D14 e al D28 contro il virus vivo SARS-CoV-2 in vitro, rispettivamente. I titoli di neutralizzazione dello pseudovirus al D14 e al D28 erano rispettivamente 283,7 (GMT) e 769,0 (GMT). Pertanto, il vaccino in questo studio è risultato più efficace in termini di risposta immunitaria nel modello murino.

A causa delle limitazioni delle condizioni sperimentali, non abbiamo eseguito l'analisi ELISpot (enzima-linked immunosorbent spot) delle cellule immunitarie della milza dei topi sperimentali. Inoltre, non è stato possibile eseguire esperimenti di protezione dagli attacchi di SARS-CoV-2 sui topi a causa delle limitazioni del laboratorio di protezione fisica. Tuttavia, abbiamo determinato che il vaccino aveva un’elevata efficacia nei modelli murini e poteva essere utilizzato come ceppo vaccinale di riserva ideale. Inoltre, l'immunogenicità, la sicurezza e l'efficacia dei potenziali candidati al vaccino contro la SARS-CoV-2 dovrebbero essere esaminate in ulteriori modelli animali (ad es. conigli, primati, procioni, cani), poiché i modelli murini potrebbero non duplicare completamente il sistema immunologico umano. caratteristiche.

Cistanche pianta che aumenta il sistema immunitario

5. Conclusioni

I dati ottenuti dai nostri studi preclinici sul vaccino contro l’adenovirus hanno dimostrato che il vaccino ha sufficiente sicurezza ed efficacia. Pertanto, potrebbe essere un vaccino profilattico promettente e fattibile contro l'infezione da SARS-CoV-2.

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