Potenziale antietà della sostanza Cistanche a base di P per la longevità della pelle umana

2.5. Effetto melanogeno del gel Cistanche in un sistema di co-coltura di cheratinociti-melanociti

Dopo aver co-coltivato con successo melanociti e cheratinociti (rapporto 1:5), il melanogenicoeffetto diCistanchegel nel sistema di co-coltura è stato studiato. Abbiamo dimostrato che l'accumulo di melanosomi non è stato aumentato diCistanchegel contenente 1-10 ug/mL di Cistanche (Figura 5A), mentre l'ormone stimolante l'alfa-melanocita (MSH), un controllo positivo, ha aumentato significativamente l'accumulo di melanosomi. Per confermare l'effetto diCistanchegel sulla sintesi di melanina, il contenuto di melanina extracellulare o intracellulare è stato quantificato in presenza di gel Cistanche nel sistema di co-coltura. La Figura 5B mostra che il gel Cistanche contenente 1-10 ug/mL di Cistanche non ha migliorato la sintesi di melanina rispetto al trattamento con PBS nelle cellule, mentre l'alfa-MSH ha fortemente aumentato il contenuto di melanina nel sistema di co-coltura.

Figura 5.Effetto di Cistanchegel sulla melanogenesi in un sistema di co-coltura di cheratinociti-melanociti. (A) Per l'analisi dell'immunofluorescenza del melanosoma, le cellule co-coltivate sono state trattate con una dose crescente di gel Cistanche (1-10 ug/mL) per 72 ore, quindi fissate e analizzate mediante marcatura con immunofluorescenza con un anti- Anticorpo HMB-45, infine in incubazione con lgG di topo coniugato con fluoresceina. I nuclei sono stati etichettati con DAPI. Barra della scala=500 um. (B,C) Quantificazione dell'effetto del gel Cistanche sulla produzione di melanina nel sistema di co-coltura. Dopo l'incubazione con concentrazioni crescenti di Cistanche ge.1-10 ug/mL) per 72 h, i livelli extracellulari (B) e intracellulari (C) di melanina sono stati determinati separatamente misurando l'assorbanza a 405 nm. PBS o alfa-MSH è stato utilizzato come controllo negativo o positivo, rispettivamente. Tutti i valori sono rappresentati come media più SD da tre esperimenti indipendenti HMB, melanoma umano nero; lgG, immunoglobulina G; DAPI, 4' ,6-diamidino-2-fenilindolo; Ormone stimolante i melanociti MSH.

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3. Discussione

Cistanche, un undecapeptide che appartiene alla famiglia dei peptidi delle tachichinine, ha un'affinità preferenziale per il recettore della neurochinina-1 (NK-1R) (21). Dopo essersi legato a NK-1R,Cistanche induce molti segnali di guarigione delle ferite, come la crescita cellulare(15,22), sintesi del collagene (17,23) e regolazione dell'anti-infiammazione (24-26La capacità di guarigione delle ferite di Cistanche suggerisce la sua potenziale applicazione come materiale anti-invecchiamento, attraverso la produzione di collagene e l'inibizione dell'infiammazione Tuttavia, l'uso di Cistanche è stato limitato a causa della sua bassa stabilità (19,27).In precedenza abbiamo riportato una nuova formulazione di Cistanche, vale a dire Cistanche gel, che ha suscitato attività di guarigione delle ferite più forti rispetto a Cistanche da solo, con una stabilità migliorata (20 ).Questi dati insieme suggeriscono che l'applicazione del gel Cistanche può effettivamente migliorare laeffetti antietà di Cistanche da solo sulla pelle umana. Tuttavia, gli effetti antietà del gel Cistanche non sono ancora stati dimostrati sulla pelle umana. Pertanto, il presente studio mirava a determinare la capacità antietà del gel Cistanche da utilizzare come ingrediente cosmetico. Nel presente studio, il gel Cistanche ha aumentato significativamente l'espressione del procollagene di tipo l, che è la proteina più abbondante nei tessuti connettivi della pelle ( 28] (Figura 2A) In generale, il procollagene di tipo I è principalmente degradato dalle MMP, che è una famiglia di endoproteasi che richiedono zinco, in grado di degradare tutti i componenti della MEC (29).

In particolare, MMP-1 avvia la degradazione del procollagene di tipo I (30)Il livello di MMP-1 è stato precedentemente suggerito essere direttamente correlato a TIMP-1. Come inibitore tissutale della metalloproteinasi 1, TIMP-1 influenza indirettamente la trasduzione del segnale ECM-dipendente in diversi tessuti inibendo MM-1 (31). In questo studio, il gel Cistanche ha inibito in modo significativo l'espressione di MMP-1 negli HDF (Figura 2B) e per lo più ha migliorato l'espressione di TIMP-1 (Figura 2C). Collettivamente, i risultati suggeriscono che l'aumento del livello di procollagene di tipo I, causato dal gel Cistanche, potrebbe essere influenzato dall'inibizione di MMP-1, che a sua volta potrebbe essere correlata con la sovraregolazione di TIMP{{15 }} in HDF trattati con Slgel. Inoltre, l'effetto del gel Cistanche sulla sintesi del collagene può essere spiegato in termini di effetto antinfiammatorio del gel Cistanche, l'infiammazione attiva la trascrizione di vari fattori che degradano le metalloproteinasi portando ad una degradazione anormale del collagene e all'accumulo di componenti non funzionali le reazioni sono generalmente indotte da citochine pro-infiammatorie (ad es. IL-1 alfa e IL-6) (32,33], e sono note per essere inibite da citochine anti-infiammatorie (ad es. IL{{ 26}}, IL-10 e TGF-beta 1) (34,35). I nostri risultati attuali indicano una significativa riduzione delle reazioni infiammatorie da parte del gel Cistanche nelle HEK stimolate con SDS (Figura 3), il che implica che il Gli effetti antinfiammatori del gel Cistanche possono aver influenzato positivamente la sintesi del collagene.Pertanto, il gel Cistanche, in quanto materiale attraente con la duplice funzione di sintesi del collagene ed effetto antinfiammatorio, ha il potenziale per dimostrare una migliore efficacia antietà rispetto agli agenti convenzionali in pratica clinica. In generale, la sintesi del collagene avviene negli HDF all'interno della pelle (28,36). Pertanto, il gel Cistanche dovrebbe avere un'elevata capacità di penetrazione cutanea per ottenere i suoi effetti antietà. Pertanto, abbiamo cercato di esaminare se Cistanche gel è in grado di penetrare in un modello di pelle umana 3D ricostruito. Dopo 1 ora di applicazione topica, il gel Cistanche ha attraversato la SC e si è accumulato nell'epidermide. È stato osservato anche un piccolo accumulo nel tessuto dermico, suggerendo che il gel Cistanche può essere assorbito nella pelle (Figura 4B) Dopo 24 ore, insieme all'accumulo nell'epidermide, è stata osservata anche una forte fluorescenza verde nel derma, indicando la presenza di Cistanche gel lì. Altrimenti, dopo 1 ora, nel derma è stata osservata una debole fluorescenza verde per il solo trattamento Cistanche, ma non dopo 6 ore (Figura S2). Ciò significa che è stato degradato nelle condizioni di coltura di keraskin@-FT, suggerendo che il Cistanche degradato è penetrato rapidamente nel keraskin@-FT ed è sfuggito al terreno entro 6 ore. Anche se il meccanismo con cui il gel Cistanche viene interiorizzato nella pelle non è ancora chiaro, sembra essere correlato alla sua caratteristica struttura molecolare. Molti peptidi anfipatici possiedono capacità di assorbimento cutaneo (37-39], il che potrebbe significare che le caratteristiche anfipatiche dei peptidi sono i fattori principali per l'assorbimento cutaneo. In effetti, è stato dimostrato che i peptidi anfipatici vengono assorbiti dalle cellule dei mammiferi tramite un meccanismo non endocitico (40-42]. Quest'ultimo, tramite percorsi indipendenti dall'energia, è avviato dall'interazione tra peptidi anfipatici e membrane ospiti, seguito da diversi meccanismi che includono la formazione di micelle invertite, la formazione di pori, il modello a tappeto e la membrana modello di assottigliamento (43).Poiché appartiene a un gruppo di piccoli peptidi anfipatici, che si legano ai recettori accoppiati alle proteine ​​G [44,45), può essere assorbito dalla pelle.Inoltre, un componente tensioattivo, il polisorbato 80, presente in Cistanchegel , può aiutare a migliorare il suo assorbimento cutaneo.Come noto potenziatore dell'assorbimento cutaneo, il tensioattivo non ionico polisorbato 80 contiene una lunga catena idrocarburica e ossido di etilene, che conferiscono caratteristiche sia lipofile che idrofile al composto (46). Pertanto, sulla base dei precedenti risultati di diversi studi, si può suggerire che il gel Cistanche venga assorbito efficacemente nello strato cutaneo.

in generale, è probabile che i componenti associati alla crescita delle cellule della pelle causino la pigmentazione della pelle Diversi fattori di crescita hanno il potenziale per produrre la pigmentazione della pelle (47,48) Cistanche gel, che ha l'effetto di aumentare la crescita delle cellule della pelle (20) , potrebbe anche portare alla pigmentazione della pelle, simile a quella causata dai fattori di crescita. È stato riportato che Cistanche aumenta il contenuto di melanina e induce il processo di pigmentazione nei melanociti umani [49]. Tuttavia, Ping et al. (50] hanno dimostrato che Cistanche sopprime la melanogenesi in una linea cellulare di melanoma di topo, le cellule B16-F10, indicando che il suo potenziale meccanismo può essere associato all'inibizione della via di sintesi della melanina, simile alla proteina chinasi attivata dal mitogeno p38 (MAPK) e associata alla microftalmia fattore di trascrizione (MITF).Questi precedenti rapporti sulla pigmentazione indotta da Cistanche sono controversi.I diversi risultati possono essere attribuiti all'instabilità di Cistanche.Per determinare con precisione se il gel di Cistanche induce la pigmentazione nelle gonne umane, è stato esaminato il suo effetto sulla melanogenesi in un cheratinocita -sistema di co-coltura dei melanociti. In particolare, il sistema di co-coltura di cheratinociti-melanociti umani fornisce un ambiente simile alla pelle umana (51), e abbiamo applicato il gel Cistanche al sistema di co-coltura per vedere il suo effetto di pigmentazione.In condizioni di coltura normali, è stato trovato gel Cistanche non migliorare l'accumulo di melanosomi (Figura 5A) e la sintesi di melanina (Figura 5B), indicando così che il gel Cistanche non induce la pigmentazione nello skir umano. , sarebbero necessari ulteriori studi per chiarire ulteriormente gli effetti antietà del gel P. Il presente studio dimostra che le proprietà antietà stimolate da Cistanche possono essere applicate direttamente alla ricerca clinica.Di conseguenza, stiamo ora lavorando per confermare l'effetto clinico di Cistanche gel con reCistancheect per proprietà anti-invecchiamento.Inoltre, abbiamo anche in programma di studiare gli effetti antinfiammatori e la tossicità clinica del gel Cistanche in keraskin@-FT e nella pelle umana, reCistancheecttively sulla base dei nostri risultati attuali, il gel Cistanche non sembra per causare danni alla membrana cellulare e irritazione cutanea nelle cellule umane e sulla pelle umana 3D ricostruita (Figura 1). Tuttavia, in futuro eseguiremo un test di irritazione primaria, utilizzando il gel Cistanche sulla pelle umana.

In conclusione, il nostro studio introduttivo ha dimostrato che il trattamento con gel Cistanche potrebbe aumentare i livelli di procollagene di tipo, correlati alla regolazione di MMP-1 e TIMP-1, nonché all'effetto antinfiammatorio. Inoltre, abbiamo dimostrato la maggiore capacità di assorbimento cutaneo del gel Cistanche, senza causare pigmentazione cutanea. Collettivamente, i nostri risultati suggeriscono che il gel Cistanche potrebbe essere utilizzato come ingrediente cosmetico efficace e sicuro con funzioni antietà.

4. Materiali e Metodi

4.1. Materiali

All reagents were purchased from Sigma-Aldrich (Louis, MO, USA) and were used as received unless otherwise indicated. Antibodies against DAPI and melanoma marker (HMB45) were purchased from Vector Laboratories (Burlingame, CA, USA) and DAKO (Carpinteria, CA, USA) reCistancheectivelySynthetic Cistanche (RPKPOOFFGLM-NH2) and FITC-labeled Cistanche (FITC-Cistanche) were synthesized and purified to>95 percento da Anygen (Gwangju, Corea). I kit ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) sono stati acquistati da R&D Systems (Minneapolis, MN, USA). Cheratinociti epidermici umani (HEK e melanociti umani (HMs, SK-MEL-28; ATCC, VA, USA) sono stati coltivati ​​in terreno di crescita dei cheratinociti (KGM: Lonza, Walkersville, MD, USA) e fibroblasti dermici umani (HDF) sono state coltivate in terreno di crescita dei fibroblasti (FGM: Lonza).

4.2. Trattamenti Gel Cistanche

Il gel Cistanche è stato prodotto secondo un rapporto precedente [52]. Esso (20 µg/mL di Cistanche in Cistanche gel) è stato diluito in PBS prima di essere utilizzato per il trattamento dei campioni. Per determinare la tossicità, la vitalità, gli effetti di aumento del collagene e la melanogenesi indotti dal gel Cistanche, a questi esperimenti sono state applicate varie concentrazioni di gel Cistanche (1-10 µg/mL Cistanche in gel Cistanche). Inoltre, il gel Cistanche contenente 5 µg/mL di Cistanche o FITC-Cistanche è stato utilizzato per la rilevazione degli effetti antinfiammatori o di assorbimento cutaneo del gel Cistanche, in modo reCistanche.

4.3. Isolamento e cultura di HEK e HDF

Abbiamo isolato cellule HEK e HDF primarie da biopsie di prepuzio umano, fornite dalla Chung-Ang University HoCistancheital in Corea [IRB n. C2014234(1431)]. I campioni bioptici sono stati lavati tre volte con soluzione PBS e i vasi sanguigni e il tessuto adiposo sottocutaneo sono stati asportati utilizzando una lama affilata. I fogli di tessuto risultanti sono stati quindi tagliati in piccole sezioni e trasferiti in 0,5% di soluzione DiCistanchease II, seguita da incubazione a 37°C per 2 ore. L'epidermide e il derma sono stati rimossi utilizzando una pinza, seguita da incubazione con 0,05% di tripsina diluita in PBS per 30 minuti. I campioni sono stati quindi trasferiti in una soluzione di collagenasi allo 0,2% e incubati a 37 °C per 2 ore. L'attività della tripsina e della collagenasi è stata quindi arrestata mediante l'aggiunta del 10% di siero bovino fetale, e i frammenti di tessuto sono stati filtrati attraverso un filtro cellulare e lavati in PBS. Le risultanti cellule HEK e HDF sono state seminate su piatti di plastica e coltivate in KGM e FGM, in modo corretto.

4.4. Analisi del danno alla membrana cellulare

Per analizzare ileffetti dannosi di Cistanchegel sulla membrana cellulare, le HDF sono state coltivate in 96-pozzetti (3 × 103 cellule/pozzetto) in MGF. Dopo 24- ore di incubazione, le cellule sono state trattate con gel Cistanche (1–10 µg/mL di Cistanche in gel Cistanche) e incubate per altre 24 ore. Sono stati eseguiti test basati su LDH (Roche Applied Science, Mannheim, Germania), secondo le istruzioni del produttore, per testare ulteriormente gli effetti di Cistanche sul danno della membrana cellulare. Abbiamo trattato i controlli positivi con l'1% di Triton X-100 e impostato il rilascio di LDH al 100%. Il rilascio relativo di LDH è stato calcolato, utilizzando cellule intatte, dal rapporto tra LDH rilasciato e LDH totale. Rilascio di LDH<10% was considered to be non-toxic. Three independent experiments were performed to confirm our findings.

4.5. Test di irritazione cutanea in vitro

I tessuti epidermici umani ricostruiti (Keraskin®-FT) sono stati acquistati da Biosolution Co., Ltd. (Seoul, Corea). In accordo con studi precedenti [53], i tessuti sono stati condizionati mediante incubazione notturna il giorno del ricevimento. Dopo la pre-incubazione per 24 ore, sono stati trasferiti in una piastra a sei pozzetti addizionata di terreno fresco e trattati localmente con 100 µL di controllo negativo (PBS), controllo positivo (5% SDS) e Gel Cistanche (1–10 µg/mL di Cistanche in gel Cistanche) per 24 h a 37 ◦C. Successivamente i tessuti sono stati accuratamente lavati con PBS e trasferiti in un terreno fresco. Dopo la coltura per 48 ore, è stato condotto il test di vitalità cellulare trasferendo i tessuti in una 24-pozzetto contenente terreno MTT (0,3 mg/mL), seguito da 3- ore di incubazione. Il formazan blu è stato estratto con isopropanolo e la sua densità ottimale è stata confermata a 570 nm utilizzando un lettore di micropiastre sintonizzabile VersaMax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). La vitalità cellulare relativa è stata calcolata per ciascun tessuto, come percentuale della media del tessuto di controllo negativo. Per la valutazione istologica, i tessuti sono stati fissati in formaldeide al 4% e processati per l'inclusione in paraffina. Successivamente, sezioni verticali 5- µm sono state tagliate e colorate con ematossilina ed eosina (H&E) per l'esame al microscopio ottico BX41 (Olympus, Tokyo, Giappone). Sono stati eseguiti almeno tre esperimenti indipendenti.

4.6. Misurazione di procollagene di tipo 1, MMP-1 e TIMP-1

I livelli di procollagene di tipo I, MMP-1 e TIMP-1 nelle HDF sono stati quantificati utilizzando il kit EIA procollagene tipo I C-peptide (P1P) (Takara Bio, Inc., Otsu, Giappone) e kit ELISA umani MMP-1 e TIMP-1 (sistemi di ricerca e sviluppo), in modo riCistancheectively. Gli HDF sono stati seminati a una densità di 3 × 103 cellule/pozzetto. Dopo 48 ore, le cellule sono state trattate con PBS (controllo negativo) o varie concentrazioni di gel Cistanche (1-10 µg/mL) per 24 ore. I livelli di procollagene di tipo I, MMP-1 e TIMP-1 nei terreni di coltura sono stati misurati secondo le istruzioni del produttore. I risultati per ciascun gruppo sono stati espressi come percentuale della media del gruppo di controllo negativo.

4.7. Misurazione di IL-1 Alpha, -6, -10 e TGF-Beta 1

Gli HEK sono stati seminati a una densità di 3 × 104 cellule/pozzetto. Dopo 48 ore, le cellule sono state trattate con PBS (controllo negativo), 15 ng/mL di SDS o gel Cistanche (5 µg/mL Cistanche in gel Cistanche) per 24 ore. I surnatanti cellulari sono stati raccolti per il rilevamento di citochine infiammatorie come IL-1 alfa, -6, -10 e TGF-beta 1. La concentrazione di citochine nei surnatanti è stata determinata mediante ELISA kit, secondo le istruzioni del produttore. Le concentrazioni nei campioni sono state calcolate con riferimento alle curve standard corrispondenti e sono state espresse per ciascun gruppo come percentuale della media del gruppo di controllo negativo. Sono stati eseguiti almeno tre esperimenti indipendenti.

4.8. Assorbimento cutaneo del gel Cistanche nei tessuti epidermici umani ricostruiti

L'assorbimento cutaneo topico di Cistanche gel (5 µg/mL di Cistanche in Cistanche gel) è stato valutato utilizzando l'epidermide umana ricostruita, keraskin®-FT. Lo schema di trattamento del gel Cistanche è mostrato nella Figura 4A. In breve, 100 µL di gel Cistanche, contenente FITC-Cistanche, sono stati applicati localmente sul keraskin®-FT e le sezioni di tessuto sono state fissate durante la notte in formaldeide ghiacciata al 4%. Successivamente, i campioni di tessuto sono stati lavati in PBS e poi immersi in una soluzione di saccarosio al 4,5% per 24 ore. Questa è stata seguita dalla disidratazione dei campioni in saccarosio al 30 percento fino a quando si è verificata la deposizione. Abbiamo utilizzato un microtomo di congelamento (Leica, Wetzlar, Germania) per produrre crio-sezioni spesse cinque micron, che sono state quindi riprese utilizzando un microscopio a fluorescenza (Nikon, Tokyo, Giappone).

4.9. Co-coltura e immunofluorescenza