Effetti antiallergici e antinfiammatori della neferina sulle cellule RBL-2H3

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Astratto:I mastociti svolgono un ruolo molto importante nelle allergie e nelle infiammazioni cutanee, comprese la dermatite atopica e la psoriasi. In passato, è stato riscontrato che il riferimento ha effetti antinfiammatori e antietà sulla pelle, ma il suo effetto sui mastociti non è stato ancora studiato in dettaglio. In questo studio, abbiamo utilizzato mastociti (cellule RBL-2H3) e modelli murini per studiare gli effetti antiallergici e infiammatori di riferimento. Innanzitutto, abbiamo scoperto che il riferimento inibisce la degranulazione dei mastociti e l'espressione delle citochine. Inoltre, abbiamo osservato che quando i mastociti sono stati stimolati da A23187/phorbol 12-miristato-13- acetato (PMA), l'aumento del calcio intracellulare è stato inibito per riferimento. Anche la fosforilazione della via MAPK/NF-KB viene ridotta dal pretrattamento di riferimento. I risultati degli studi in vivo mostrano che il riferimento può migliorare l'aspetto della dermatite e dell'infiltrazione dei mastociti causata dal dinitroclorobenzene (DNCB). Inoltre, vengono ripristinate anche le espressioni delle proteine ​​di barriera nella pelle.cistanciaInfine, è stato riscontrato che il riferimento può ridurre il comportamento al graffio causato dalla mescola 48/80. Presi insieme, i nostri risultati indicano che il riferimento è un ottimo prodotto naturale antiallergico e antinfiammatorio. Il suo effetto sui mastociti contribuisce al suo meccanismo farmacologico.

Parole chiave:riferimento; prodotto naturale; mastociti; dermatite; prurito

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1. Introduzione

Molti studi hanno confermato che le malattie allergiche sono il risultato non solo dell'attivazione immunitaria innata, ma anche dell'attivazione adattativa. Tra questi, i mastociti svolgono un ruolo molto importante in una varietà di malattie allergiche come rinite allergica, asma e dermatite allergica. I mastociti esprimono i recettori IgE (FceRI) sulle loro membrane cellulari e i recettori FceRI hanno un'elevata affinità per gli anticorpi IgE [1,2]. Quando l'IgE antigene-specifica si lega a FceRI, si verifica un'interazione e si verifica una reazione allergica. L'aggregazione di FceRI può attivare le tirosin-chinasi del recettore, avviare reazioni a valle e promuovere la fosforilazione di varie proteine ​​chiave (come la protein chinasi attivata dal mitogeno; MAPK), portando infine all'afflusso di ioni calcio (Ca2 plus), che è un evento chiave nella degranulazione dei mastociti [3].cistanche AustraliaI mastociti attivati ​​degranulano e rilasciano mediatori chimici. Questi mediatori chimici utilizzati nelle reazioni allergiche possono causare infiammazione [4], quindi il trattamento dei sintomi allergici coinvolge gli inibitori della degranulazione dei mastociti. Pertanto, l'inibizione della degranulazione dei mastociti IgE-mediata viene spesso utilizzata per identificare nuovi composti per prevenire e curare le malattie allergiche. È stato stabilito che gli anticorpi e gli antigeni anti-dinitrofenil (DNP)IgE possono indurre reazioni di ipersensibilità cutanea passiva (PCA) come tipico modello in vivo di ipersensibilità immediata e come farmaco di ricerca per il potenziale di allergie antigeniche [5,6 ]. Inoltre, la degranulazione dei mastociti può essere causata anche da stimolanti non immunitari, come i composti 48/80 e A23187. Lo ionoforo di calcio A23187 è noto da tempo per stimolare la secrezione dei mastociti con il rilascio di mediatori preformati, come l'istamina dai loro granuli, che servono come esempio [4]Il composto 48/80 è un polimero misto di p-metossi-N-metilfenetilamina reticolato dalla formaldeide, che è ampiamente utilizzata per la stimolazione indipendente dei mastociti [7,8] Pertanto, quantità appropriate di composto 48/80 e A23187 sono state comunemente utilizzate come reagenti per studiare il meccanismo delle reazioni allergiche. Secondo le valutazioni statistiche, circa il 15-20 percento della popolazione soffre di dermatite atopica. Che si tratti di bambini o adulti che soffrono di questa malattia, senza un trattamento adeguato, la dermatite atopica può causare disagio psicologico ai pazienti e gravare sui loro costi familiari e socio-sanitari [9]. Sfortunatamente, non esiste un metodo di trattamento adatto per curare la dermatite allergica. Le attuali opzioni di trattamento evitano ancora gli allergeni che causano malattie e l'uso continuo di steroidi è il gold standard del trattamento. Gli inevitabili allergeni e gli effetti collaterali dei farmaci hanno spinto lo sviluppo urgente di nuovi farmaci terapeutici. I composti naturali isolati da erbe e piante medicinali sono potenziali fonti di agenti terapeutici per prevenire e curare malattie infiammatorie e migliorare la qualità della vita dei pazienti con disturbi allergici.

Cistanche può antietà

Il riferimento viene dal nucleo di loto (l'embrione del seme) della pianta Nelumbo nucifera ed è un importante alcaloide bisbenzilisochinolinico. Ci sono prove che il riferimento abbia un'ampia gamma di proprietà farmacologiche, come effetti antitumorali, antiossidanti, antinfiammatori e neuroprotettivi, in molte malattie [10-15].benefici di cistanceKhan et al. hanno scoperto che il riferimento produce effetti anti-fotoinvecchiamento inibendo l'aumento mediato dai raggi UV dei livelli di ROS e malondialdeide (MDA) nei cheratinociti e nei fibroblasti umani[16,17]Recentemente, abbiamo scoperto che il riferimento ha un potenziale come medicina alternativa per il trattamento di dermatite o altre malattie infiammatorie cutanee[18]. Tuttavia, rimane ancora incerto se il riferimento svolga un effetto anti-allergia cutanea nei mastociti. In questo studio, abbiamo mirato a studiare gli effetti del riferimento sulle malattie allergiche mediate dai mastociti, utilizzando linee di mastociti umani (cellule RBL-2H3) e un composto 48/80-e anafilassi indotta da DNCB modello di topi.

La referencia proviene dal núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existe evidencia de que la referencia tiene una vasta gamma di proprietà farmacologiche, come effetti antitumorali, antiossidanti, antinfiammatori e neuroprotettori, en muchas enfermedades [10-15]. Benefici della città Khan et al. encontró que la referencia produce effetti anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS e malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] Recientemente, descubrimos que la referencia tiene potencial come medicina alternativa per il trattamento alternativo de atópica dermatite u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la allergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando linee di mastocitos humanos (células RBL-2H3) e un modello di ratones con anafilaxia inducida por compuesto 48/80 e DNCB .

2. Risultati

2.1. Test di citotossicità della neferina su cellule d'albero di ratto (RBL-2H3)

Poiché le cellule H3 della leucemia basofila di ratto (RBL){0}}, un analogo dei mastociti a rilascio di istamina, sono cellule adatte per esaminare gli effetti dell'infiammazione mediata dai mastociti [19], abbiamo utilizzato queste cellule per studiare l'antiallergico effetti di riferimento. In primo luogo, abbiamo testato se il riferimento può produrre citotossicità nei mastociti. Quando le cellule vengono pretrattate con riferimento da 1 a 30 μM per 24 h, la vitalità cellulare delle cellule non sarà influenzata dal trattamento di riferimento (Figura 1).

2.2. La neferina riduce l'effetto di degranulazione di RBL-2H3 stimolato da diversi attivatori

RBL-2Le cellule H3 sono comunemente utilizzate per studi in vitro sulla degranulazione [20-22]Stimolazione delle cellule RBL-2H3 con IgE anti-dinitrofenolo (DNP) e albumina sierica umana coniugata con DNP (HSA) innesca la degranulazione. Inoltre, è noto che i mastociti si degranulano in risposta a composti sintetici, come il composto 48/80 e lo ionoforo di calcio A23187, e questi composti sono stati usati come reagenti convenienti per studi diretti sui meccanismi delle risposte allergiche in vitro [23, 24]. I risultati hanno mostrato che il citoplasma di RBL-2H3 non attivato dall'attivatore conteneva granuli secretori limitati.colesterolo delle cistanzeIl trattamento di riferimento （10μM） da solo non ha influenzato l'attività di RBL-2H3 (Figura 2A, B). Tuttavia, l'aggiunta di diversi attivatori, tra cui il composto 48/80, A23187 e l'anti-DNP/IgE più DNP/HSA, ha riempito chiaramente il citoplasma di granuli secretori. Al microscopio elettronico, si può vedere che c'è un gran numero di granuli secretori nel citoplasma e alcuni granuli secretori si fondono persino con la membrana cellulare, portando alla degranulazione (Figura 2C-E). Dopo il pretrattamento con riferimento 10 uM, i granuli secretori nel citoplasma sono stati significativamente ridotti (Figura 2F-H). Questi risultati indicano che il riferimento può inibire efficacemente l'attivazione e la degranulazione di RBL-2H3 stimolato dall'attivatore.

2.3.La neferina inibisce PMA/A23187-aumento intracellulare di calcio indotto in RBL-2H3

Gli ioni calcio svolgono il ruolo di messaggero secondario nel processo di attivazione cellulare. A23187 è il modo più efficace per aumentare la penetrazione degli ioni calcio attraverso le membrane cellulari e stimolare l'attivazione dei mastociti. Il forbolo miristato acetato (PMA) può attivare la protein chinasi Cand e aumentare gli ioni calcio intracellulari per potenziare l'effetto di A23187. L'aumento degli ioni calcio nei mastociti è stato anche considerato un fattore importante nell'indurre l'attivazione dei mastociti in modo che influisca sulla degranulazione dei mastociti e rilasci più citochine e chemochine infiammatorie.cistanche deserticola effetti collaterali,Pertanto, questo studio ha cercato di esplorare se il riferimento può inibire la concentrazione di ioni calcio in RBL-2H3 quando inibisce l'infiammazione. Il gruppo sperimentale è stato suddiviso in con o senza pretrattamento di riferimento per 20 minuti e sono stati aggiunti 1 mM di CaClz e PMA/A23187 per stimolare e attivare RBL-2H3. I risultati sperimentali hanno mostrato che il trattamento di RBL-2H3 con diverse concentrazioni di riferimento da solo non ha influenzato l'aumento della concentrazione intracellulare di ioni calcio. Nel gruppo di afflusso di Ca2t indotto da PMA/A23187-, la concentrazione intracellulare di ioni calcio è aumentata in modo significativo. Le cellule RBL-2H3 sono state pretrattate per 20 minuti con riferimento (3 μM e 10 μM) e la concentrazione di ioni calcio è stata significativamente ridotta (Figura 3).

2.4. La neferina ha ridotto l'espressione dell'mRNA delle citochine pro-infiammatorie in PMA/A23187 stimolate da RBL-2H3

La risposta immunitaria della pelle aumenterà il numero di mastociti nel corpo e i mastociti produrranno quindi citochine pro-infiammatorie e accelereranno il progresso della malattia. Le citochine pro-infiammatorie, in particolare TNF-a, IL-6, IL-1 e IL{5}}, non solo inducono infiammazione ma causano anche infiltrazione leucocitaria, formazione di granulomi e fibrosi tissutale. PMA/A23187 agisce sui mastociti e li induce a produrre IL-16, IL-6, TSLP e TNF-, causando un'infiammazione correlata all'allergia. Pertanto, abbiamo pretrattato RBL-2H3 con riferimento per 20 minuti e stimolato con PMA/A23187 per 6 ore per rilevare se il riferimento può sottoregolare l'espressione dell'mRNA di IL-1, IL{{ 19}}, TSLP e TNF-a. I risultati hanno mostrato che nel gruppo trattato con il solo riferimento, l'espressione dell'mRNA della citochina non è stata influenzata e l'espressione dell'mRNA nel gruppo che ha indotto l'infiammazione da PMA/A23187 è aumentata in modo significativo. Nel gruppo trattato con riferimento, è stato osservato che i livelli di espressione dell'mRNA di IL-1, IL-6, TSLP e TNF-a erano significativamente soppressi (Figura 4).

2.5.La neferina inibisce PMA/A23187-fosforilazione indotta della via MAPK in RBL-2H3

Studi precedenti hanno evidenziato che i mastociti devono rilasciare ioni calcio intracellulari per attivare MAPK. Inoltre, la via di segnalazione MAPK regola l'espressione di monociti, linfociti T, linfociti B, citochine e chemochine e induce l'autoimmunità. Questo meccanismo è simile al percorso di attivazione di PMA/A23187. In questo studio, abbiamo esplorato se il riferimento può partecipare alla regolazione dei percorsi MAPK. Abbiamo trattato diverse concentrazioni di riferimento (1,3 e 10 uM) con RBL-2H3 per 20 minuti e quindi stimolate con PMA/A23187 per 30 minuti per indurre l'infiammazione. I risultati hanno mostrato che quando RBL-2H3 è stato trattato con diverse concentrazioni di riferimento da solo, l'attivazione delle proteine ​​p38, JNK ed ERK non è stata influenzata. Nel gruppo trattato solo con PMA/A23187, abbiamo scoperto che le proteine ​​p38, JNK ed ERK sono state attivate e hanno una fosforilazione significativa. Nel gruppo pretrattato con riferimento, è stato osservato che per concentrazioni di riferimento più elevate, la fosforilazione delle proteine ​​p38, JNK ed ERK era significativamente ridotta (Figura 5A-C).

2.6.La neferina inibisce PMA/A23187-fosforilazione indotta della via NF-B in RBL-2H3

L'espressione delle citochine pro-infiammatorie dipende dall'attivazione del fattore di trascrizione NF-kB nei mastociti. Quando la proteina IKB è stata fosforilata e degradata, NF-kB è stato rilasciato e migrato nel nucleo, legandosi con i suoi corrispondenti elementi sensibili al DNA e promuovendo la trascrizione dei mediatori proinfiammatori. Sono state prodotte molte citochine e chemochine, che regolano la risposta immunitaria, la differenziazione e l'infiammazione. Pertanto, abbiamo esaminato se il pretrattamento con riferimento influisca sulla fosforilazione proteica indotta da PMA/A23187. Abbiamo trattato diverse concentrazioni di riferimento (1,3 e 10 μM) con RBL-2H3. Dopo 20 min, PMA/A23187 ha stimolato RBL-2H3 per 1 ora o 2 ore per indurre l'infiammazione. I risultati hanno mostrato che il trattamento di RBL-2H3 con diverse concentrazioni di riferimento da solo non ha influenzato la fosforilazione di IKBa e NF-KB. Quando è stato utilizzato PMA/A23187 per la stimolazione, è stato osservato un aumento significativo della fosforilazione di IkBo e NF-KB. Nel gruppo pretrattato con riferimento, è stato riscontrato che la fosforilazione di IkBa (Figura 6A) e NF-KB (Figura 6B) era significativamente ridotta.

2.7. Effetto della neferina sulla dermatite atopica indotta da 2,4-dinitroclorobenzene (DNCB)

Modello animale per la ricerca sulle malattie, il DNCB è un irritante rappresentativo che causa la dermatite atopica[25]. Il nostro esperimento utilizza l'1% di dinitroclorobenzene (DNCB) disciolto in alcol al 75% per indurre il primo stadio della risposta di sensibilizzazione. Il riferimento (3 mg/kg e 10 mg/kg) e il desametasone (Dexa,{{10}},2 mg/kg) disciolti in DMSO sono stati somministrati per via intraperitoneale il quinto giorno per dieci giorni . L'8°, 1° e 14° giorno, è stato applicato lo 0,5% di DNCB come secondo stadio di induzione dell'infiammazione. I topi sono stati divisi in quattro gruppi - gruppo di controllo, gruppo DNCB, gruppo trattato di riferimento e gruppo trattato con desametasone - e quindi, dopo il confronto tra i gruppi, sono state notate le differenze. Abbiamo osservato che DNCB ha indotto una reazione di infiammazione cutanea atopica sulla pelle dei topi. Dopo l'applicazione del DNCB, è stato riscontrato che la pelle dei topi aumentava il rossore e la desquamazione. Questi sono tutti dovuti alla proliferazione anormale dei cheratinociti, all'infiltrazione e all'aggregazione delle cellule immunitarie. Il gruppo trattato con 3 mg/kg di riferimento e 0,2 mg/kg di desametasone per quattro giorni aveva attenuato il rossore. Abbiamo continuato a osservare le condizioni della pelle dorsale dei topi fino al giorno 15. Rispetto al gruppo di controllo, il gruppo DNCB presentava condizioni cutanee gravemente arrossate e gonfie, e c'erano peli e ferite che sembravano essere causate da prurito e dolore . Possiamo trovare una tendenza di grado decrescente dopo trattamenti di riferimento e desametasone (Figura 7A). La colorazione blu di toluidina è stata utilizzata per osservare il numero di mastociti aggregati. I mastociti apparivano viola quando osservati al microscopio. Si può quantitativamente dimostrare che molti mastociti si sono infiltrati e accumulati nel derma nel gruppo sperimentale DNCB, significativamente aumentati rispetto al gruppo di controllo. Nel gruppo trattato con riferimento e desametasone, l'infiltrazione, l'aggregazione e il numero di mastociti sono stati ridotti (Figura 7B, C).

2.8. La neferina migliora l'espressione dell'mRNA delle molecole correlate alla barriera dopo il trattamento del DNCB

L'infiammazione cutanea causata dall'AD può causare una funzione anormale della barriera cutanea. Se la barriera cutanea è difettosa, è più facile che antigeni o sostanze irritanti penetrino nell'epidermide cutanea ed entrino nel corpo per indurre reazioni immunitarie. Allo stesso tempo, sarà soppressa la produzione di proteine ​​di differenziazione, tra cui filaggrina, loricrina e involucrina. Pertanto, il ripristino della barriera cutanea danneggiata è molto importante per prevenire e curare l'AD [26]. Nel nostro studio, abbiamo utilizzato i riferimenti per intervenire nel modello animale della dermatite atopica indotta da DNCB. Dopo aver sacrificato i topi, il tessuto cutaneo dorsale è stato messo a terra per l'analisi RI-qPCR per valutare se il riferimento può migliorare la riduzione dell'espressione dell'mRNA in filaggrina, loricrina e involucrina dopo il trattamento di DNCB. I risultati hanno mostrato che il gruppo sperimentale DNCB aveva significativamente ridotto l'espressione di mRNA di filaggrina, loricrina e involucrina rispetto al gruppo di controllo. L'espressione dell'mRNA di filaggrina, loricrina e involucrina è stata significativamente aumentata nel gruppo trattato con riferimento e desametasone rispetto al gruppo DNCB (Figura 8).

Abbiamo inoltre dimostrato che il riferimento ha un effetto graffiante antiallergico. Abbiamo usato un agente di degranulazione dei mastociti, composto 48/80, per indurre un comportamento graffiante nei topi BALB/c. Come mostrato nella Figura 9, abbiamo scoperto che il trattamento di riferimento ha inibito il comportamento di grattamento causato dal composto 48/80（50 ug/sito）. La somministrazione ripetuta di dosi di riferimento sempre più basse (3 e 10 mg/kg) per 5 giorni consecutivi ha ridotto significativamente il numero di graffi causati dal composto 48/80.