Un estratto di colture cellulari di Oenothera Biennis dotato di attività antietà cutanea migliora le proprietà meccaniche cellulari

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Astratto:L'invecchiamento cutaneo è un processo molto noto che determina un graduale peggioramento delle caratteristiche meccaniche della pelle dovuto ad un calo della produzione del macchinario della matrice extracellulare e ad un contemporaneo cambiamento nel processo di contrazione. Per rallentare questa progressione, è fondamentale indurre l'espressione di diverse proteine ​​in grado di promuovere la formazione di fibre elastiche e la riparazione dei tessuti. Qui l'estratto acquoso di colture cellulari di Oenothera bi-Ennis è stato studiato da un punto di vista chimico, per poi essere testato in vitro, nella cellula ed esperimenti ex vivo come coadiuvante nel contrastare l'invecchiamento cutaneo Di conseguenza, è stato dimostrato che l'estratto di Oenothera biennis è stato in grado, aumentando l'espressione del gene MYLK, di promuovere la contrazione del collagene della matrice, la polimerizzazione dell'actina e la produzione di proteine ​​ECM essenziali.

Parole chiave:metabolomica; reti molecolari; estratto idrofilo di colture cellulari di Oenothera biennis; contrazione del collagene della matrice; invecchiamento cutaneo

1. Introduzione

L'invecchiamento cutaneo è un processo molto noto indotto da fattori endogeni ed esogeni. Durante la senescenza, tutte le funzioni fisiologiche cutanee degenerano inesorabilmente, e questo progressivo deterioramento danneggia la pelle [1]. La pelle, infatti, perde progressivamente le sue caratteristiche meccaniche, sia per il declino della produzione delle proteine ​​della matrice extracellulare, sia per il contemporaneo cambiamento del processo di contrazione [2]. I componenti più importanti della matrice extracellulare del derma sono proteine ​​come collagene I e IIl, laminina, periostina, tenascina, elastina, fibronectina e proteoglicani, poiché la loro quantità relativa e lo stato di ripiegamento svolgono un ruolo chiave nell'interazione tra le cellule e il matrice, garantendo la corretta tessitura del derma [3]. Ad esempio, nello spazio extracellulare, la fibronectina svolge un ruolo chiave nell'assemblaggio della matrice poiché forma un ponte tra i recettori della superficie cellulare (ad esempio, le integrine) e il collagene, i proteoglicani e altre molecole di adesione focale. Le laminine contribuiscono alla struttura della matrice extracellulare e modulano l'adesione, la differenziazione, la migrazione, la stabilità del fenotipo e la resistenza all'apoptosi. L'elastina è anche importante per l'adesione cellulare e la migrazione cellulare e ha la capacità di partecipare alla segnalazione cellulare. Allo stesso modo, le fibriline interagiscono strettamente con la tropoelastina e le integrine e sono importanti per l'assemblaggio dell'elastina in fibre elastiche. Fabulous è strettamente connesso con le membrane basali, le fibre elastiche e altri componenti della matrice extracellulare e partecipa alla formazione delle fibre elastiche. Le tenascine sono glicoproteine ​​polimorfiche della matrice extracellulare (ECM) che mediano i processi fibrotici per consentire un'efficace riparazione dei tessuti [4] Inoltre, il processo contrattile cutaneo si basa anche sull'azione dei fibroblasti, le cellule più abbondanti nella matrice dermica; stabiliscono la giusta tensione della pelle favorendo i contatti tra i componenti della matrice, a loro volta responsabili della compattezza, densità e resistenza del derma. Alla base della loro organizzazione del citoscheletro cellulare c'è il macchinario actina-miosina, che determina potenziali cambiamenti nella loro forma e nella loro struttura. Il legame tra actina e miosina, infatti, induce una conformazione cellulare più compatta, avvicinando le fibre, garantendo lo sviluppo di tessuti sani e compatti e prevenendo la disgregazione delle fibre con conseguente formazione di rughe. Tuttavia, la capacità dei fibroblasti di contrarsi e allungarsi è parzialmente persa nel corso degli anni perché le cellule invecchiate non sono più in grado di agire correttamente e completamente. A causa di una minore forza meccanica, i fibroblasti assumono una morfologia più arrotondata e distorta rispetto a quella allungata [5]. Alcune prove hanno indicato che, durante l'invecchiamento, la sintesi di una proteina chiamata MYLK (Myosin Light Chain Kinase) è diminuita in modo significativo. MYLK possiede un'attività chinasica esercitata dalla fosforilazione di uno specifico dominio della miosina, chiamato catena leggera regolatrice della miosina, in grado di indurre actina-legante e quindi promuovere la contrattilità cellulare [6].bioflavonoidiQuando è stata rilevata una bassa attività di questa proteina, dovuta, ad esempio, a una minore espressione proteica, è stata misurata una corrispondente riduzione della contrazione del collagene della matrice [7] e della polimerizzazione dell'actina [8]. L'assemblaggio del citoscheletro di actina è legato non solo al movimento cellulare e alla capacità di contrarsi, ma anche alla produzione della proteina della matrice ECM attraverso l'attivazione del recettore TGF-II (TGFBRII)[9]. TGFBRII appartiene al complesso del recettore della superficie cellulare del TGF che, attraverso l'attivazione dei fattori di trascrizione Smad, regola l'espressione di molti geni che codificano per componenti della ECM, inclusi collagene, laminine, fibronectina e proteoglicani [10]. Il disassemblaggio del citoscheletro di actina sottoregola il recettore del TGF -Il. Questa down-regulation, a sua volta, diminuisce la produzione di collagene e di altre proteine ​​ECM, con conseguente perdita di massa dermica e fragilità cutanea.

Molti ingredienti cosmetici, infatti, mirano a stimolare la sintesi di alcuni fattori chiave responsabili del mantenimento della corretta compattezza della matrice dermica e di una buona contrazione cutanea. In questo scenario, gli estratti derivati ​​dalla specie Oenothera biennis (Evening Primrose), appartenente alla famiglia delle Onagraceae, sono di grande interesse per il loro contenuto di composti bioattivi come acidi grassi, fenoli, triterpeni e flavonoidi, che sono già stati testato nel trattamento di varie malattie patologiche della pelle [11]. Alcuni di questi metaboliti, a loro volta, sopprimono i mediatori dell'infiammazione come l'interleuchina 1 (IL-1), l'interleuchina 6 (IL{4}}), le citochine e il fattore di necrosi tumorale (TNF-)[12] ]. Inoltre, estratti di parti aeree di Oenothera biennis hanno protetto le cellule HaCaT dal danno al DNA indotto da H, O e dalla morte cellulare bloccando il danno cellulare dovuto allo stress ossidativo attraverso un meccanismo che coinvolgeva l'eliminazione dei ROS e la via di segnalazione Nrf2/HO-1 [ 13]. Inoltre, l'olio di Oenothera biennis, ricco di lipidi, è stato proposto come un buon idratante per i pazienti con eczema grazie alla sua capacità di penetrare facilmente nella pelle [14]. Purtroppo, i preparati estratti da piante coltivate, adibiti alla cosmesi, possono presentare alcuni svantaggi: primo, possono essere contaminati da sostanze tossiche o allergizzanti come pesticidi, fertilizzanti o inquinanti; le piante sono quindi soggette a stress e condizioni stagionali imprevedibili o variazioni nella disponibilità di nutrienti, che possono indurre la sintesi di metaboliti imprevisti. Inoltre, gli estratti possono contenere microrganismi patogeni, che riducono la qualità dei prodotti finali. Tutti questi inconvenienti, a loro volta, convergono nel rischio di avere un contenuto variabile di metaboliti secondari e una bassa riproducibilità. Per superare queste debolezze, l'uso di colture cellulari vegetali nei cosmetici sta diventando sempre più popolare e molto apprezzato, poiché supera molti degli svantaggi sopra menzionati [15].

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In questo studio, un estratto idrofilo di colture cellulari di Oenothera biennis (ObHEx) è stato completamente caratterizzato da approcci avanzati basati sulla spettrometria di massa, assistiti dalla bioinformatica e testati in molteplici saggi biochimici e biologici. La miscela contiene composti bioattivi principalmente lignani e triterpeni, come acido arjunolico e asiatico, che è stato precedentemente associato alla produzione di pro-collagene I nei fibroblasti umani [16,17]. L'estratto è stato studiato per la sua capacità di aumentare l'espressione di MYLK, promuovere la contrazione del collagene della matrice, la polimerizzazione dell'actina e la produzione di proteine ​​ECM regolate dal TGF, che favoriscono la contrazione del derma, rallentando così l'invecchiamento cutaneo.

2. Risultati

2.1. Analisi qualitativa e quantitativa dell'estratto solubile in acqua di colture cellulari di Oenothera Biennis

È stata eseguita l'analisi UPLC-MS/MS di ObHEx e i dati spettrometrici ad alta risoluzione sono stati sfruttati per la caratterizzazione chimica utilizzando Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS), un sistema di spettrometria di massa basato sul web che aiuta nell'identificazione e annotazione di prodotti naturali (NPS)[18]. Mira ad essere una base di conoscenza ad accesso aperto per le organizzazioni a livello di comunità e per la condivisione di dati di spettrometria di massa a frammentazione (MS/MS) grezzi, elaborati o annotati. Nello specifico, sono state eseguite ricerche nella libreria spettrale GNPS e un lavoro di Feature-Based Molecular Networking (FBMN): la prima analisi ha permesso di identificare composti naturali, confrontando i loro spettri MS/MS con quelli di metaboliti strutturalmente caratterizzati, la seconda con quelli di gruppo NP all'interno di una rete poiché modelli di frammentazione MS/MS simili sono stati mostrati da molecole strutturalmente simili [19]. Come mostrato nella Figura 1 e nella Tabella 1, molte NPS sono state senza dubbio identificate come appartenenti a diverse classi di metaboliti secondari, principalmente lignani (salvador aside e liriodendron) e triterpeni (acido muriatico, acido ariunolico, acido asiatico ed ederagenina). Le specie chimiche non identificate dal GNPS sono state assegnate in base alla letteratura.

Come esempio dell'uso di GNPS, la rete derivata dall'analisi FBMN è stata riportata nella Figura 2a, mostrando che ObHEx conteneva molti altri triterpeni non caratterizzati correlati all'acido muriatico (18, m/z 503.3389, RT 21.89 min: l'identificazione dell'acido muriatico ha confermata attraverso un confronto con il suo standard analitico). Ad esempio, varie specie precedentemente non caratterizzate a m/z 701 e 665 sono state identificate come forme glicosilate legate all'acido muriatico o ai suoi isomeri, rispettivamente idratate o meno con due molecole di HO

Inoltre, gli ioni riportati a m/z 729, 703, 699.687.685, 683 derivano rispettivamente dalla glicosilazione più due molecole di H, O di specie a m/z531, 505.501, 489.487 e 485: la loro identificazione univoca non è stata raggiunta, ma si suppone che siano tutti triterpeni, essendo imparentati con l'acido muriatico o con suoi congeneri, a causa della loro via di frammentazione MSMS. Recentemente, molti triterpeni con m/ 501 e 485 sono stati isolati da un'altra specie di Oenothera, Oenothera Maritima, e la loro struttura ha stato chiarito sulla base di dati spettroscopici, correlando così bene con i nostri risultati [20].

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L'analisi FBMN ha anche fornito informazioni sui metaboliti a m/z 617.3862 (ioni MS2 a m/z 453,145 e 119) presenti nelle reti molecolari mostrate nella Figura 2b e non riportate in letteratura per le specie di Oenothera. Questo valore m/z e la sua frammentazione combaciano con 2-OEp-cumaroil acido apostolico o suoi isomeri, dimostrando, almeno, la presenza di triterpene cummaroile e anche esteri caffeoil nell'estratto. Infatti, gli spettri MS delle specie a m/z 649 (RT 25,72 e 27,19) hanno mostrato la presenza di ioni a m/z 179, 161 e 135 a causa della scissione della parte dell'acido caffeico, mentre gli spettri MS2 delle altre specie riportato nella Figura 2b a m/z 633 (RT 26.88, 27.20, 28.12 e 28.43), 649 (RT24.18, 24.65, 24.83) e 661 (RT 30.28) hanno mostrato ioni a m/z 145 e 119, che erano caratteristici per la frazione cumaroilica.

After, the content of some identified lignans and triterpenes was determined. Ouantifi-cation methods were validated as reported in Table2. All calibration curves showed good linearity (R>0.9911)all'interno degli intervalli testati. Inoltre, il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOO) indicavano che i metodi utilizzati si distinguevano per l'elevata sensibilità. I risultati ottenuti dall'analisi quantitativa (Tabella 3) hanno mostrato che il liriodendron e l'ederagenina erano rispettivamente i principali lignan e triterpene rappresentati.

2.3.Analisi dell'espressione genica MYLK in HDF

L'attività di ObHEx è stata testata in HDF sull'espressione del gene MYLK, che codifica per la chinasi responsabile della fosforilazione della catena leggera della miosina (Figura 3a). I risultati hanno indicato che il trattamento con l'estratto a entrambe le concentrazioni ha aumentato l'espressione del gene MYLK di circa il 50 percento, in modo simile al controllo positivo TGF-.

2.4. Analisi della capacità di contrazione di una matrice di collagene

Per valutare l'attività di ObHEx sulla capacità contrattile delle fibre di collagene, abbiamo utilizzato HDF disperso in dischi di gel di collagene [21]. Come mostrato nella Figura 3b, l'estratto, alla concentrazione più bassa, ha indotto un aumento significativo della contrazione del disco di collagene, suggerendo un potenziale effetto sulla compattezza del collagene. Il trattamento con ML7(1-(5-idonaftalene-1-sulfonil)-1H-esaidro-1,4-diazepina), un inibitore di MYLK, ha abolito questo aumento, indicando che sia l'estratto che il TGF- agiscono attraverso MYLK per la contrazione del disco di collagene.

2.5.Misurazione del livello di polimerizzazione dell'actina

La capacità di ObHEx di stimolare la polimerizzazione dell'actina è stata studiata misurando il livello di actina polimerizzata nelle cellule, trattate con l'estratto e il controllo positivo TGF-, da sole e in presenza di ML7. Come mostrato nella Figura 3c, il trattamento con entrambe le concentrazioni degli estratti ha prodotto un aumento della quantità di actina polimerica di circa il 50 percento, rispetto al 33 percento di TGF-.comprare cistancheAnche in questo caso, la pre-incubazione con ML7com ha completamente abolito questo effetto, suggerendo il coinvolgimento di MYLK nella polimerizzazione dei filamenti di actina.

2.6. Analisi del percorso TGF RII/SMAD in HDF

Per verificare se l'aumento della polimerizzazione dell'actina e della contrazione del collagene delle cellule trattate con ObHEx fosse anche associato all'attivazione della via di trasduzione del segnale mediata dal TGF RII, abbiamo prima osservato l'espressione del gene TGF RII e poi abbiamo trasfettato HDF con lo SMAD{{ 0}}plasmide reporter della luciferasi e valutato l'aumento dell'attività della luciferasi in risposta al trattamento con ObHEx. I risultati, riportati nella Figura 3d,e, hanno indicato che il trattamento con ObHEx a 0,002 percento e 0,006 percento ha aumentato l'espressione di TGF RII in modo simile al TGF- usato come controllo positivo e, parallelamente, l'attività della luciferasi legata allo SMAD è stata aumentata rispettivamente dell'80 e del 40 percento. Una significativa riduzione del segnale è stata ottenuta quando le cellule sono state trattate con ML7, dimostrando anche che questa attività era legata a MYLK.

2.7. Analisi di Pro-Collagene I, Tropoelastina e Periostin

Come conseguenza dell'attivazione della trasduzione del segnale del TGF RII, abbiamo analizzato la sintesi delle principali proteine ​​della matrice extracellulare come il procollagene di tipo I, la tropoelastina e la periostina nell'HDF trattata con ObHEx a 0,002 percento. Come mostrato nella Figura 3f, ObHEx ha aumentato la produzione delle proteine ​​indicate di circa il 98 percento, 75 percento e 51 percento, rispettivamente, in modo simile al controllo positivo TGF-. Le misure sono state eseguite mediante test ELISA, utilizzando anticorpi specifici contro pro-collagene I, tropoelastina e periostina.

2.8. Analisi di MYLK, fosfo-miosina, collagene I e tropoelastina su espianti cutanei ex vivo

Come mostrato nella Figura 4a-c, ObHEx ha prodotto un aumento significativo della produzione di MYLK e miosina fosforilata negli espianti di pelle umana.

Il collagene I e l'induzione della tropoelastina sono stati analizzati anche in espianti cutanei pretrattati con ObHEx e quindi trattati con idrocortisone per 8 giorni per simulare l'invecchiamento cronologico [22]. Il trattamento con idrocortisone ha ridotto la quantità di collagene I e tropoelastina di oltre l'100 percento e la presenza dello 0,002 percento di ObHEx ha ripristinato la quantità di tropoelastina di quasi il 91 percento e di collagene del 120 percento, rispetto al ascorbato utilizzato come controllo positivo (Figura 4d-f). Ciò suggerisce un potenziale effetto antietà di ObHEx, particolarmente efficace nell'aumentare la compattezza della pelle agendo sui componenti della matrice dermica.

2.9. Microscopia a forza atomica (AFM) negli espianti di pelle

Al fine di raccogliere maggiori informazioni sulle proprietà biomeccaniche della pelle promosse dal trattamento con ObHEx, abbiamo valutato l'elasticità, una proprietà meccanica intrinseca dei campioni di pelle in termini di moduli di Young [23]. Come descritto nella Sezione 4, per calcolare il modulo elastico, sia su campioni di pelle trattati che non trattati, abbiamo raccolto le curve di Forza con un microscopio a forza atomica (AFM) e le abbiamo adattate con il modello Hertz [24,25]. Come mostrato nella Figura 5, il trattamento dei campioni di pelle con l'estratto presentava valori di modulo di Young inferiori rispetto ai campioni non trattati, suggerendo un miglioramento delle proprietà elastiche della pelle. In particolare, i campioni di pelle non trattati hanno rivelato un valore medio del modulo di Young di 0.37±0.15 GPa, mentre i campioni di pelle trattati con ObHEx hanno mostrato un valore medio inferiore di 0.{{11 }}7±0,02 GPA. I valori del modulo di Young dei campioni di pelle erano in accordo con la letteratura [26-28].

3. Discussione

Le colture cellulari vegetali costituiscono l'approccio più promettente per la produzione sostenibile di metaboliti secondari vegetali di interesse commerciale, offrendo un approvvigionamento continuo di materiale mediante colture su larga scala e costituendo un sistema sostenibile ed ecologico [29,30]. Gli estratti da colture cellulari vegetali hanno trovato promettenti applicazioni nel settore sanitario e cosmetico, in quanto presentano alcuni vantaggi rilevanti;(i)contengono metaboliti biosintetizzati in condizioni di laboratorio a crescita controllata;(i) derivano da processi produttivi standardizzati, garantendone la stesse caratteristiche qualitative e quantitative delle specie ottenute;(ii) gli estratti sono privi di contaminanti quali microrganismi, erbicidi, pesticidi e fungicidi;(iv) sono indipendenti da fluttuazioni geografiche o ambientali e le specie vegetali possono essere conservate per il futuro generazioni. In questo contesto, un estratto acquoso di colture cellulari di Oenothera biennis (ObHEx) è stato esaminato come una promettente fonte di molecole bioattive dotate di attività antietà della pelle. Infatti, ObHEx è stato studiato mediante analisi UPLC-MSMS ad alta risoluzione accoppiate con approcci bioinformatici per ottenere un'ampia caratterizzazione strutturale. La caratterizzazione dei composti è stata realizzata principalmente utilizzando GNPS per accelerare il processo di identificazione, confrontare gli spettri MS/MS con quelli dei metaboliti strutturalmente caratterizzati e, inoltre, rivelare nuove specie inaspettate, raggruppando NP simili all'interno di una rete. Inoltre, anche il tempo di ritenzione, misurazioni di massa accurate e analisi MS2 sono stati confrontati con quelli degli standard e tutti i dati sono stati abbinati alla letteratura. Sono stati identificati lignani e triterpeni bioattivi, come Salvador a parte, liriodendron, acido mio-antemico, acido arjunolico, acido asiatico ed ederagenina. Il liriodendron [31] e l'acido muriatico [32] hanno mostrato una forte attività antiossidante, mentre l'ederagenina ha mostrato proprietà antietà cutanee dovute alla riduzione dell'ossidazione cellulare e all'attivazione della funzione proteasoma [33]. Tuttavia, gli acidi arjunolico e asiatico sono stati considerati i principali responsabili di alcune delle seguenti attività testate, poiché stimolano la sintesi del collagene I. È stato infatti dimostrato che ObHEx migliora le proprietà biomeccaniche della pelle, che dipendono principalmente dalla quantità relativa dei diversi componenti della ECM e da come i fibroblasti sono in grado di contrarsi e fornire la giusta tensione alle fibre dermiche.cistanciaInfatti, ObHEx promuove la contrazione della matrice di collagene e la polimerizzazione dell'actina aumentando l'espressione del gene MYLK, potenziando la forza di contrazione dei fibroblasti dermici. L'assemblaggio del citoscheletro di actina sovraregola il recettore del TGF-tipo II e, coerentemente con la stimolazione della segnalazione del TGF-/Smad, aumenta i livelli delle proteine ​​ECM regolate dal TGF. Infatti, ObHEx induce la produzione di collagene di tipo I, periostina e tropoelastina. Pertanto, tutte queste proprietà lo rendono un buon ingrediente candidato promettente da utilizzare nelle formulazioni cosmetiche per combattere la perdita di compattezza ed elasticità della pelle associata all'età. Questa ipotesi è stata supportata dai risultati ottenuti nell'analisi AFM, che ha mostrato che il trattamento delle fette di pelle con ObHEx ha prodotto un miglioramento delle proprietà meccaniche della pelle, rilevato come una diminuzione del modulo di Young, indicando una significativa riduzione della rigidità e rigidità della pelle.

4. Materiali e metodi

4.1. Colture di tessuti vegetali e preparazione dell'estratto

Le piante di Oenothera biennis sono state fornite da GEEL Floricultura ss ed erano di origine italiana (evitando l'applicazione del protocollo di Nagoya). Le colture cellulari sono state ottenute da foglie di piante di Oenothera biennis inducendo la proliferazione di cellule meristematiche su piastre di agar solide fino ad ottenere calli. Le cellule sono state trasferite nel mezzo di crescita liquido (Gamborg B5, integrato con 24 acido diclorofenossiacetico (1 mg/L), adenina (1 mg/L) e chinetina (0.01 mg/L)). Quindi , le cellule sono state coltivate come colture in sospensione sotto scuotimento orbitale. Una volta ottenute le colture di circa 150 g/L, le cellule sono state raccolte e lisate in un tampone fosfato (PBS) a pH 7,4 per preparare un estratto idrosolubile, che è stato liofilizzato. La polvere è stata disciolta in acqua o terreno di coltura cellulare alle concentrazioni appropriate per il test.

4.2. Analisi UPLC-MSMS per la caratterizzazione chimica

ObHEx(5{{10}} mg/mL) è stato preparato e sottoposto a un'estrazione bifasica di butanolo/acqua. La frazione butanolica è stata essiccata e disciolta in metanolo (10mg/mL) prima dell'analisi UPLC-MS/MS. È stato eseguito su uno spettrometro di massa classico Q-esattivo di Thermo-Scientific (Waltham, MA, USA) dotato di un sistema UPLC Thermo ScientificTM UltiMateTM 3000. Tutte le analisi cromatografiche sono state eseguite utilizzando una colonna Phenomenex Luna③C{7}} A （150×2,0 mm, dimensione delle particelle 3 μm） a 40 gradi C e una velocità di flusso di 0,200 mL/min. Il volume di iniezione era di 5 μL. La fase mobile era costituita da A (acqua di ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, Regno Unito allo 0,1 percento di acido acetico) e B (100 percento di acetonitrile di ROMIL Ltd, Convent Drive, Waterbeach, Cambridge, Regno Unito) utilizzando un'eluizione a gradiente del5 percento B al0-5min,5-14 percento B al5-8 min,14-32 percento B al 8-11 min, 32-95 percento Pipistrello {{ 26}}min,{27}} percentuale Bat32-33 min, 98% B a 33-38min,98-5 percentuale Bat38-39 min e 5% B a { {34}} min. Tutte le analisi MS e MSMS sono state eseguite in modalità ESI negativa con la portata del gas della guaina a 30 (unità arbitrarie), la portata del gas ausiliario a 5 (unità arbitrarie), la tensione di spruzzatura a 3,2 kV e la temperatura del capillare e la temperatura del riscaldatore a gas ausiliario a 300 gradi. I dati sono stati acquisiti con una modalità Full MS/dd-MS2 (Top5). Le impostazioni MS complete erano: la risoluzione di 70.000, target AGC di 1×106, IT massimo di 200 ms e può variare da 100 a 800 m/z.dd-Le impostazioni MS2 erano: risoluzione di 17.500, target AGC di 2×105, massimo IT di 65 ms, finestra di isolamento di 1,5 m/z e NCE di 35.

ottenuti sono stati verificati manualmente. I dati mzXML sono stati elaborati utilizzando Mzmine 2.53 prima del lavoro FBMN (Feature-Based Molecular Networking) su GNPS. La fase di rilevamento della massa è stata eseguita utilizzando il rilevatore di massa del centroide mantenendo il livello di rumore a 5 × 1{{10}}3. L'edificio del cromatogramma della pipeline di analisi dei dati automatizzata (ADAP) è stato realizzato con le seguenti impostazioni: dimensione minima del gruppo in un numero di scansioni pari a 5, soglia di intensità del gruppo di 5 × 1{{20}}}³, intensità minima massima di 5× 10 più ,m/z tolleranza di 0.01 m/z o 10 ppm. La deconvoluzione del cromatogramma è stata ottenuta utilizzando Wavelets (ADAP) come algoritmo, soglia S/N di 3, altezza minima della caratteristica di 1 × 105, soglia coefficiente/area di 5, intervallo di durata del picco di 0.{{ 18}}.{19}} min e intervallo wavelet RT di 0.00-0.05. I cromatogrammi sono stati deisotopati utilizzando l'algoritmo di raggruppamento dei picchi isotopici con una tolleranza m/z di 0,001 m/z o 5,0 ppm e una tolleranza RT di 0,10 min. Il lavoro FBMN è stato eseguito utilizzando una tolleranza di massa genitore di 0,02 Da e una tolleranza ionica frammento MS4 di 0,02 Da. I bordi sono stati filtrati per avere una soglia di punteggio di 0,7 e un minimo di 2 picchi abbinati. Inoltre, il numero massimo di nodi adiacenti per ciascun nodo è stato impostato su 10.

4.4. Analisi quantitativa di lignani e triterpeni

Le stesse condizioni UPLC riportate per l'analisi qualitativa sono state utilizzate per l'analisi quantitativa dei lignani, mentre per quella dei triterpeni sono state ottimizzate per separare due coppie di isomeri, arjunolico e acido asiatico. L'analisi è stata eseguita su uno spettrometro di massa classico Q-Exactive come descritto in precedenza. La separazione è stata effettuata da un Phenomenex Kinetex⑧EVO C18 300 A（150×2,1 mm, dimensione delle particelle 5 μm）. La fase mobile era costituita da A(soluzione acquosa di acetato di ammonio 5 mM, pH 9.00 aggiustato da idrossido di ammonio) e B(100 percento di acetonitrile) utilizzando un'eluizione a gradiente di 17-28 percentuale B a 0-18 min, 28-65 percentuale B a 18-22 min, 65-75 percentuale B a 22-26min,75-95 percentuale a {{17 }}, 5 min, 95 percento a 26,5-30 min, 95-17 percento a 30-30, 1 min, 17 percento a 30,1-42 min. La portata era di 0,450 ml/min e il volume di iniezione era di 5 ul. Sia per i lignani che per i triterpeni, i dati sono stati acquisiti con una modalità Full MS-SIM e PRM. Le impostazioni MS-SIM complete erano: la risoluzione di 70.000, target AGC di 3 × 106, IT massimo di 200 ms e può variare da 200 a 800 m/z per i lignani e da 400 a 850 m/z per i triterpeni. Le impostazioni PRM erano: la risoluzione di 70.000, target AGC di 2×10 gradi, IT massimo di 100 ms, finestra di isolamento di 1,0 m/z e NCE di 35 nel caso dei lignani e 50 in quello di triterpeni.cistanche AustraliaAbbiamo acquistato Salvador a parte (#{{0}}XS172930) da Biosynth Carbosynth (Staad, San Gallo, Svizzera), liriodendron (#SMB00181) e acido arjunolico (#SMB00119) da Sigma -Aldrich(St. Louis, MO, USA), acido asiatico (#0027) di Extrasynthese (Genay, Lione, Francia) e hederagenin(#89706) di PhytoLab GmbH & Co.KG(Vestenbergsgreuth, Bayern-Mittelfranken, Germania). L'acido miriantico è stato un dono della Prof.ssa Maria Valeria D'Auria, Università di Napoli. Le curve di calibrazione sono state ottenute iniettando soluzioni standard nell'intervallo di concentrazione di 0.{9}} μM per i lignani e 0.1-25 uM per i triterpeni. Sia il puro Salvador a parte che il liriodendron hanno mostrato due picchi LC-MSMS, probabilmente a causa dell'equilibrio chimico stabilito nella soluzione. Il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOO) per gli standard sono stati determinati sulla base del rapporto segnale/rumore (S/N).

4.5. Colture cellulari della pelle ed espianti

I fibroblasti cutanei umani (HDF) sono stati mantenuti in Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) ) nel 95 percento di aria, 5 percento di CO e atmosfera umidificata a 37 gradi . Gli espianti cutanei, ottenuti dalla pelle di donatrici sane (di età 44-47) presso il centro chirurgico Villa Cinzia (Napoli, Italia), sono stati coltivati ​​in 24- piastre transwell in DMEM/FBS più antibiotici in aria- condizioni liquide a 37 gradi in aria umidificata con CO2 al 5%. Tutti i donatori avevano dato il loro consenso informato scritto per l'uso dei tessuti cutanei, secondo la Dichiarazione di Helsinki.

4.6. Test di citotossicità

I test di citotossicità si basavano sull'uso del composto MTT [{{0}}(45-dimetiltiazolil)-2,5-difeniltetrazolio-bromuro][34]. Le cellule sono state coltivate in 96-piastre a pozzetti nel mezzo di coltura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), integrato con 10 percento di siero bovino fetale, per circa 8 ore. Dopo il trattamento con ObHEx tra 0.05 percento e 0,0004 percento (500 ug/mL e 4 ug/mL) per 48 ore, le cellule sono state lavate in PBS e incubate con 100 μL/pozzetto di "tampone di reazione" contenente∶ 10 mM di Hepes, 1,3 mM CaCl2, 1 mM MgSO, 5 mM di glucosio e 0,5 mg/mL di substrato colorimetrico MTT in tampone PBS a pH 7,4. Dopo 3 ore di incubazione a 37 gradi C in5 percento di CO, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 μL di soluzioni solubilizzanti contenenti il ​​10 percento di Triton-X100,0,1 N di HCl in isopropanolo assoluto. Dopo 16 ore di incubazione, la reazione colorimetrica è stata misurata a 595 nm con il lettore di piastre Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).

4.7. Analisi dell'espressione del gene MYLK e TGF6RII in HDF

Per pozzetto, 1 × 10 grado di HDF è stato coltivato in 6-piastre a pozzetti in DMEM al 2% di FBS, dopo 24 ore FBS è stato ulteriormente diluito a 0,5% e il le cellule sono state trattate con concentrazioni di 0,002 percento e 0,006 percento di ObHEx e TGF- 2,5 ng/mL, seguite da un'incubazione di 2 ore per MYLK e 48 per TGFRII. Per l'estrazione dell'RNA è stato utilizzato il kit "GenEluteM Total RNA Purification" acquistato dalla società Merck (Darmstadt, Germania). Dopo i trattamenti indicati, le cellule sono state lavate con PBS, raccolte in tampone di lisi e sottoposte alla procedura di estrazione come riportato. I campioni sono stati trattati con DNasi I (Ambion, Austin, TX, USA) a 37 gradi per 30 minuti per rimuovere il contaminante del DNA genomico. Da ciascun campione, 2 μL sono stati caricati su gel all'1% di agarosio in presenza di colorante di carico denaturante allo scopo di quantizzare la quantità di RNA in riferimento a un marcatore specifico per l'RNA (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). GeneTools (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) è stato utilizzato come software per la quantizzazione. Successivamente, 300 ng di RNA totale sono stati retro-trascritti utilizzando l'enzima trascrittasi inversa (ThermoScientific, Waltham, MA, USA). La RT-PCR semiquantitativa è stata condotta utilizzando come standard interni la coppia di primer universali 18S primer/concorrente (Ambion, Austin, TX, USA). I prodotti della PCR sono stati separati su gel di agarosio all'1,5%, visualizzati utilizzando lo strumento Reliance (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) e analizzati mediante densitometria utilizzando il software Genetools. Le sequenze dei primer utilizzati per l'amplificazione erano le seguenti: MYLK FW: ATCAAACTGTCAAGTTCAG, MYLK Rv: AGGCACTGCGTGCAGTCCA, TGFBR2 FW: GTCACTGACAACAACGGT, TGFBR2 RV: ATGTCAGAGCGGTCATCT.

4.8. Analisi della capacità di contrazione di una matrice di collagene

Per quanto riguarda le cellule HDF, 2.0× 10 gradi sono stati risospesi in un mezzo di crescita DMEM 5x (Gibco, Waltham, MA, USA) in una 24-piastra a pozzetti e una piastra da 2 mg/ In ogni pozzetto è stata aggiunta una soluzione in ml di collagene da pelle bovina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Il pH della soluzione è stato regolato a 7,2. La piastra è stata incubata a 37°C per 45 minuti per consentire la solidificazione del gel di collagene. Successivamente è stato aggiunto DMEM integrato con l'10 percento di FBS e/o ML7 25 uM, come inibitore della proteina MYLK. Dopo 16 ore, ML7 è stato eliminato e ObHExat è stata aggiunta la concentrazione dello 0,002 percento in DMEM con il 2 percento di FBS. TGF- 2.5 ng/mL è stato utilizzato come controllo positivo. Il disco di collagene formatosi è stato immediatamente staccato dal pozzetto utilizzando una micro spatola sterile in modo da favorirne la contrazione. Le aree del disco di ciascun trattamento sono state misurate a tempo 0 e 5 h e analizzate utilizzando il software Image.

4.9. Analisi del grado di polimerizzazione dell'actina

Successivamente, 1,5 × 10 grado di cellule HDF per pozzetto sono stati coltivati ​​​​in una piastra a pozzetti 24- e il giorno successivo al mezzo è stato aggiunto il 2% di FBS e la citocalasina B, che è un inibitore dell'actina polimerizzazione, a 2 μM per 3{{1{{20}}}} min. Dopo 30 minuti, sulle cellule, ObHEx（0,002 percento e 0,006 percento ）è stato aggiunto insieme a TGF- 2,5 ng/mL, usato come controllo positivo, e ML7 25μM, come controllo negativo dell'enzima MYLK. Dopo 30 minuti di trattamento, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% (PFA) in tampone fosfato per 30 minuti su ghiaccio. Le cellule sono state lavate con PBS e permeabilizzate con una soluzione di tampone fosfato e Triton-X100 allo 0,2 percento per 30 minuti. Successivamente, le cellule sono state incubate con una soluzione di 0,4 μM di falloidina coniugata con rodamina (Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) per 1 ora al buio.benefici di cistanceAll'ora 0 e dopo 18 ore, la fluorescenza è stata misurata a 540/570 nm utilizzando il lettore di piastre Victor3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). 4.10.Analisi del Percorso SMAD2

Le cellule HDF sono state seminate a una densità di 3 × 103 in 96-piastre a pozzetti e dopo 16 ore sono state trasfettate utilizzando il reagente di trasfezione del DNA X-tremeGeneTM HP (Roche Diagnostics, Basilea, Svizzera) con il vettore reporter Smad2 secondo le istruzioni del produttore. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con ObHEx o TGF- 2.5 ng/mL, da solo o in combinazione con ML7 25 μM per 24 h. Al termine dell'incubazione, le cellule sono state lavate con PBS e l'attività della luciferasi è stata determinata utilizzando il sistema di test SteadyGlo Luciferase (Promega Corporation, Madison, WI, USA) nel lettore di piastre Multiwell Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA , STATI UNITI D'AMERICA).

4.11. Analisi della sintesi di pro-collagene I, tropoelastina e periostina

Per pozzetto, 8 × 103 HDF sono stati coltivati ​​in 96-piastre a pozzetti e trattati con 0.002 percento di ObHEx o TGF 2,5 ng/mL. Dopo 24 ore, le cellule sono state processate per ELISA utilizzando l'anticorpo primario monoclonale anti-procollagene di tipo I(sc-166572, Santa-Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), seguito da incubazione con l'anticorpo secondario anti-topo marcato con perossidasi(170-6516, Biorad, Hercules, CA, USA). I supernatanti delle cellule sono stati rivestiti su un'altra piastra per il rilevamento di tropoelastina e periostina utilizzando l'anticorpo di coniglio anti-tropoelastina (ab21600, Abcam, Cambridge, U o l'anticorpo di topo anti-periostina (sc-398631, Santa-Cruz Biotechnology , Dallas, TX, USA), seguita da incubazione con anticorpo secondario anti-coniglio marcato con perossidasi (170-6515, Biorad, Hercules, CA, USA). La reazione colorimetrica è stata sviluppata aggiungendo 100 μL di una soluzione acquosa di OPD (O-fenilendiammina), 0,35 mg/mL in tampone citrato 50 mM e perossido di idrogeno allo 0,012 percento (H2O2).Dopo 30 minuti, l'assorbanza è stata misurata a 490 nm utilizzando il lettore multiplo Victor Nivo (PerkinElmer, Waltham, MA, STATI UNITI D'AMERICA).

4.12. Prove ex vivo

L'immunoHistoFluorescence (IHF) di MYLK e la miosina fosforilata sono state valutate in espianti cutanei di donatori di {{0}} anni. Gli espianti di pelle umana sono stati tagliati con curette per biopsia punch di 8 mm e coltivati ​​in 24-piastre a pozzetti in DMEM con l'10 percento di FBS e antibiotici. I punzoni ottenuti sono stati trattati con 0.002 percento e 0,006 percento di ObHEx per 24 ore. Sono stati incubati nel 15% di saccarosio, poi nel 30% di saccarosio e infine congelati. Successivamente, sono state ottenute sezioni da 10 μm utilizzando il criostato CM1520 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germania). I vetrini con criosezioni sono stati idratati per 30 minuti in PBS e posti in una soluzione "bloccante" (6 percento di BSA, 5 percento di siero, 20 mM MgCl,, 0,2 percento di Tween) per 1 ora. Le criosezioni sono state incubate con l'anticorpo primario di coniglio anti-MYLK (1: 100, GeneTex, Irvine, CA, USA) e l'anticorpo primario anti-fosfo-miosina (1:100, LifeTechnologies, Carlsbad, CA, USA) per 16 ore a 4 gradi. I vetrini sono stati lavati con PBS per 30 minuti e quindi incubati con l'anticorpo secondario anti-coniglio Alexa-Fluor 546 (1:1000; A11035 ThermoFisher, Waltham, MA, USA) per 1 ora. I nuclei sono stati colorati con DAPI(4',{39}} diamidino{40}}fenilindolo)1 ug/mL in PBS per 10 min. Le immagini sono state acquisite con un microscopio a fluorescenza e analizzate con il software ImageJ. Per l'IHF di tropoelastina e collagene I, sono stati utilizzati espianti cutanei di donatrici di 36-anni di età. Le biopsie cutanee sono state ottenute come descritto sopra e pretrattate con lo 0,002% e lo 0,006% di ObHEx per 24 ore. Lo stress con idrocortisone a 10 ug/mL per 8 giorni è stato aggiunto in presenza di ObHEx. Successivamente, le biopsie sono state congelate come descritto sopra e le sezioni sono state incubate con l'anticorpo primario di coniglio anti-tropoelastina (1:1000 ab21600, Abcam, Cambridge, Regno Unito) e anti-collagene I (1:100 C2456 Merck, Darmstadt, Germania) per 16h a 4 gradi. I vetrini sono stati analizzati come descritto sopra e le immagini sono state acquisite e analizzate con il software ImageJ.

4.13. Microscopia a forza atomica (AFM) negli espianti di pelle

L'elasticità dei campioni di pelle non trattati e trattati con ObHEx è stata valutata assicurandone i moduli di Young mediante un metodo in scala nanometrica basato sulla Microscopia a Forza Atomica (AFM), sviluppato non solo per campioni biologici ma anche per quelli inorganici. Questi approcci si basano sulle ipotesi dei modelli di Hertz e considerano il campione e il cantilever come due molle in una serie in un esperimento AFM. In breve, la pelle ex-pianta trattata con 0.0Il 06% di ObHEx e campioni di pelle non trattati sono stati tagliati dal criostato in fette di 10 um di spessore. I campioni sono stati conservati a 12 gradi, quindi lavati con PBS ed esaminati a una temperatura fissa e un'umidità relativa rispettivamente di 22 gradi e 55 percento. Ciascun campione è stato studiato da un NanoScope IIA AFM in Force Spectroscopy Single Mode utilizzando una punta piramidale (RESP-20) con una costante elastica di 0,9 N/m. Per calcolare il modulo di Young sono state acquisite dieci curve di Forza in dieci punti diversi della stessa superficie campione. Ciascuna curva di forza è una curva di deflessione (Volt) rispetto allo spostamento (nm) e può essere convertita in curve di forza (N) rispetto alla separazione (nm). Ogni curva di Forza, infatti, riporta le curve di carico e scarico. Rappresentano l'andamento della punta rispetto al campione: quando la punta è lontana dal campione quando entrano in contatto e la punta inizia a deviare, e quando si allontana nuovamente. Solo la prima parte di queste curve può essere studiata. Ognuna di queste parti delle curve è stata adattata con un modello Hertziano standard, in particolare, la tipica Hertzequation per una punta piramidale, per estrarre il modulo elastico noto come modulo di Young in GPa.

4.14. Analisi statistica

Tutti i valori riportati erano la media di tre esperimenti indipendenti, ciascuno dei quali è stato eseguito in triplicato. Gli asterischi indicano la significatività statistica calcolata in accordo con il test t: *significa valore Minore o uguale a 0.05;** valore p Minore o uguale a 0. 01;***p valore Minore o uguale a 0,001.

Questo articolo è estratto da Metabolites 2021, 11, 527. https://doi.org/10.3390/metabo11080527 https://www.mdpi.com/journal/metabolites