Fattori Funzionali Antietà E Meccanismo Della Cistanche Deserticola Ⅱ

3. Risultato

3.1 Potenziali principi attivi e bersagli di Cistanche deserticola

Esaminando la letteratura e combinando con la ricerca precedente di questo gruppo di ricerca, 12 componenti chimici tra cui glicosidi del feniletanolo, iridoidi e lignani sono stati selezionati come composti target per la ricerca farmacologica di rete. Le informazioni specifiche sono mostrate nella Tabella 3. Dopo aver rimosso i duplicati dal database, sono stati ottenuti un totale di 86 target per 12 potenziali ingredienti attivi.

Cistanche di alta qualità per anti-età

3.2 Obiettivi legati all’invecchiamento

7753 e 295 target legati all'invecchiamento sono stati raccolti rispettivamente nei database GeneCards e OMIM.

3.3 Obiettivi comuni di farmaci e malattie e costruzione della rete PPI

L'intersezione di bersagli farmacologici e bersagli patologici ha prodotto 75 bersagli di intersezione, che sono stati importati nella piattaforma di analisi di rete STRING, i nodi non connessi nella rete sono stati nascosti ed è stata costruita una rete PPI. Consulta i materiali di pubblicazione migliorati. Nella rete PPI ci sono complessivamente 45 nodi e 59 connessioni. Otto obiettivi principali sono stati selezionati attraverso l'analisi topologica, come mostrato nella Tabella 4.

3.4 Analisi di arricchimento GO e analisi di arricchimento KEGG

Attraverso il database OmicsBean, i target principali sono stati sottoposti all'arricchimento funzionale GO e all'analisi del percorso KEGG. L'analisi GO comprende tre aspetti: componente cellulare, funzione molecolare e processo biologico. I primi 10 elementi con il valore P più basso vengono visualizzati nel materiale di pubblicazione migliorato. I risultati mostrano che i processi biologici coinvolgono principalmente la regolazione del metabolismo reattivo dell'ossigeno, la regolazione positiva delle risposte immunitarie, la localizzazione delle proteine ​​negli organelli, la digestione dei polisaccaridi, ecc.; i componenti cellulari comprendono principalmente il sistema endomembrana, la regione extracellulare, la membrana plasmatica e le cellule legate alla membrana.

Organi, corpi secretori extracellulari, apparato di Golgi, ecc.; le funzioni molecolari sono principalmente legate all'attività della glucosidasi, all'attività regolatoria dell'ossido nitrico sintasi, al legame dei carboidrati, all'attività della -fruttosio furanosidasi, ecc. Un totale di 27 percorsi correlati all'invecchiamento sono stati ottenuti attraverso lo screening dell'arricchimento KEGG e i 20 percorsi principali sono stati inseriti in un percorso diagramma a bolle (vedi materiali di pubblicazione avanzati). Cistanche deserticola ritarda l'invecchiamento.

Tabella 3 Principi attivi di Cistanche deserticola

Tabella 4: Obiettivi principali di Cistanche deserticola per ritardare l'invecchiamento

Coinvolge principalmente le vie del cancro, i sistemi neurosecretori e le vie di trasduzione del segnale. Le vie del cancro includono principalmente il cancro alla prostata, il cancro al seno e altre vie; il sistema neuroendocrino coinvolge la via di segnalazione degli estrogeni, la via di segnalazione del GnRH e la via di segnalazione dell'insulina (via di segnalazione dell'insulina) e così via; le vie di segnalazione includono la via di segnalazione della fosfatidilinositolo 3-chinasi-proteina chinasi B (PI3K Akt) e la via di segnalazione della fosfolipasi D (via di segnalazione della fosfolipasi D).

3.5 Costruzione della rete materiali medicinali-componenti-bersagli-percorsi

I principi attivi, i bersagli e i percorsi della Cistanche deserticola che ritardano l'invecchiamento sono stati mappati nella rete materiale medicinale-ingrediente-bersaglio-percorso attraverso il software Cytoscape 3.8.0. Ci sono un totale di 114 nodi e 218 linee in questa rete (vedi materiale di pubblicazione ampliato).

3.6 Effetto di Cistanche deserticola sulla durata della vita dei nematodi

I risultati del test di tossicità sono mostrati nella Figura 1. Rispetto al gruppo di controllo, Cistanche deserticola 25 e 50 ug·mL–1

Può prolungare la durata della vita dei nematodi. 100 ug·mL–1 non hanno effetti evidenti. 200 e 500 ug·mL–1

Ha una certa tossicità per i nematodi e ne accorcia la durata della vita. In base ai risultati del test di tossicità, selezionare

Cistanche deserticola è stata somministrata a concentrazioni di massa di 25, 50, 75 e 100 ug·mL–1 per determinare la durata della vita dei nematodi N2. I risultati sono mostrati nella Tabella 5. Rispetto al gruppo di controllo, Cistanche deserticola 25, 50, 75 ug·mL–1

La durata della vita dei nematodi nel gruppo era significativamente estesa, quindi gli esperimenti successivi sono stati condotti a 25, 50 e 75 ug·mL–1.

Figura 1 Curva di sopravvivenza dei nematodi dopo somministrazione di diverse concentrazioni di massa di Cistanche deserticola

• Leggenda:

• Rosso: gruppo di controllo
• Blu: Gruppo Cistanche 25 µg·mL⁻¹
• Verde: Gruppo Cistanche 50 µg·mL⁻¹
• Viola: Gruppo Cistanche 100 µg·mL⁻¹
• Arancione: Gruppo Cistanche 200 µg·mL⁻¹
• Marrone: Gruppo Cistanche 500 µg·mL⁻¹

• Assi:

• Asse Y: tasso di sopravvivenza (%)

• Asse X: Tempo (t/d)

  
  

3.7 Effetto di Cistanche deserticola sulla capacità di stress dei nematodi

In condizioni di stress ossidativo indotto da H2O2-, rispetto al gruppo di controllo, la durata della vita dei nematodi nel gruppo di trattamento con Cistanche deserticola è stata estesa (Figura 2A). La durata media della vita dei nematodi nel gruppo di controllo era (1,44±0.07) h, e Cistanche deserticola 75 ug·mL– La durata media della vita dei nematodi nel gruppo 1 era (2,02 ±0,05) h e la durata della vita è stata significativamente estesa (P<0. 001). Under heat stress conditions, compared with the control group, the heat shock resistance of nematodes in the Cistanche deserticola treatment group was improved and their lifespan was extended (Figure 2B). The average lifespan of nematodes in the control group was (19.25±0.20) h, and that of Cistanche deserticola was 75 The average lifespan of nematodes in the μg·mL–1 group was (22.80±0.08) h, and compared with the control group, the lifespan extension effect was significant (P<0.001).

Tabella 5 Effetto di diverse concentrazioni di massa di Cistanche deserticola sulla durata della vita dei nematodi (xˉ±s, n=100)

Nota:Rispetto al gruppo di controllo, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.

3. 8 Effetto di Cistanche deserticola sull'accumulo di lipofuscina e sulla capacità di flessione del corpo dei nematodi

La lipofuscina si accumula gradualmente con l'età. Rispetto al gruppo di controllo, i livelli di fluorescenza blu dei nematodi nei gruppi Cistanche deserticola 25, 50 e 75 ug·mL–1 sono diminuiti rispettivamente del 15,09%, 28,7% e 39,{9}}% il 7° giorno (Figura 3A~B); L'undicesimo giorno, i livelli di fluorescenza blu sono diminuiti rispettivamente dell'8,55%, 22,36% e 36,84%, indicando che Cistanche deserticola ha inibito l'accumulo di lipofuscina.

L'effetto di Cistanche deserticola sulla capacità di flessione del corpo dei nematodi è mostrato nella Figura 3C. Rispetto al gruppo di controllo, il numero di tempi di piegamento del corpo dei nematodi nel gruppo Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 è aumentato del 25% e del 36% entro 30 s nei giorni 3 e 7, rispettivamente. 17%, indicando che Cistanche deserticola può favorire la flessione del corpo dei nematodi.

3.9 Effetto di Cistanche deserticola sulla capacità di deglutizione e sulla capacità riproduttiva dei nematodi

Nei giorni 3 e 7, rispetto al gruppo di controllo, non vi era alcuna differenza statisticamente significativa nella velocità di pompaggio faringeo (numero di pompe faringee entro 60 s) dei nematodi nel gruppo di somministrazione di Cistanche deserticola (Figura 4A), indicando che Cistanche deserticola non ha modificato la velocità di pompaggio faringeo dei nematodi N2. L'assunzione di cibo e gli effetti sulla longevità mediati da Cistanche deserticola non dipendono dalla restrizione dietetica. Non sono stati riscontrati cambiamenti significativi nel numero di uova (Figura 4B) e nel numero di figli (Figura 4C) dei nematodi trattati con il farmaco rispetto al gruppo di controllo, indicando che Cistanche deserticola non ha influenzato la capacità riproduttiva dei nematodi.

3.10 Effetto di Cistanche deserticola sul contenuto di ROS, MDA e sull'attività enzimatica antiossidante

La tossicità acuta da stress provoca un aumento dei livelli di ROS. Come mostrato nelle Figure 5A e 5B, rispetto al gruppo di controllo, il livello di accumulo di ROS dei nematodi nel gruppo Cistanche deserticola era significativamente ridotto al 7° giorno di somministrazione (P<0.05, P<0.01, P<0.001). In order to explore the effect of Cistanche deserticola on the endogenous antioxidant defense ability of nematodes, the activity of antioxidant enzymes in nematodes was measured. Compared with the control group, the SOD, CAT, and GSH-Px activities of nematodes in the Cistanche deserticola 25, 50, and 75 μg·mL–1 groups were significantly increased (Figure 5C~E). MDA is an important biomarker of lipid peroxidation. Compared with the control group, the MDA level in nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced (P<0.05, Figure 5F). The above results show that Cistanche deserticola can effectively alleviate oxidative stress in nematodes.

• Leggenda:

• Rosso: gruppo di controllo
• Blu: Gruppo Cistanche 25 µg·mL⁻¹
• Verde: Gruppo Cistanche 50 µg·mL⁻¹
• Viola: Gruppo Cistanche 100 µg·mL⁻¹
• Arancione: Gruppo Cistanche 200 µg·mL⁻¹
• Marrone: Gruppo Cistanche 500 µg·mL⁻¹

3.11 Effetto di Cistanche deserticola sull'espressione dell'mRNA di geni legati all'invecchiamento

La via di segnalazione dell'insulina (IIS) tra le prime 20 vie analizzate da KEGG è strettamente correlata all'invecchiamento di C. elegans e la ricerca sul meccanismo è relativamente matura [10], verificando così l'espressione dei geni correlati all'invecchiamento sulla via di segnalazione dell'insulina. I peptidi simili all'insulina (ILP) rilasciati in C. elegans si legano al loro recettore DAF-2 e attivano il prodotto finale della glicazione avanzata -1 (AGE-1), che attiva ulteriormente la proteina chinasi B{{ 7}}/2 (Atto-1/2). , fosforilando il fattore di trascrizione DAF-16, con conseguente attività DAF-16 e

La sua migrazione al nucleo è inibita [11]. Come mostrato nella Figura 6, rispetto al gruppo di controllo, i livelli di espressione dell'mRNA di DAF-2, AGE-1 e Akt-1 nei nematodi della Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 gruppo erano significativamente ridotti (P<0.05, P<0.01) , the expression level of DAF-16 mRNA was significantly increased (P<

0.01). È stato dimostrato che l'effetto di estensione della vita mediato da Cistanche deserticola dipende dalla via di segnalazione dell'IIS. Il gene sir-2.1 svolge un ruolo importante nelle attività fisiologiche come l'invecchiamento dei nematodi, lo stress e l'apoptosi. L'aumento dell'espressione del gene sir-2.1 prolungherà la durata della vita dei nematodi [12], ma non vi è alcun effetto dopo la somministrazione del farmaco. Modificato in modo significativo il livello di espressione di SIR-2. 1 mRNA (Figura 6). HSF-1 e SKN-1 svolgono un ruolo importante nella regolazione dello stress ossidativo e dell'invecchiamento in C. elegans [11]. I risultati hanno mostrato che, rispetto al gruppo di controllo, Cistanche deserticola 75 ug·mL–1

I livelli di espressione di HSF-1, HSP-16. 1, PAS-16. 2 e l'mRNA SKN-1 nel gruppo C. elegans erano significativamente aumentati (Figura 6). I fattori di trascrizione DAF-16/forkhead box protein (FOXO) e SKN-1/fattore di trascrizione nucleare E2-fattore correlato 2 (Nrf2) sono attivati ​​e possono regolare molti geni che codificano per fattori antiossidanti proteine ​​[13]. Rispetto al gruppo di controllo, i livelli di espressione degli mRNA SOD-3, GST-4, CTL-1, CTL-2 e MTL-1 dei nematodi nel Il gruppo Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 era significativamente aumentato, indicando che la Cistanche deserticola può aumentare la capacità antiossidante. prolungare la tua vita. La restrizione dietetica può migliorare la funzione mitocondriale e prolungare la durata della vita limitando l’assunzione di cibo [14]. Non è stata riscontrata alcuna differenza statisticamente significativa nell'espressione dell'mRNA EAT-2 nei nematodi di ciascun gruppo, indicando che l'effetto di estensione della vita mediato da Cistanche deserticola non si verifica attraverso il percorso di restrizione dietetica (Figura 6).

Figura 4 Effetto di Cistanche deserticola sulla capacità di deglutizione e sulla capacità riproduttiva dei nematodi (xˉ±s, n=5)

Leggenda:

• 对照组: gruppo di controllo
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: Cistanche 25 ug/mL gruppo
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组: Cistanche 50 ug/mL gruppo
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: Cistanche 75 ug/mL gruppo

Grafico B:

• 30 s内水平游泳距离/次: distanza di nuoto orizzontale in 30 secondi/ora
• 第3日: Giorno 3
• 第7日: Giorno 7

Grafico C:

• 相关水平的百分率: Percentuale del livello corrispondente
• 第7日: Giorno 7
• 第11日: Giorno 11

Grafico A:

• 60 s内爬壁次数: numero di arrampicate su pareti in 60 secondi
• 第{{0}}日: Giorno 0
• 第3日: Giorno 3
• 第7日: Giorno 7

Grafico B:

• 广泛测试得分: punteggio del test in campo aperto
• 第1日: Giorno 1
• 第2日: Giorno 2
• 第3日: Giorno 3
• 第4日: Giorno 4
• 第5日: Giorno 5

Grafico C:

• 千元迷宫次数: errori Y-maze
• 第1日: Giorno 1
• 第2日: Giorno 2
• 第3日: Giorno 3
• 第4日: Giorno 4
• 第5日: Giorno 5

3. 12 Effetto di Cistanche deserticola sulla durata della vita dei nematodi con mutanti genetici correlati

Rispetto al gruppo di controllo, la curva della durata di vita dei nematodi mutanti dei geni daf{{0}}, skn-1 e hsf-1 nel gruppo Cistanche deserticola 75 ug·mL–1 è risultata non spostarsi significativamente a destra dopo il trattamento (Figura 7A~C). La durata media della vita dei nematodi mutanti del gene eat -2 è aumentata del 16,45% (P <0,001, Figura 7D).

I risultati hanno mostrato che l'effetto di estensione della vita mediato da Cistanche deserticola era correlato ai geni daf-16, hsf-1 e skn-1, ma non al gene eat-2 .

3.13 Effetto di Cistanche deserticola sulla traslocazione nucleare delle proteine ​​DAF-16 e SKN-1

Immagini rappresentative dell'espressione della proteina DAF-16 nel citoplasma, nello spazio intercellulare e nel nucleo sono mostrate nella Figura 8A. Rispetto al gruppo di controllo, il rapporto di localizzazione nucleare della proteina DAF-16 nei nematodi era significativamente aumentato e il rapporto di localizzazione citoplasmatica era significativamente ridotto dopo la somministrazione di Cistanche deserticola (P<0.05, P<0.01, P<0.001, Figure 8C). Representative pictures of SKN-1 protein expression in the cytoplasm and nucleus are shown in Figure 8B. Compared with the control group, the proportion of SKN-1 protein localized in the cytoplasm of nematodes in the Cistanche deserticola 75 μg·mL–1 group was significantly reduced, while the proportion of nuclear localized protein was significantly increased (P<0.05, Figure 8D).

Figura 5 Effetti di Cistanche deserticola su ROS, contenuto di MDA e attività enzimatica antiossidante nei nematodi (xˉ±s, n=100)

Leggenda:

• 对照组: gruppo di controllo
• 肉苁蓉 25 ug·mL-1组: Cistanche 25 ug/mL gruppo
• 肉苁蓉 50 ug·mL-1组: Cistanche 50 ug/mL gruppo
• 肉苁蓉 75 ug·mL-1组: Cistanche 75 ug/mL gruppo

Grafico B:

• 30 s内水平游泳距离/次: distanza di nuoto orizzontale in 30 secondi/ora
• 第3日: Giorno 3
• 第7日: Giorno 7

Grafico C:

• 相关水平的百分率: Percentuale del livello corrispondente
• 第7日: Giorno 7
• 第11日: Giorno 11

Grafico A:

• 60 s内爬壁次数: numero di arrampicate su pareti in 60 secondi
• 第{{0}}日: Giorno 0
• 第3日: Giorno 3
• 第7日: Giorno 7

Grafico B:

• 广泛测试得分: punteggio del test in campo aperto
• 第1日: Giorno 1
• 第2日: Giorno 2
• 第3日: Giorno 3
• 第4日: Giorno 4
• 第5日: Giorno 5

Grafico C:

• 千元迷宫次数: errori Y-maze
• 第1日: Giorno 1
• 第2日: Giorno 2
• 第3日: Giorno 3
• 第4日: Giorno 4

• 第5日: Giorno 5

  
  

3. 14 Effetto di Cistanche deserticola sull'espressione proteica di SOD-3, GST-4 e HSP-16.2 nei nematodi

I livelli di espressione delle proteine ​​SOD-3, GST-4 e HSP-16.2 sono stati visualizzati e quantificati utilizzando rispettivamente i nematodi transgenici CF1553, CL2166 e TJ375 (Figura 9). Rispetto al gruppo di controllo, i livelli di espressione proteica di SOD-3 e GST-4 nei nematodi in ciascun gruppo a concentrazione di massa di Cistanche deserticola erano significativamente aumentati (P<0.05, P<0.01, P<0.001). The HSP-16.2 protein expression level of nematodes in Cistanche deserticola 50 and 75 μg·mL–1 groups was significantly increased (P<0.01, P<0.001).