Effetti antietà degli antociani di Ribes Meyeri sulle cellule staminali neurali e sui topi che invecchiano Parte 2

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Nar salva i fenotipi senescenti di 23M-NSC

Gli antociani di R. Meyer sono ricchi di molti tipi di flavonoidi e componenti bioattivi [1,3-5]. Per determinare quale componente degli antociani di R. Meyer svolge un ruolo importante nell'anti-invecchiamento, abbiamo eseguito un'analisi metabolomica di R. Antociani di Meyer. Abbiamo rivelato che Nar potrebbe essere un importante metabolita flavonoide perché la via biosintetica dei flavonoidi era altamente arricchita in antociani di R. Meyer (Tabella supplementare 1). Per determinare gli effetti anti-senescenti di Nar, sono state applicate varie concentrazioni (0, 1.7,3.4,6.8,13.6 e 27,2 ug/mL) a 23M-NSC e sono stati utilizzati saggi CCK-8 per studiare la vitalità cellulare. Come mostra la Figura 3 supplementare, il trattamento con Nar 6,8 ug/mL ha aumentato la vitalità cellulare del 150 percento. Per esplorare ulteriormente gli effetti anti-senescenti di Nar, i 23M-NSC sono stati trattati con Nar e sono stati quindi rilevati indicatori correlati all'invecchiamento .utilizza l'esperidinaIn 23M-NSC trattati con 6,8 ug/mL Nar, l'espressione dell'mRNA di p16nk4a è stata ridotta (Figura 3A). Nar ha anche allungato i telomeri di mNSC in coltura e ha aumentato la sintesi del DNA (Figura 3B, 3C). Per esplorare ulteriormente gli effetti di Nar sulla proliferazione cellulare, abbiamo eseguito la colorazione con immunofluorescenza di Ki67, che è un antigene nucleare delle cellule mitotiche espresso durante il ciclo cellulare, ad eccezione di G0 [19,27]. Il trattamento con Nar ha migliorato la proliferazione cellulare, misurata dall'aumento del numero di cellule Ki67-positive (Figura 3D, 3E). Successivamente, abbiamo anche rilevato il potenziale di differenziazione delle NSC in neuroni. In effetti, il trattamento con 6,8 ug/mL di Nar ha anche aumentato il numero di cellule MAP2-positive (Figura 3F, 3G). Questi risultati dimostrano costantemente che Nar può invertire la senescenza 23M-NSC.

Figura 2. Gli antociani di Ribes Meyer migliorano la memoria del topo e le capacità di apprendimento aumentando le cellule staminali neurali (NSC). (A) È necessario del tempo per trovare la piattaforma. (B) Viene impiegato del tempo per raggiungere prima la piattaforma. (C) Velocità media per trovare la piattaforma. (D) Nuotò a distanza prima di trovare la piattaforma. (E.F)Trattamento con R.perduta impero cistancheogni antocianina ha aumentato il numero e le dimensioni della neurosfera rispetto ai controlli. (G) Le dimensioni delle neurosfere di 50-100 um sono state aumentate di numero dal trattamento con antociani di R. Meyer nei topi. I dati sono presentati come la media ± DS di tre esperimenti indipendenti. *P<><0.01, and=""><0.0001 compared="" with="" untreated="" cells."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" in="" each="" experimental="">

Figura 3. Effetto della naringenina (Nar) sulla senescenza delle cellule staminali neurali del topo (MNC). (A) L'espressione dell'mRNA di p16k4a è stata misurata mediante qRT-PCR in 23M-NSC con e senza trattamento di 6,8 ug/mL di Nar per 48 ore. (B) Distribuzioni di fase del ciclo cellulare di 23M-NSC trattate con Nar per 48 ore e cellule di controllo. (C) La lunghezza relativa dei telomeri di 23M-NSC è aumentata in modo significativo con il trattamento Nar, (D) immunofluorescenza Ki67 colorazione dei muscoli trattati con Nar per 48 h, con etichettatura nucleare DAPI, (E) Quantificazione di (D), (F) Rappresentante campi di colorazione con immunofluorescenza MAP2 e GFAP di mNSC in coltura dopo il controllo e il trattamento con Nar. (G) Quantificazione di (F). I dati sono presentati come media ± DS di tre esperimenti indipendenti. *P<>< 0.01,="" and="">< 0.0001="" compared="" with="" untreated="">

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Nar migliora la memoria e la cognizione nei topi che invecchiano

I livelli cognitivi diminuiscono con l'invecchiamento e i trattamenti antietà possono migliorare i livelli cognitivi [11, 28]. Per verificare gli effetti anti-invecchiamento di Nar in Vivo, abbiamo iniettato 20 mg/kg di Nar in topi C57BL/6 invecchiati (12 mesi) attraverso la vena della coda. Il test MWM è stato utilizzato per esaminare la memoria spaziale e le capacità cognitive dei topi.frazione flavonoide purificata micronizzata 1000 mg utilizzaIn 5 giorni di allenamento ripetuto, il tempo impiegato dai topi anziani trattati con Nar per trovare la piattaforma è gradualmente diminuito rispetto al gruppo di controllo (Figura 4A). I risultati del test hanno rivelato che il tempo impiegato per raggiungere la piattaforma è stato ridotto (Figura 4B), mentre è stato aumentato il tempo trascorso nella zona della piattaforma (Figura 4C). Inoltre, i topi invecchiati trattati con Nar sono stati osservati all'interno della zona della piattaforma a una frequenza maggiore rispetto al gruppo di controllo (Figura 4D). Insieme, questi risultati suggeriscono che Nar può migliorare la memoria spaziale e le capacità cognitive nei topi che invecchiano.

Analisi del sequenziamento dell'RNA del sangue trattato con Nar da topi anziani

Per studiare i meccanismi anti-invecchiamento specifici di Nar, abbiamo analizzato il profilo di espressione genica del sangue trattato con Nar da topi anziani utilizzando il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq). I risultati hanno rivelato 1.961 geni differenzialmente espressi (DEG). In generale, Nar ha sottoregolato l'espressione genica e solo un piccolo numero di geni è stato sovraregolato rispetto al gruppo di controllo non trattato (Figura 5A, 5B). Inoltre, importanti geni della via di segnalazione legati all'invecchiamento sono stati sottoregolati, in particolare quelli nella via di segnalazione del TNF (Figura 5C).oteflavonoideQuesti risultati implicano che Nar influenza la via di segnalazione del TNF, influenzando così profondamente la funzione del TNF-a, che è coinvolto nel deterioramento cognitivo correlato all'invecchiamento [29,30]. Pertanto, abbiamo esaminato i livelli di TNF nel plasma dei topi. Risultati dei saggi di immunoassorbimento d (ELISA) legati all'enzima

Figura 4. Naringenin (Nar) migliora la memoria e le capacità di apprendimento nei topi che invecchiano. (A) La latenza di fuga dei topi anziani trattati con Nar era più breve rispetto al gruppo di controllo. (B) Il tempo impiegato per raggiungere la piattaforma è stato più breve nei topi invecchiati trattati con Nar rispetto al gruppo di controllo. (C) Durata del tempo trascorso nella zona della piattaforma. (D) Frequenza di osservazione nella zona della piattaforma per i topi invecchiati trattati con Nar rispetto al gruppo di controllo. I dati sono presentati come la media ± DS di tre esperimenti indipendenti.*P<>< 0.01,=""><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group."n"="" indicates="" the="" number="" of="" animals="" used="" for="" each="" experimental="" group.="" revealed="" that="" nar="" treatment="" led="" to="" the="" downregulation="" of="" plasma="" tnf-a="" levels="" (figure="" 5d).="" we="" also="" examined="" pl6ink4agene="" expression="" in="" the="" hippocampus="" of="" mice="" and="" demonstrated="" that="" nar="" treatment="" downregulates="" pl6ink4amrna="" expression(figure="">

Cistanche può antietà

DISCUSSIONE

L'invecchiamento è associato ad un aumentato rischio di declino cognitivo, nonché a una perdita di capacità di apprendimento e memoria [22,23]. La perdita neuronale e la neurogenesi compromessa sono strettamente correlate alla disfunzione cerebrale associata all'età [11-13]. Pertanto, l'aumento del numero di neuroni e il miglioramento della neurogenesi sono fondamentali per il trattamento antietà. R. Meyer, una pianta ricca di flavonoidi e altre sostanze bioattive [1, 3-6], ha molte funzioni che non sono state ancora descritte. Nel presente studio, gli antociani di R. Meyer hanno promosso la proliferazione delle NSC e hanno aumentato la formazione di neurosfere con morfologia uniforme. Il trattamento con antociani di R. Meyer ha anche migliorato il fenotipo dell'invecchiamento cellulare, con livelli ridotti di ROS e espressione del gene P16nk4 correlato all'invecchiamento, aumento della fase di sintesi del DNA e telomeri allungati.puritani vitamina cInoltre, i risultati della colorazione con immunofluorescenza hanno rivelato che gli antociani R Meyer stimolavano la formazione di neuroni. Questi risultati suggeriscono che gli antociani di R. Meyer hanno effetti anti-invecchiamento sulle mNSC e possono anche promuovere direttamente la formazione di neuroni in vitro. Inoltre, il declino cognitivo è strettamente correlato all'invecchiamento [22, 23]. I nostri risultati MWM hanno dimostrato che la somministrazione intragastrica di antocianine di R. Meyer ha migliorato la memoria spaziale e le capacità di apprendimento nei topi anziani e ha anche aumentato

Figure 5. Tumor necrosis factor(TNF)-a plays an essential role in naringenin (Nar)-mediated anti-aging effects. (A) Summary of gene expressions in mouse blood, as determined by RNA-seq. (B)Heatmap showing differentially expressed genes (DEGs) in the blood between control and Nar-treated mice. DEGs were identified by a fold change of >2.0 o<0.5. (c)bar="" graph="" showing="" the="" major="" correlated="" signaling="" pathways.="" (d)="" heatmap="" showing="" degs="" in="" the="" tnf="" signaling="" pathway="" (e)="" plasma="" tnf-a="" levels="" determined="" by="" enzyme-linked="" immunosorbent="" assay.="" (e)="" p16hka="" gene="" expression="" levels,="" as="" determined="" by="" qrt-pcr.="" data="" are="" presented="" as="" the="" mean="" ±="" sd="" of="" three="" independent=""><><><0.0001 compared="" with="" the="" control="" group.="" nsc="" and="" neuronal="" numbers="" in="" the="" hippocampus="" of="" aging="" mice.="" these="" results="" suggest="" that="" r.="" meyer="" anthocyanins="" may="" enhance="" cognitive="" function="" by="" increasing="" nsc="" proliferation="" and="">

L'uso dell'analisi metabolomica per studiare la composizione specifica degli antociani di R. Meyer ha rivelato che il nar potrebbe essere un importante metabolita flavonoide. È stato precedentemente segnalato che il nar migliora la senescenza delle cellule del miocardio [31], migliora la capacità metabolica del tratto intestinale [32] ed esercita effetti antinfiammatori [33] e antitumorali [34]. Tuttavia, gli effetti di Nar sulle NSC durante l'invecchiamento rimangono sconosciuti. Per esplorare gli effetti anti-invecchiamento degli antociani di R. Meyer, abbiamo condotto ulteriori studi utilizzando Nar. Il trattamento con 6,8 ug/mL di Nar ha aumentato la vitalità cellulare, ridotto l'espressione del gene P16ink4a, allungato i telomeri e promosso la differenziazione delle NSC in neuroni in vitro. Per valutare ulteriormente gli effetti di Nar sulla proliferazione cellulare, abbiamo eseguito studi di immunofluorescenza. I risultati hanno indicato che il trattamento con Nar ha aumentato sia il numero di cellule Ki67-positive sia la proporzione di cellule MAP2-positive, suggerendo che Nar può promuovere la neurogenesi. Inoltre, gli effetti di Nar sull'apprendimento e sulla memoria sono stati valutati anche nei topi che invecchiano. I risultati del test MWM hanno costantemente dimostrato che il trattamento con Nar migliora l'apprendimento spaziale nei topi che invecchiano. È interessante notare che l'analisi dell'RNA-seq ha rivelato che Nar può influenzare la senescenza attraverso la via di segnalazione del TNF, in particolare sottoregolando l'espressione del TNF-a nel sangue dei topi che invecchiano. I test ELISA hanno anche indicato che il trattamento con Nar riduce i livelli plasmatici di TNF-a rispetto ai topi di controllo che invecchiano. Il TNF-a è un fattore chiave nella via di segnalazione del TNF ed è strettamente correlato all'invecchiamento cognitivo. Le sue funzioni includono la promozione di alterazioni patologiche nelle sinapsi ippocampali [29] e l'inibizione della proliferazione delle cellule precursori [35]. Livelli alterati di TNF sono associati a deterioramento cognitivo nella depressione, nella schizofrenia, nel disturbo bipolare e nel morbo di Alzheimer [30,36,37]. Più specificamente, il TNF-a è sovraregolato nei pazienti con malattia di Alzheimer [38].

In sintesi, il nostro studio dimostra che gli antociani di R. Meyer migliorano gli effetti dell'invecchiamento nelle NSC tramite Nar, che riduce i livelli di TNF-a in vivo e migliora la cognizione nei topi che invecchiano. Collettivamente, i nostri risultati forniscono una nuova strategia per lo sviluppo di trattamenti clinici, volti a una maggiore realizzazione del valore medicinale degli antociani di R.Meyer.

MATERIALI E METODI

Animali da esperimento

Questo studio è stato approvato dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Tongji e condotto in conformità con le linee guida istituzionali. Gli antociani di R. Meyer sono stati somministrati per via intragastrica da 2 mesi a 12- topi di un mese mantenuti sullo sfondo C57BL/6. Nar è stato iniettato nella vena caudale da 1-mesi a 12- topi di età mantenuti sullo sfondo C57BL/6. Ai topi di controllo è stato somministrato lo stesso volume di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).

Preparazione di antociani di R. Meyer e Nar

Il frutto di R. Meyer (500 g) è stato omogeneizzato utilizzando un omogeneizzatore per tessuti e sospeso in 1 L di metanolo contenente lo 0,1% di acido cloridrico. L'estrazione ad ultrasuoni è stata eseguita tre volte per 30 minuti a temperatura ambiente. Gli estratti sono stati combinati e il metanolo è stato concentrato a pressione ridotta per ottenere estratti di R Meyer. L'estratto è stato ulteriormente purificato con resina macroporosa AB-8 per aumentare il contenuto di antociani.

Naringenin(C15H1205; MW:272,25; purezza: maggiore o uguale al 98%; grado HPLC) è stata acquistata da Chengdu Push Biotechnology Co. Ltd.(Sichuan, Cina) e conservata a 2 gradi {{6 }} grado in un ambiente asciutto e senza luce. La concentrazione della soluzione madre era 100 mM in dimetilsolfossido (DMSO). La concentrazione finale di DMSO non ha superato lo 0,1 percento nel mezzo di coltura.

Neurosfera e saggi di differenziazione

Le NSC sono state derivate dal topo SVZ. I topi sono stati sacrificati dopo l'anestesia e la SVZ è stata accuratamente sezionata e dissociata in singole cellule con 0.4 U/mL di papaina (Imogen, Alexandria, VA, USA; Cat No: LS003126). Le NSC sono state piastrate in piastre da 10 cm contenenti 10 ml di terreno basale NSC con 10 ng/ml di EGF (PeproTech, Cranbury, NJ, USA; Cat No: AF-100-15) e 10 ng/ml di FGF (PeproTech, Cranbury, NJ , USA; Cat No:AF-100-18B). Le neurosfere sono state attraversate ogni 5 giorni. NSC da neurosfere di passaggio{10}} appena dissociate sono state seminate su laminina (Gibco, Gaithersburg, MD, USA; Cat No: 23017015) e poli-L-ornitina bromidrato (Poly-L; Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA ; Cat No: P3655) vetrini rivestiti in NSCBasalMedium senza supplementi di differenziazione. Le cellule differenziate sono state immunocolorate per Tu1 (beta-tubulina II; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA; Cat No: 480011), MAP2 (Thermo Fisher Scientific, Cat No: MA5-12826) e proteina acida fibrillare gliale (GFAP; Thermo Fisher Scientific, N. cat. PA5-16291), e poi controcolorato con 4'6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; Thermo Fisher Scientific, N. cat: D1306). I vetrini sono stati esaminati utilizzando un microscopio Olympus BX53 (Olympus, Madison, WI, USA). La quantificazione delle cellule TuJ1- e MAP2-positive è stata eseguita contando le cellule etichettate da tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un test t spaiato.

Questo articolo è tratto da www.aging-us.com AGING 2020, vol. 12, n. 17