Effetti anti-invecchiamento dell'estratto di Piper Cambodianum Cistanche su normali cellule di fibroblasti dermici umani e un modello di guarigione delle ferite nei topi Ⅱ

Cistancheestrarre le cellule NHDF protette dagli effetti dell'irradiazione UV

Le cellule della pelle rispondono rapidamente se esposte ai raggi UV o a citochine come l'interleuchina (IL)-4 e IL-13.19Dopo l'esposizione ai raggi UV, vengono stimolati vari fattori, tra cui EGFR,20,21 TNFR,22chinasi della proteina attivata dal mitogeno (MAP), ERK e chinasi ammino-terminale c-Jun (JNK).23Sia JNK che p38 fosforilano e attivano il fattore di trascrizione c-Jun, che, a sua volta, eleva c-Fos e aumenta i livelli della proteina attivatrice del fattore di trascrizione-1,24che è richiesto per la trascrizione di MMP. Questi recettori sono attivati ​​dalla fosforilazione della MAP chinasi e di altre proteine ​​a valle.25Le MAP chinasi sono attivate dalla fosforilazione di specifici residui di treonina e tirosina.24,26L'esposizione ai raggi UV porta ad un'elevata espressione di eterodimeri c-Jun e c-Fos, numerose citochine e fattori di crescita, che sono fosforilati da JNK e p38.27,28Allo stesso modo, i livelli di proteina p53 erano elevati, a partire da 2,5 ore fino a 24 ore dopo l'esposizione ai raggi UV.29Abbiamo dimostrato che le cellule esposte all'irradiazione UV per 24 ore esprimevano i livelli di proteine ​​TNFR1 e EGFR, che diminuivano in modo dose-dipendente quando le cellule venivano trattate conCistanche. Abbiamo esaminato l'effetto della radiazione UV sia sulla fosforilazione che sull'attività di p38 (Thr180/Tyr182). I livelli proteici di c-Jun e p53 sono stati drammaticamente sottoregolati inCistanche-cellule trattate (figure 4A e B).

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L'estratto di cistanche ha protetto le cellule NHDF irradiate con raggi UV da ROS

La luce UVB stimola la produzione di ROS,30,31e l'esposizione ai raggi UV sulla pelle produce ROS come O2 ⋅−, H2 O2, E1 O2. 32Non trattato eCistanchele cellule trattate sono state sottoposte a irradiazione UV per 24 ore e la generazione di ROS è stata misurata mediante selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).

Figura 3Regolazione delle proteine ​​ECM inCistanchecellule trattate.Appunti: (A) Le cellule NHDF sono state trattate conCistancheper 24 ore. I lisati cellulari sono stati analizzati mediante immunoblotting utilizzando anticorpi anti-collagene, anti-elastina, anti-MMP-3 e anti-ERK-2. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (B) Actina, collagene, elastina, MMP-3 ed ERK-2 negli immunoprecipitati sono stati quantificati mediante Western blotting. Le altezze delle barre sono la rispettiva media± DS di tre esperimenti indipendenti. *P,0.05; **P,0.01. Abbreviazioni:Conc, concentrazione; ECM, matrice extracellulare; ERK, chinasi extracellulare regolata dal segnale; MMP, metalloproteinasi di matrice; NHDF, fibroblasto dermico umano normale;Cistanche, Piper CambogianoP. Fourn.; DS, deviazioni standard.

Figura 4Cistanche estrarre l'inibizione della produzione di ROS nelle cellule irradiate con raggi UV.Appunti: (A) Le cellule NHDF sono state esposte all'irradiazione UV a 40 J per 180 secondi e trattate conCistancheper 24 ore. I lisati cellulari sono stati analizzati mediante immunoblotting utilizzando anticorpi anti-TNFR6, anti-c-Jun, anti-c-Fos, anti-pp38 o anti-p-JNK. I risultati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (B) P38 totale e tirosina-fosforilata, JUK, actina e TNFR6 negli immunoprecipitati sono stati quantificati mediante analisi occidentali. Le altezze delle barre sono la media± SD di tre esperimenti indipendenti. *P,0.05; **P,0.01. Abbreviazioni:Conc, concentrazione; EGFR, recettore del fattore di crescita epidermico; JNK, chinasi ammino-terminale c-Jun; JNK, chinasi N-terminale c-Jun; NHDF, fibroblasto dermico umano normale;Cistanche, Piper CambogianoP. Fourn.; ROS, specie reattive dell'ossigeno; DS, deviazione standard; TNFR, recettore del fattore di necrosi tumorale; UV, ultravioletto.

L'irradiazione UV ha aumentato la produzione di ROS, mentreCistanche estratto ha ridotto la produzione di ROS nelle cellule NHDF. I livelli di ROS di H2 O2 sono stati misurati utilizzando i permeanti cellulari 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato (CM-H2 DCFDA) (Figura 5A). L'irradiazione UV ha aumentato i livelli di ROS di H2 O2 , mentre i livelli di ROS sono stati ridotti diCistanche estrarre in modo dose-dipendente (Figura 5B). Questi risultati lo hanno indicatoCistanchel'estratto protegge i fibroblasti dermici dall'irradiazione UV riducendo la generazione di ROS.

Osservazione macroscopica della guarigione delle ferite nei topi

Le ferite sono state create sul dorso dei topi e poi trattateCistancheestrarre (0, 1, 10 e 50µg/mL); le aree della ferita sono state misurate ogni giorno per 4 giorni. Il giorno 4, le aree circostanti le ferite inCistanchei topi trattati hanno mostrato una diminuzione del rossore in modo dose-dipendente rispetto alle aree della ferita non trattate (Figura 5). Le aree della ferita trattate con l'estratto erano più piccole dell'area della ferita non trattata, mostrando un modello dose-dipendente. Il giorno 4, le aree della ferita trattate con 50µg/ml diCistancheerano completamente ricoperti da nuovo epitelio. Nessuna area della ferita è stata infettata (Figura 6A e B). Sono stati calcolati i rapporti delle aree della ferita nei giorni 0 e 4 (Figura 6C).

Discussione

L'uso di materiali erboristici e di diverse parti di piante è aumentato con i concomitanti progressi della fitoterapia. I materiali a base di erbe sono stati utilizzati in varie forme come farmaci mono o polierbali, integratori alimentari e ingredienti dietetici, e molti sono diventati prodotti commerciali ben noti e sicuri.33Varie piante, tra cuiCistanche, sono stati studiati per le loro potenziali proprietà farmacologiche, ma nessuno studio comparativo è stato effettuato in precedenza conCistanche estratto. Questo studio è stato eseguito per determinaregli effetti diCistanche estratto sulle attività di guarigione delle ferite utilizzando modelli di ferite da incisione nei topi. La guarigione delle ferite comporta il ripristino dell'integrità dei tessuti attraverso processi associati a fasi di infiammazione, proliferazione e rimodellamento.34 La fase di rimodellamento cutaneo è caratterizzata dalla riformulazione e riformazione dei componenti delle fibre di collagene che migliorano la resistenza alla trazione.35Il processo di guarigione è regolato principalmente dalla biosintesi e dalla deposizione di nuovo collagene e dalla successiva maturazione.36Nel nostro studio sulle ferite,Cistanche l'estratto ha mostrato un aumento degli effetti di guarigione della ferita rispetto al controllo (figure 1C e 6). Tale guarigione potrebbe essere dovuta all'aumento della concentrazione di collagene e alla stabilizzazione delle fibre. Nel processo di riparazione dei tessuti, le cellule infiammatorie migliorano la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali, portando alla neovascolarizzazione delle cellule del tessuto connettivo che sintetizzano matrici extracellulari, inclusi collagene e cheratinociti, con conseguente riepitelizzazione del tessuto ferito.37Il tasso di contrazione della ferita più veloce può aumentare la comunicazione intracellulare giunzionale del gap nei fibroblasti e migliorare la maturazione più rapida del tessuto di granulazione.38Nel modello della ferita da incisione, i topi trattati conCistanchel'estratto ha mostrato una guarigione della ferita più rapida rispetto ai controlli (Figura 6). Numerosi studi hanno rivelato che la sottoregolazione della via della chinasi p38 protegge varie linee cellulari che esprimono p53-wild-type dallo stress genotossico.39,40I nostri dati hanno mostrato che l'espressione di p38 nelle cellule irradiate con raggi UV era sottoregolata daCistanche trattamento. Perciò,Cistanche l'estratto ottenuto da foglie e steli ha dimostrato un trattamento efficace nella guarigione delle ferite.Cistanchel'estrazione ha ridotto la produzione di ROS dall'irradiazione UV eliminando i ROS nelle cellule NHDF (figure 5A e B). Inoltre,Cistancheestrarre la guarigione accelerata della ferita dopo l'irradiazione della pelle ((Figura 6A-C). Questi risultati lo hanno suggeritoCistanche l'estratto protegge la pelle dai danni delle radiazioni UV e potrebbe essere utile come nuova materia prima nelle applicazioni cosmetiche.

Figura 5Cistanche-mediata inibizione della produzione di ROS in cellule irradiate con raggi UV.Appunti: (A) Le cellule sono state trattate con irradiazione UVB (40 J) per il tempo indicato e quindi incubate con 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato per 30 minuti. La generazione di ROS è stata misurata mediante FACS. (B) Le cellule sono state esposte a UVB (40 J) per 180 secondi e trattate con la concentrazione indicata diCistancheper 24 ore. La produzione di ROS è stata stimata con la colorazione di 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato e analizzati al FACS.Abbreviazioni:FACS, selezione cellulare attivata dalla fluorescenza; FITC, isotiocianato di fluoresceina; NHDF, fibroblasto dermico umano normale;Cistanche, Piper CambogianoP. Fourn.; ROS, specie reattive dell'ossigeno; UV, ultravioletto; UVB, ultravioletto B.

Figura 6Effetti di guarigione delle ferite sulla pelle del topo compromessa.Appunti: (A) Sono state create ferite di 5-mm di diametro sulla pelle dorsale di 7-topi maschi C57Bl/6 di una settimana (n=3). Il recupero delle ferite è stato valutato conCistanchetrattamento nelle diverse concentrazioni (controllo negativo e trattamento post ferita conCistanchea 1, 10 e 50µg/ml). (B) L'area della ferita è stata determinata misurando il diametro delle ferite aperte. (C) L'area della ferita è stata calcolata utilizzando la dimensione delle ferite aperte; *P,0.05; **P,0.01. Abbreviazioni:Cistanche, Piper CambogianoP. Quattro; Conc, concentrazione.

Conclusione

Questo studio ha indagato ilpotenziali effetti antietà e cicatrizzanti del gambo di Cistanche e dell'estratto di foglienelle cellule NHDFe un modello murino di guarigione delle ferite. ILtrattamento delle cellule NHDF con Cistanche estrattifavorisce il recupero della zona graffiatain modo dose-dipendente così come il potenziamento dell'espressione genica della ECM. Inoltre, CistancheestrattiEra in grado diproteggere la cellula dall'esposizione ai raggi UV riducendo la produzione di ROS. Infine, queste osservazioni vengono ulteriormente valutate e confermate nei topi modello per la guarigione delle ferite in vivo. Perciò,L'estratto di cistanche rappresenta un promettente nuovo agente terapeutico per il trattamento antietà e cicatrizzante.

Ringraziamenti:Questo studio è stato sostenuto dal Basic Science Research Program attraverso la National Research Foundation of Korea (NRF), finanziato dal Ministero dell'Istruzione (NRF-2014R1A1A3050752). Gli autori desiderano ringraziare il Korea Research Institute of Bioscience & Biotechnology (KRIBB) per aver fornito aCistancheestratti.

Divulgazione Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.

Riferimenti

1. Slominski AT, Zmijewski MA, Semak I, et al. Citocromi p450 e cancro della pelle: ruolo delle vie endocrine locali.Agenti antitumorali Med Chem. 2014;14(1):77–96. 

2. Gilchrest BA. Invecchiamento cutaneo e fotoinvecchiamento.Dermatol Nurs. 1990; 2(2):79–82. 

3. Ah TY. Sviluppo di materiali alimentari funzionali per una vita sana.Coreano J Crop Sci. 2006;51:26–39.

4. Makrantonaki E, Zoubulis CC. Meccanismi molecolari dell'invecchiamento cutaneo: stato dell'arte.Ann NY Acad Sci. 2007;1119:40–50. 

5. Seo MY, Chung SY, Choi WK, et al. Effetto antietà del vino di riso nei fibroblasti e nei cheratinociti umani in coltura.J Biosci Bioeng. 2009; 107(3):266–271. 

6. Kligmann AM. Effetto distruttivo precoce della luce solare sulla pelle umana.GIAMA. 1969;210(13):2377–2380. 

7. Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M. Alterazioni del tessuto connettivo nella pelle esposta a radiazioni UV naturali e terapeutiche.Fotodermatolo. 1985;2(1):15–26. 

8. Bech-Thomsen N, Wulf HC. Effetti cancerogeni e melanogenici di una sorgente UVA ad alogenuri metallici filtrati e di una sorgente abbronzante UVA fluorescente tubolare con o senza radiazioni UV aggiuntive simulate dal sole in topi senza pelo.Fotochimica Photobiol. 1995;62(4):773–779.

9. De MS, Lahiri SC. Studi sulle foglie di Piper betle.Toro Calcutta Sch Trop Med. 1971;19(3):69–72.

10. Ferreres F, Oliveira AP, Gil-Izquierdo A, Valentão P, Andrade PB. Foglie di Piper betle: profilazione dei composti fenolici mediante HPLC/DAD-ESI/MS(n) e attività anticolinesterasica.Fitochimica anale. 2014;25(5): 453–460.