Effetto vantaggioso / sfavorevole della quercetina sulle membrane delle cellule di neuroblastoma SK-N-SH Parte 2
Apr 29, 2022
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2.2.2. Attività antiossidante della quercetina
Per testare l'efficacia della quercetina nel proteggere le membrane dallo stress ossidativo, sono stati condotti esperimenti in cui i modelli lipidici della membrana sono stati esposti all'ozono in assenza (Figura 4a) e presenza di quercetina ad una concentrazione di 6,25 μM (Figura 4b).
Sotto l'influenza dell'ozono, il corso di entrambe le dipendenze, cioè π = f (A) e Cs-1 = f (rn) cambia. Le isoterme ottenute per il monostrato diffuso sulla sottofase contenente ozono erano caratterizzate da una pendenza minore e da uno spostamento verso valori A più bassi. Inoltre, i valori di Cs-1 sono diminuiti sotto l'influenza dell'ozono. Questi cambiamenti sono stati maggiori con una concentrazione di ozono di circa 0,4 ppm.cintancheUn ulteriore aumento della concentrazione di ozono non ha aumentato i cambiamenti nelle caratteristiche del monostrato (figura 4a incasso).
Figura 4. Le isoterme a pressione superficiale e il corrispondente modulo di comprimibilità (inserto) del modello lipidico degli strati di neuroblastoma sparsi sulla sottofase contenevano le concentrazioni indicate di ozono disciolto in tampone. Isoterme:(a)in assenza di antiossidanti;(b)in presenza di quercetina (6,25 μM) aggiunta al tampone contenente ozono.
Quando la quercetina ad una concentrazione di 6,25 μM è stata introdotta nella sottofase, l'ozono non ha influenzato in modo significativo il decorso dell'isoterma r(A); tuttavia, i valori del modulo di compressione sono cambiati in presenza di ozono in modo simile a quanto nel caso dell'assenza di quercetina (inserto figura 4b).
I valori numerici dei parametri caratterizzanti i monostrati determinati in base alle isoterme ottenute sono presentati nella Tabella 3.
Tabella 3. I parametri superficiali dei monostrati Alim e Cs-I calcolati per i monostrati del modello di membrana del neuroblastoma diffuso sulla sottofase contenevano le concentrazioni indicate di ozono disciolto nel tampone in assenza e in presenza di quercetina (6,25 uM). I dati rappresentano la media di tre esperimenti ± SD. Lettere diverse indicano differenze significative (p≤0.05).
In presenza di ozono, si osserva una leggera riduzione della superficie per molecola (Alim) in monostrato densamente imballato. La riduzione massima di questo parametro è del 3,2% rispetto al controllo (monostrato sul buffer puro). Anche il parametro Cs-I viene ridotto, raggiungendo valori di plateau a concentrazioni di ozono superiori a 0,6 ppm O.La riduzione massima di questo parametro raggiunge il 24% in relazione al controllo.
Quando la quercetina ad una concentrazione di 6,25 uM è presente nella sottofase, i valori di Alim (1-2%) diminuiscono leggermente, mentre la riduzione del valore Cs-1 è di circa il 27%.
La natura dei cambiamenti Alim in presenza di ozono e di ozono in combinazione con quercetina hanno corsi diversi. Ad una concentrazione di ozono di circa 0,3 ppm, in assenza della quercetina, l'Aimde diminuisce bruscamente a circa 88,3 A2. Raggiunge quindi il valore minimo di plateau dando la caratteristica dipendenza dalla forma a S (Figura 5a, punti rossi). In presenza di quercetina, c'è una leggera diminuzione monotona liscia di Alim, raggiungendo una maggiore concentrazione di ozono un plateau di circa 93,5 A2 (Figura 5a, punti verdi).
Figura 5. La dipendenza dell'area per molecola dalla concentrazione di ozono (a) e la dipendenza del modulo di compressione dalla concentrazione di ozono (b) per la membrana del neuroblastoma nella sottofase: senza punti rosso quercetina; con punti verdi di quercetina. Le linee non presentano alcun modello fisico, sono state montate matematicamente e sono state disegnate per la comodità di tracciare le modifiche ai parametri. I valori massimi del modulo di compressione dello strato cambiano in modo simile con la concentrazione di ozono per entrambi: In assenza e presenza di quercetina (Figura 5b).
3. Discussione
Il meccanismo d'azione della quercetina è stato intensamente studiato per molti anni, ma i risultati degli esperimenti sono spesso contraddittori e indicano che in alcune circostanze, questo composto è benefico e, in altre, sfavorevole per le cellule. L'analisi degli studi disponibili mostra che l'effetto di questo composto sulle cellule è correlato a due aspetti, cioè la sua interazione con le membrane e l'attività antiossidante. Tuttavia, nelle cellule, non è possibile distinguere queste due modalità di azione della quercetina e la valutazione dell'idoneità di questo composto come sostanza potenziale, ad esempio, con attività antitumorale. Per questo motivo, gli esperimenti sono stati pianificati in modo tale da valutare in modo qualitativo e quantitativo l'influenza di questo composto sulle proprietà meccaniche delle membrane, nonché la sua attività antiossidante nel sistema modello, che elimina gli effetti dell'attività di altre vie metaboliche.
Sulla base degli esperimenti eseguiti, è stato confermato che anche alle concentrazioni più basse (6,25 uM), la quercetina modifica (come indicato dall'aumento di Alimvalue) i monostrati modello, imitando la parte lipidica della membrana delle cellule di neuroblastoma. Indica una possibilità di interazione della quercetina con le membrane di queste cellule quando raggiunge il cervello, anche a basse concentrazioni. Questo è di particolare importanza per le cellule nervose le cui membrane contengono quantità relativamente grandi di lipidi.
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Il rapporto lipidico-proteico approssimativo per le cellule nervose è 80:20% e, ad esempio, per la membrana eritrocitaria, questo rapporto è 50:50%[29]. Un tale livello di lipidi nella membrana delle cellule nervose è legato al ruolo di queste cellule nella trasmissione di segnali elettrici. Allo stesso tempo, anche sottili cambiamenti nelle proprietà fisico-chimiche, come la flessibilità e la rigidità, della membrana cellulare, possono disturbare significativamente questa funzione.
Il potenziale d'azione viene trasferito lungo la membrana della cellula nervosa grazie al lavoro dei canali ionici, e quindi, grazie all'azione delle pompe ioniche, viene ripristinato il potenziale di riposo. Il corretto funzionamento di queste proteine (in particolare, determinato dalla loro forma) dipende strettamente dall'ambiente lipidico. Inoltre, i cambiamenti nelle proprietà meccaniche della membrana possono disturbare il funzionamento dei canali il cui meccanismo di gating dipende proprio dalle proprietà meccaniche della membrana.
Queste tesi sono confermate da studi che hanno dimostrato che l'effetto della quercetina sulla membrana cellulare è correlato, tra l'altro, al trasporto di ioni Ca2+ e/o del metabolismo del Ca2+ [30,31]. Pertanto, l'introduzione di molecole di quercetina nell'ambiente della membrana (in particolare delle cellule nervose) può avere conseguenze significative sul loro funzionamento.
Per verificare se l'azione della quercetina determinata nei sistemi modello svolge un ruolo benefico o sfavorevole nelle cellule, i risultati ottenuti per le membrane modello sono stati confrontati con l'effetto di questo composto su intere cellule di neuroblastoma. Per le celle SK-N-SH, è stato eseguito il test MTT,Estratto di Cistanche Anti Alzheimerfornendo le informazioni sulla vitalità cellulare delle cellule che a sua volta è direttamente proporzionale agli enzimi mitocondriali deidrogenasi.
I risultati ottenuti hanno mostrato che la presenza di quercetina a concentrazioni di 100 e 200uM ha aumentato il numero di cellule vitali. Risultati simili sono stati ottenuti da Bao et al. [32], studiando l'effetto della quercetina sulle cellule PC-12. Anche la perdita di LDH nell'ambiente extracellulare, che fornisce informazioni sulla rottura della membrana cellulare, è stata esaminata agli stessi livelli di quercetina. I risultati ottenuti hanno dimostrato che le membrane delle cellule testate non sono state danneggiate in tali condizioni. Boots et al. [2], studiando gli effetti della quercetina sulle cellule epiteliali polmonari, hanno osservato risultati simili. Pertanto, si può concludere che a queste concentrazioni, la quercetina ha un effetto positivo sulle cellule, aumentando la loro vitalità.
Il secondo aspetto importante del meccanismo d'azione della quercetina è legato alle sue proprietà antiossidanti. Per valutare l'effetto associato del polifenolo studiato, sono stati condotti esperimenti in cui è stato verificato se la quercetina svolge un ruolo protettivo nelle cellule esposte allo stress ossidativo. Lo stress ossidativo è stato generato introducendo H, O2 nell'ambiente cellulare.Cistanche per migliorare la memoriaCome dimostrato in questo studio, il perossido di idrogeno provoca una significativa mortalità cellulare, espressa come danno ai mitocondri.
Quando le cellule SK-N-SH sono state coltivate per 3 ore in un mezzo contenente 3 e 5 mM H2O2, la vitalità cellulare è diminuita a circa il 44% di quella delle cellule non trattate (test MTT). Gli studi hanno dimostrato che il pretrattamento 24 ore su 24 delle cellule con quercetina provoca un aumento del numero di cellule viventi rispetto alle cellule trattate con H2O2. Suematsu et al. [13] hanno riportato effetti simili.
Abbiamo anche misurato il livello di MDA, che è un biomarcatore dello stress ossidativo come prodotto finale della perossidazione lipidica[33]. Il pretrattamento delle cellule con alte concentrazioni di quercetina, seguito dall'aggiunta di perossido di idrogeno, ha comportato un leggero aumento del contenuto di MDA rispetto alle cellule esposte a HO, da solo. Ciò può essere dovuto al fatto che la quercetina (a concentrazioni più elevate) può anche subire un'attivazione riduttiva dell'ossido ed essere oggetto di ciclo redox, generando specie dell'ossigeno reattive intracellulari [34].
Non ci sono stati cambiamenti significativi nella distruzione della membrana (come indicato dal livello di LDH invariato) delle cellule trattate con quercetina e H2O2 rispetto al caso in cui le cellule sono state esposte solo allo stress ossidativo. Pertanto, si può concludere che, nonostante un aumento della perossidazione lipidica (ad alte concentrazioni di quercetina), questo non era abbastanza significativo da distruggere le membrane e interrompere la loro continuità.
Le osservazioni ottenute per il sistema nativo sono state confrontate con quelle ricevute per un sistema modello in cui è possibile controllare esattamente sia la concentrazione di quercetina che il livello di stress. È stato verificato come la parte lipidica della membrana del neuroblastoma sia resistente allo stress ossidativo. Le condizioni di stress sono state create introducendo ozono nel tampone, in cui l'ozono dell'ambiente idrico subisce reazioni di decomposizione formando radicali ossidativi, tra cui radicali idrossilici e radicali anionici superossido [35]. La miscela ottenuta di specie reattive dell'ossigeno corrisponde a quelle presenti naturalmente nelle cellule, a causa dello squilibrio di disturbo dello stato redox [36-38].
Sotto l'influenza dello stress, la forma delle isoterme è cambiata, indicando una significativa diminuzione dell'area per singola molecola nel monostrato densamente imballato. Tali cambiamenti hanno avuto luogo a causa dell'ossidazione di legami insaturi nelle catene di acidi grassi. Questo effetto è aumentato con l'aumento della concentrazione di ozono a circa 0,3 ppm, e quindi questo parametro isotermico è rimasto allo stesso livello nonostante l'aumento dei ROS. Ciò significa che a una concentrazione di ozono di circa 0,3 ppm, tutti gli acidi grassi insaturi presenti nel monostrato sono stati ossidati (nel modello di neuroblastoma, la quantità totale di acidi grassi insaturi era del 52%)
I monostrati ossidati hanno una rigidità sostanziale,cistanche in Cinesecome rappresentato dal valore Cs-1 (maggiore è il valore di questo parametro, maggiore è la rigidità dello strato). In presenza di quercetina, anche a bassa concentrazione (6,25 μM), le modificazioni della membrana esposta all'ozono, come visualizzate dalle variazioni del valore di Alim, sono state significativamente ridotte (Figura 5a), che dimostra l'attività antiossidante di questo composto. Vale la pena notare, tuttavia, che sebbene la quercetina abbia eliminato i radicali, proteggendo gli acidi grassi insaturi dall'ossidazione, non ha invertito i cambiamenti nella rigidità della membrana (Figura 5b).
Pertanto, è stato dimostrato che la quercetina esibisce un'azione antiossidante, ma la sua semplice presenza tra le molecole lipidiche influenza (determina) i parametri della conca, cioè, nonostante la protezione delle catene di acidi grassi contro l'ossidazione, la rigidità della membrana è diminuita significativamente (valore Cs-I circa il 25% inferiore rispetto al controllo).
Questi risultati indicano che è il cambiamento di membrana che è il fattore principale negli effetti cellulari derivanti dalla presenza di quercetina. Tuttavia, le conseguenze di questo cambiamento (modifica della segnalazione, trasporto) variano a seconda del numero di molecole di polifenoli, della composizione iniziale della membrana e della funzione della cellula. Questo spiega perché, in diverse circostanze e in diversi studi, la quercetina mostra un effetto protettivo, mentre in altri è esattamente il contrario.
In una situazione di elevato stress ossidativo, l'effetto antiossidante aiuta la cellula proteggendo i suoi componenti dai danni. Tuttavia, se le membrane vengono modificate in modo significativo localizzando questo composto nel loro ambiente con conseguente distribuzione delle vie di segnalazione o di trasporto mediante una maggiore rigidità della membrana, ciò può portare a effetti sfavorevoli. Va anche ricordato che molti processi in una cellula avvengono contemporaneamente, sia quelli legati alle membrane che quelli che generano stress ossidativo. L'effetto che può essere osservato e misurato determinando il livello di indicatori specifici è sempre totale. Quindi, ci sono situazioni in cui l'effetto della quercetina è percepito come favorevole e sfavorevole.
4. Materiali e metodi
4.1.Materiali
La composizione del modello della parte lipidica della membrana delle cellule del neuroblastoma è stata stabilita sulla base del lavoro degli autori di [39-41]. Fosfolipidi: 1-oleoil-2-palmitoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina;1-esacosanoil-d4-2-idrossi-sn-glicerolo-3-fosfocolina;1,2-dioleoil-sn-glicerolo-3-fosfocolina; L-α-fosfatidiletanolammina (cervello); sfingomielina (cervello)-(Avanti Polar Lipids Inc., Alabastro, AL, USA). Il colesterolo è stato inseguito (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Germania). Il rapporto fosfolipidi/colesterolo era compreso tra il 79% e il 21%. Il rapporto tra acidi grassi saturi e insaturi era del 48% contro il 52%.
I solventi (cloroformio, etanolo) di purezza chimica-Poch (Gliwice, Polonia); acqua appena deionizzata prodotta da HLP 5 Hydrolab (Straszyn, Polonia). Il terreno di coltura, il siero e gli antibiotici sono stati acquistati da CytoGen GmbH. I reagenti chimici utilizzati negli esperimenti sono stati ottenuti da Sigma Aldrich.
4.2.Coltura cellulare
La linea cellulare di neuroblastoma umano SK-N-SH (The European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) è stata coltivata in siero bovino fetale al 10% (FBS) nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con lo 0,01% di penicillina-streptomicina a 37 °C in atmosfera umidificata, contenente il 5% di CO2.
4.3. Misurazione della vitalità cellulare (saggio MTT)
Le cellule sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti ad una densità di 1×104 cellule per pozzetto in un volume di 0,1 ml. Le cellule sono state trattate per 24 ore con varie concentrazioni di quercetina (3,75-200 μM). Dopo questo tempo, 3 mM e 5 mM di perossido di idrogeno sono stati aggiunti per 3 ore. A causa della mancanza di differenze tra gli effetti di HO2 a concentrazioni di 3 e 5 μM, per gli studi statistici, sono stati trattati come gli stessi trattamenti e descritti come trattamento 3-5 uM H2O2.
Dopo di che 50μL di MTT(3-【4,5-dimetiltiazol-2-il】-2,5 difenil tetrazolio bromuro) (soluzione madre sterile di 5 mg/mL) è stata aggiunta alle cellule e incubata per 2 ore a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO. Quindi, 0,4 mL di dimetilsolfossido (DMSO) sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e conservati per 10 minuti. Dopo la centrifugazione, la densità ottica del surnatante è stata misurata a 570 nm utilizzando un lettore di piastre a microlitri (BioTek Instruments, VT, USA).
4.4.Saggio di danno da mem1brane (saggio LDH)
Il test della lattato deidrogenasi (LDH) è stato utilizzato come marcatore dell'intera membrana cellulare.
Le cellule nella quantità di 1× 10 * cellule per pozzetto sono state seminate in una piastra a 96 pozzetti e incubate in presenza di quercetina (3,75-200 μM) per 24 ore; Quindi, 3 mM e 5 mM H2O, sono stati aggiunti per 3 h. Ai tubi contenenti 0,5 mL di 0,75 mM di piruvato di sodio e 10 uL di NADH (140 μM) (riscaldati a 37C per 10 min), sono stati aggiunti 150 μL di surnatante e incubati per 30 minuti a 37 °C. Quindi 0,5 ml di 2,4-dinitrofenilidrazina sono stati aggiunti al campione e dopo 1 ora l'assorbanza è stata misurata a 450 nm.
4.5. Determinazione della perossidazione lipidica (concentrazione mdA)
La perossidazione lipidica di membrana è stata stimata dalla reazione dell'acido tiobarbiturico (TBA) con malondialdeide (MDA). Le cellule sono state seminate in piastre a 46 pozzetti contenenti quercetina e H, O2 (in concentrazioni e tempi sopra descritti) nella quantità di 1×104 cellule per pozzetto in un volume di 0,25 ml. Dopo il trattamento, i campioni sono stati raccolti e centrifugati (1000×&,5min). Ai pellet sono stati aggiunti 0,5 ml di TCA allo 0,5%, vortici per 1 minuto e lisati attraverso la sonicazione per 5 minuti. Dopo la centrifugazione a 10.000 ×g per 10 min, 0,4 mL di surnatante sono stati aggiunti al TCA 20% da 1,25 mL con 0,5% TBA e riscaldati in un termoblocco secco (100 ° C) per 30 minuti. Dopo il raffreddamento, l'assorbanza è stata misurata a 532 nm utilizzando il coefficiente di estinzione molare di MDA pari a 155 M-1 cm-1.
4.6.Membrane modello
Ozonizzazione del buffer. Il tampone fosfato (0,01 M, pH 7,4) era saturo di ozono prodotto dal generatore di ozono FM 500 (Grekos, Polonia). La concentrazione di ozono in un tampone è stata determinata in base a Bader e Hoigne [42].
Isoterme di pressione superficiale.cistanche crescita del peneIl trogolo di Langmuir (KSV, Finlandia) è stato utilizzato per la registrazione isotermica della pressione superficiale a una velocità di compressione costante corrispondente a una velocità di barriera di 5 mm/ min. Il monostrato lipidico si è formato diffondendo una quantità definita di soluzione lipidica di cloroformio a concentrazione di 1 mg/mL sulla sottofase composta da tampone fosfato acquoso da 0,01 M, pH 7,4 con o senza quercetina e con o senza ozono. Le tensioni superficiali sono state misurate con una piastra Pt-Wilhelmy. Gli esperimenti sono stati eseguiti a 25°C±1°C.
4.7. Analisi statistica
Sono state eseguite da tre a sei analisi indipendenti per ogni variante testata e mediata (±SD). Le differenze significative rispetto ai controlli sono state stimate sfruttando la procedura SAS ANOVA. L'analisi statistica è stata eseguita dal test a gamma multipla di Duncan, prendendo p<0.05. statistical="" tests="" were="" carried="" out="" using="" statistica="" 13.3(cracow,="">
Contributi dell'autore: Concettualizzazione, B.K., B.D.,e metodologia E.R.-S., B.K. B.D.; software, B.K., B.D.validation, B.K., B.D., E.R.-S., A.B.writing—original draft preparation B.K., B.D., E.R.-S., writing—review and editing, B.K., B.D., E.R.-S., A.B.visualization, B.K., B.D.supervision, B.K., B.D., E.R.-S., A.B.Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.
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Questo articolo è estratto da Molecole 2021, 26, 4945. https://doi.org/10.3390/molecules26164945 https://www.mdpi.com/journal/molecules
