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Costituenti antiossidanti e anti-fatica del gombo

Mar 21, 2022

Fangbo Xia, Yu Zhong, Mengqiu Li, Qi Chang, Yonghong Liao, Xinmin Liu * e Ruile Pan *


Institute of Medicinal Plant Development, Peking Union Medical College, Chinese Academy of MedicalScienze, n. 151, North Road Malianwa, Distretto di Haidian, Pechino 100193


Per maggiori informazioni:ali.ma@wecistanche.com



Astratto


Il gombo (Abelmoschus esculentus (L.) Moench), ortaggio sano, è ampiamente diffuso nelle aree tropicali e subtropicali. Studi precedenti hanno dimostrato che i baccelli di gombo possiedonoattività antifatica,e lo scopo di questa ricerca è di chiarire ilantistanchezzacostituenti. Per ottenere ciò, abbiamo diviso i baccelli di gombo (OPD) in semi (OSD) e bucce (OSK) e abbiamo confrontato il contenuto di polisaccaridi totali, polifenoli totali, flavonoidi totali, isoquercitrina e quercetina-3-O-gentiobiosio e l'antiossidante attività in vitro eattività antifaticain vivo tra OSD e OSK. Il contenuto di polifenoli totali e polisaccaridi totali era rispettivamente del 29,5% e del 14,8% in OSD e dell'1,25% e 43,1% in OSK. I flavonoidi totali, l'isoquercitrina e la quercetina-3-O-gentiobiosio (5,35 percento, 2,067 percento e 2,741 percento, rispettivamente) sono stati rilevati solo nell'OSD. Saggi antiossidanti, tra cui il 1-difenil{17}}picrylidrazyl (DPPH), il potere antiossidante riduttore ferrico (FRAP) e il test del potere riducente e il test di nuoto con carico di peso hanno mostrato che l'OSD possedeva un significativo antiossidante eeffetti anti-fatica. Inoltre, la determinazione biochimica ha rivelato che ilattività antifaticadi OSD è causato dalla riduzione dei livelli di acido lattico nel sangue (BLA) e azoto ureico (BUN), migliorando la conservazione del glicogeno epatico e promuovendo la capacità antiossidante abbassando il livello di malondialdeide (MDA) e aumentando la superossido dismutasi (SOD) e la glutatione perossidasi (GSH- Px) livelli. Questi risultati hanno dimostrato che i semi di gombo erano iantistanchezzaparte dei baccelli di gombo e polifenoli e flavonoidi erano costituenti attivi.


Parole chiave: gombo; antistanchezza; antiossidante; polifenoli



Cistanche

1. Introduzione


La fatica è un fenomeno fisiologico complesso, definito come difficoltà nell'iniziare o sostenere attività di volontariato [1]. Oltre ad aumentare con l'età e presentarsi nei pazienti con cancro, depressione, infezione da HIV, sclerosi multipla e morbo di Parkinson, la stanchezza sta diventando un sintomo sempre più comune negli esseri umani normali con il ritmo crescente della vita moderna [2-4]. Ampi sondaggi di comunità hanno mostrato che più della metà della popolazione adulta lamenta stanchezza [5,6]. L'affaticamento cronico o accumulato a lungo termine non solo abbassa la qualità della vita, ma porta anche alla sindrome da stanchezza cronica e ad altre malattie organiche e porta persino al karoshi (la morte anormale per malattie cardiovascolari acute causate dal superlavoro [7]). Esistono diverse teorie sulle cause dell'affaticamento, come la teoria dell'esaurimento, che afferma che l'affaticamento è causato dalla mancanza di ATP disponibile per l'accoppiamento actina-miosina, dal pompaggio di Na`/K` e dall'assorbimento di Ca2` da parte del reticolo sarcoplasmatico [8–11 ]; teoria del disturbo dell'omeostasi, che indica che la fatica è causata dall'accumulo di vari sottoprodotti metabolici [10,12]; e la teoria della catastrofe che indica che la fatica può svilupparsi a causa di un cedimento in uno o più siti lungo il percorso di produzione della forza [13]. Tra questi, si ritiene che lo stress ossidativo svolga un ruolo importante nell'eziologia della fatica [10,13-16]. È stato dimostrato che gli antiossidanti di alcune erbe possiedono notevoli effetti anti-fatica, il che indica che il trattamento antiossidante potrebbe essere un valido approccio terapeutico anti-fatica [17-20]. Pertanto, i consumatori cercano componenti antiossidanti più naturali nella loro dieta per ridurre il danno ossidativo e combattere la fatica. Il gombo (Abelmoschus esculentus (L.) Moench, Famiglia: Malvaceae), noto anche come savoiardo, bhindi e gumbo, è una pianta annuale originaria dell'Africa ed è stata coltivata in diversi paesi del mondo, principalmente nelle zone tropicali, subtropicali, e regioni temperate calde.


I baccelli di gombo sono stati a lungo usati come ortaggio e fonte di medicinali dietetici. Nella medicina tradizionale asiatica e africana, i baccelli di gombo sono usati come alimento mucillaginoso per combattere la gastrite [21]. Studi farmacologici hanno rivelato che il gombo possiede attività antiossidanti, neuroprotettive, antidiabetiche, antiiperlipidemiche e anti-fatica [22-26]. Sebbene l'attività antifatica dei baccelli di gombo sia stata dimostrata in precedenza [26], si sa poco delle sue attività e dei suoi costituenti antifatica. La letteratura precedente ha riportato che i baccelli di gombo contengono alti contenuti di polisaccaridi, polifenoli e flavonoidi [27-34]. È stato anche dimostrato che polifenoli e flavonoidi possiedono forti effetti antiossidanti e anti-fatica in studi precedenti [15,18,20,35,36]. Inoltre, il nostro esperimento qualitativo preliminare, in cui abbiamo utilizzato una soluzione di cloruro ferrico come reagente per lo sviluppo del colore, ha rivelato che l'estratto di semi di gombo mostrava una forte reazione fenolica; tuttavia, il suo estratto di buccia ha mostrato a malapena tale reazione (materiali supplementari), il che ha dimostrato che i semi di gombo contenevano contenuti più elevati di polifenoli e flavonoidi rispetto alle bucce di gombo. Pertanto, si potrebbe ipotizzare che i semi di gombo possano essere la parte anti-fatica dei baccelli di gombo e che polifenoli e flavonoidi possano essere i costituenti attivi. Lo scopo dello studio era di chiarire i costituenti anti-fatica dei baccelli di gombo. Per ottenere ciò, abbiamo diviso i baccelli di gombo fresco in semi e bucce e abbiamo confrontato il contenuto chimico di polisaccaridi totali, polifenoli totali, flavonoidi totali, isoquercitrina e quercetina-3-O-gentiobiosio e attività antiossidanti in vitro e anti- attività di fatica in vivo tra semi e bucce di gombo. Tutti questi risultati hanno rivelato che i semi di gombo erano la parte anti-fatica dei baccelli di gombo e i polifenoli e i flavonoidi erano costituenti attivi. Sono stati inoltre studiati i potenziali meccanismi delle attività anti-fatica nel gombo.


2. Sezione Sperimentale


2.1. Materiale vegetale ed estrazione


I baccelli di gombo freschi sono stati acquistati da un mercato (Sanya, provincia di Hainan, Cina) nel luglio 2013. La pianta è stata autenticata dal professor Bengang Zhang, dall'Istituto di piante medicinali, dall'Accademia cinese di scienze mediche e dal Peking Union Medical College, Pechino, Cina, dove gli esemplari di voucher (n. 20130705) sono stati depositati nell'Erbario dell'istituto. Sono state preparate due porzioni di baccelli di gombo fresco da 2,5 Kg. Una porzione è stata liofilizzata direttamente per ottenere baccelli di gombo essiccati (251,3 g). L'altra porzione è stata suddivisa in semi di gombo e bucce di gombo, liofilizzati per ottenere, rispettivamente, semi di gombo essiccati (50,1 g) e bucce di gombo essiccate (200,5 g). I baccelli, i semi e le bucce di gombo sono stati ben macinati ed estratti separatamente con 1500 ml di acqua bollente ciascuno per 1 ora (3 volte). Ciascun liquido filtrato è stato combinato e concentrato sotto vuoto, per produrre residui di baccelli di gombo (OPD, 105,4 g), semi di gombo (OSD, 20,5 g) e bucce di gombo (OSK, 84,1 g), rispettivamente. Pertanto, il rapporto di estratto di OPD:OSK:OSD è di circa 5:4:1. Tutti i campioni sono stati conservati a ´20 ˝C fino alla successiva analisi chimica ed esperimenti sugli animali.


Acteoside of Cistanche

2.2. Sostanze chimiche e reagenti


Isoquercitrina e quercetina{0}}O-gentiobiosio sono stati isolati dai baccelli di gombo dal nostro laboratorio, con purezza superiore al 98 percento, mediante analisi di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Gli standard di rutina, acido gallico e D-glucosio sono stati acquistati dal National Institute for Food and Drug Control (Pechino, Cina). Il reagente fenolico di Folin-Ciocalteu (1N, Coolaber Science & Technology, Pechino, Cina) è stato utilizzato per la determinazione dei fenoli. Un kit di potere antiossidante riducente ferrico (FRAP) è stato acquistato da Beyotime Biotechnology (Pechino, Cina). L'1,{7}}difenil-2-picrylhydrazyl (DPPH) e Trolox sono stati acquistati da Sigma-Aldrich Inc. (St. Louis, MO, USA). Il tampone fosfato (PBS, Gibco) è stato acquistato da Thermo Fisher (Waltham, MA, USA). I solventi, tra cui acetonitrile (Thermo Fisher, MA, USA) e acido formico (CNW, Dusseldorf, Germania), erano di grado HPLC e l'acqua è stata ottenuta da un sistema di purificazione dell'acqua Milli-Q (Millipore, MA, USA). I kit di test per la determinazione del lattato nel sangue (BLA), dell'azoto ureico sierico (BUN), del glicogeno epatico (HG), della glutatione perossidasi (GSH-Px), dell'acido tiobarbiturico (TBA) e della superossido dismutasi (SOD) sono stati acquistati da Nanjing Jiancheng Biotechnology Istituto (Nanchino, Cina). Tutti gli altri reagenti e sostanze chimiche utilizzati in questo studio erano di grado analitico.


2.3. Animali


Topi ICR maschi (20–22 g) sono stati acquistati dai Vital River Laboratories (n. qualificato: SCXK 2012-0001, Pechino, Cina). I topi sono stati alloggiati in gruppi di 6 animali per gabbia a temperatura costante (23 ˝C ˘ 2 ˝C) e umidità (50 percento ˘ 10 percento) con un ciclo luce/buio di 12/12- h (spie accese dalle 8:{11}} alle 20:00). Gli animali avevano libero accesso a una dieta alimentare standard e all'acqua potabile sterilizzata nella stalla SPF (esente da patogeni specifici). Tutte le procedure sperimentali sono state condotte sotto la supervisione e l'approvazione dell'Academy of Experimental Animal Center dell'Institute of Medicinal Plant Development e in stretta conformità con la Guida del NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (ottava edizione)[37].



2.4. Analisi chimica di OSD e OSK


2.4.1. Determinazione del contenuto di flavonoidi totali (TF).


Il contenuto di TF è stato misurato mediante il test colorimetrico NaNO{{0}}Al(NO)3 secondo gli standard tecnici per il test e la valutazione degli alimenti funzionali, che è stato rilasciato dalla Commissione nazionale per la salute e la pianificazione familiare della RPC in 2{{20}}03, con lievi modifiche. In breve, 50 mg di campione sono stati sciolti in 40 mL di acqua distillata e la soluzione del campione è stata estratta da 50 mL di cloroformio tre volte. Quindi, la soluzione acquosa è stata diluita a 50 mL e 2 mL della soluzione diluita sono stati adsorbiti da 5 g di resina poliammidica ed eluiti con 20 mL di etanolo al 70%. L'eluizione di etanolo al 70 percento è stata concentrata a 10 mL sotto vuoto. Tre millilitri di eluizione concentrata sono stati posti in un matraccio tarato da 10 mL, quindi sono stati aggiunti 2 mL di etanolo al 70 percento, 0,3 mL di NaNO2 (5 percento) e 0,3 mL di Al(NO)3. Dopo 5 minuti, 2 mL di soluzione di NaOH (1,0 M) sono stati aggiunti alla soluzione della miscela e lasciati riposare per 6 minuti. Infine, sono stati aggiunti 2,4 ml di etanolo al 30 percento. L'assorbanza è stata misurata rispetto a un bianco a 510 nm con uno spettrofotometro UV-VIS UNICO-2012 (Shanghai, Cina). Il contenuto totale di flavonoidi è stato calcolato dalla curva di calibrazione utilizzando la rutina come standard (20–100 mg/L). I risultati sono stati riportati come mg di rutina equivalente per mg di campioni.


Echinacoside of Cistanche

2.4.2. Determinazione del contenuto di polifenoli totali (TP).


Il contenuto di TP è stato determinato utilizzando il metodo Folin-the Ciocaiteu con lievi modifiche [38]. In breve, 50 mg di campione sono stati miscelati con 25 ml di soluzione di metanolo al 50 percento, quindi 0,5 ml di soluzione di campione, 0,3 ml di reagente Folin-Ciocaiteu e 10 ml di carbonato di sodio (10 percento) erano sufficientemente miscelato, quindi il volume è stato regolato a 25 ml con acqua distillata. La miscela è stata lasciata riposare a 50 ˝C al buio per 1 ora. L'assorbanza è stata misurata a 765 nm. È stata preparata una curva di calibrazione dell'acido gallico. I risultati sono stati espressi come mg di equivalenti di acido gallico per mg di campioni.


2.4.3. Determinazione di isoquercitrina e quercetina-3-O-gentiobiosio


La quantificazione dell'isoquercitrina e della quercetina{{0}}O-gentiobiosio è stata eseguita mediante HPLC-UV utilizzando una curva di calibrazione a cinque punti (r2=0.999) nell'intervallo 5–5{{23 }}0 µg/ml. Isoquercitrina e quercetina-3-O-gentiobiosio (5 mg, rispettivamente) e campioni (10 mg) sono stati sciolti rispettivamente in 10 ml di metanolo. Tutte le soluzioni sono state filtrate attraverso fifiltri in politetrafluoroetilene da 0,45-µm prima dell'analisi HPLC. La pompa HPLC Waters 600 con un rivelatore UV/Visibile Waters 2489 è stata impiegata per separare i composti attraverso una colonna a fase inversa (Thermo sync aQ, 4,6 mm ˆ 250 mm, 5 µm) a una velocità simile di 1 ml/min. La fase mobile era costituita da acetonitrile (A) e 0,1% di acido acetico in acqua (B). Il programma di eluizione del gradiente era il seguente: 10 percento di A a 0 minuti e linearmente fino al 40 percento in 40 minuti, 90 percento tra 41 e 50 minuti e 10 percento tra 51 e 65 minuti. La lunghezza d'onda per il rilevamento UV era 354 nm e la temperatura della colonna era impostata a 25 ˝C. I composti sono stati identificati confrontando con il tempo di ritenzione degli standard e quantificati calcolando l'area sotto la curva con standard esterni.


2.4.4. Determinazione del contenuto di polisaccaridi totali (TPS).


Il contenuto di TPS è stato determinato con il metodo dell'acido fenolo-solforico [39,40]. In breve, 80 mg di campione sono stati sciolti in 50 ml di acqua distillata, quindi la proteina è stata rimossa con il metodo selvaggio (soluzione campione:cloroformio:alcool N-butilico=20:4:1). Quindi, una quantità quadrupla di etanolo è stata aggiunta alla soluzione viscosa risultante per precipitare l'estratto di polisaccaride grezzo. La soluzione di etanolo è stata centrifugata a 617,4 ˆ g per 30 minuti per ottenere il precipitato. Il precipitato è stato lavato successivamente con etanolo, acetone ed etere e sciolto in 250 mL di acqua distillata. Quindi, 0,1 mL di soluzione di polisaccaridi sono stati miscelati con 0,9 mL di acqua distillata, 1 mL di soluzione di fenolo al 5% e 5 mL di acido solforico in una provetta e mantenuti a temperatura ambiente per 30 minuti. L'assorbanza è stata misurata a 490 nm con uno spettrofotometro UV-VIS UNICO-2012 (Shanghai, Cina). È stata stabilita una curva di calibrazione del glucosio e il contenuto di TPS è stato determinato dall'equazione di regressione della curva di calibrazione. I risultati sono stati espressi come mg di equivalenti di glucosio per mg di campioni.


2.5. Saggi antiossidanti in vitro


La capacità antiossidante di OPD, OSK e OSD è stata rilevata con tre metodi, tra cui il {{0}}}difenil-2-picrylidrazyl (DPPH) scavenging, il potere antiossidante riduttore ferrico (FRAP) e il potere riducente, secondo la letteratura [19,41] con lievi modifiche. Trolox è stato utilizzato come controllo positivo ei risultati sono stati espressi come capacità antiossidante equivalente di Trolox. Poiché OPD era composto da OSK e OSD, per illuminare i costituenti attivi dei baccelli di gombo, la concentrazione di OSK e OSD è stata utilizzata come equivalente OPD. Secondo i test preliminari, gli intervalli di concentrazione di OPD, ODS, OSK erano 0.0{{10}}4–0.8, {{17 }}.0{{20}}32–0.64 e 0.0008 –{{40}}.16 mg/mL per il test DPPH; 1.0–4.0, 0,8–3,2 e {{50}},2–0,8 mg/mL per il test FRAP; e 0,1–4, 0,08–3,2 e 0,02–0,8 mg/mL per il dosaggio della potenza riducente, rispettivamente Per il dosaggio DPPH, soluzione campione (50 µL) con un intervallo proporzionale (0,004–0,8 mg OPD/mL, 0,0032–0,64 mg OSK/ mL e 0,0008–0,16 mg di OSD/mL) sono stati miscelati con una soluzione di DPPH (100 µL, 1,28 ˆ 10´4 mol/L) per la misurazione dell'attività di scavenging dei radicali liberi (A1) e 95% di etanolo (100 µL) per il controllo (A2). L'acqua distillata (50 µL) è stata miscelata con una soluzione di DPPH (100 µL) per il bianco (A0). L'assorbanza è stata misurata a 517 nm dopo che le soluzioni sono state miscelate e mantenute a temperatura ambiente per 30 minuti. La capacità di eliminare il radicale DPPH è stata calcolata utilizzando la seguente equazione:


Flavonoids of Cistanche

Attività di scavenging ( percentuale ){{0}}[ 1-(A1-A2/{A0]* 100 percento . (1)


Il FRAP di tre soluzioni campione (1.0–4.0 mg OPD/mL, 0,8–3,2 mg OSK/mL e 0.2– {{10}},8 mg di OSD/mL) sono stati rilevati secondo le istruzioni del Beyotime Institute of Biotechnology. La soluzione campione diluita (5 µL) è stata miscelata con la soluzione di lavoro FRAP (180 µL) e mantenuta per 5 minuti a 37 ˝C. L'assorbanza della miscela di reazione è stata quindi registrata a 593 nm. La curva standard è stata preparata utilizzando FeSO4, con un range compreso tra 0,15 e 1,5 mm. Nella determinazione del potere riducente, soluzione campione (0,5 ml per 0,1–4 mg OPD/ml, 0.08–3,2 mg OSK/ml e 0.02–{50}},8 mg di OSD/mL) sono stati miscelati con lo stesso volume di PBS (0,2 mol/L , pH 6,6) e una soluzione di ferricianuro di potassio (1 percento, p/v), e l'incubazione è stata condotta per 20 minuti a 50 ˝C. Alla miscela è stato aggiunto acido tricloroacetico (0,5 mL, 10 percento, p/v), che è stata centrifugata a 201,6 ˆ g per 10 minuti. Dopo questo, lo strato superiore della soluzione (0,5 mL) è stato diluito con acqua distillata (0,5 mL) e quindi è stato aggiunto cloruro ferrico (0,1 mL, 0,1 percento, p/v). L'assorbanza è stata misurata a 700 nm.



2.6. Effetti anti-fatica di OPD, OSK e OSD e analisi biochimiche


Sulla base della stessa ragione dei test antiossidanti in vitro, le dosi di anti-fatica di OPD, OSK e OSD sono state progettate come gruppi OPD (0.75, 1.50 e 3.{{ 6}} g/kg di peso corporeo), gruppi OSK (0,60, 1,20 e 2,40 g/kg di peso corporeo) e gruppi OSD (0,15, 0,30 e 0,60 g/kg di peso corporeo). I topi sono stati nutriti con una dieta di base nell'ambiente sperimentale prima degli esperimenti. Dopo 3 giorni di adattamento, 120 topi sono stati divisi casualmente in dieci gruppi: gruppo di controllo (CG), 3 gruppi OPD, OSK e OSD ciascuno. Ogni gruppo aveva 12 topi. Il gruppo di controllo (CG) è stato trattato con acqua sterile, mentre gli altri gruppi sono stati trattati con l'estratto corrispondente. Acqua/estratti sono stati somministrati per via orale (8:{24}} am) ai topi una volta al giorno per 21 giorni e il test in campo aperto e il test di nuoto con carico di peso (WLST) sono stati condotti rispettivamente il 20° e il 21° giorno. Dopo il WLST, i topi sono stati rimossi dalla piscina, asciugati con salviette di carta e rimessi nelle loro gabbie originali. Gli sperimentatori di WLST e test in campo aperto sono stati accecati alle condizioni sperimentali e gli animali sono stati randomizzati prima della partecipazione agli esperimenti. Per chiarire l'effetto anti-fatica dell'OSD durante il recupero, i topi sono stati anestetizzati con etere e campioni di sangue sono stati raccolti da ciascun gruppo dopo WLST 24 ore. I campioni di siero sono stati ottenuti mediante centrifugazione (896 ˆ g, 15 min, 4 ˝C). I fegati sono stati rapidamente sezionati e lavati in soluzione fisiologica ghiacciata. Tutti i campioni sono stati congelati in azoto liquido e mantenuti a ´80 ˝C per ulteriori analisi.


2.6.1. Prova in campo aperto


Per verificare gli effetti di OPD, OSK e OSD sulle attività locomotorie, i topi sono stati valutati automaticamente utilizzando un sistema di controllo computerizzato in campo aperto da noi sviluppato [42,43]. L'apparato è costituito da quattro vasche metalliche (30 cm di diametro, 40 cm di altezza) con una videocamera fissata nella parte superiore. Gli esperimenti sono stati eseguiti in una stanza tranquilla e l'apparato è stato illuminato da una sorgente luminosa di 120 Lux sul soffitto. Un'ora dopo la somministrazione, ciascun topo è stato posizionato al centro del serbatoio di metallo e lasciato esplorare liberamente per 2 minuti e la distanza percorsa in 4 minuti, che è un indice dell'attività locomotoria, è stata calcolata utilizzando il software. Quattro topi sono stati testati contemporaneamente.


Cistanche can relieve chronic fatigue syndrome symptoms

2.6.2. Test di nuoto con carico di peso (WLST)


WLST è stato eseguito per indurre affaticamento secondo la metodologia descritta in precedenza con lievi modifiche [19,44,45]. Un'ora dopo la somministrazione, i topi sono stati caricati con fogli di piombo attaccati nella stessa posizione della coda e che pesavano circa il 3% del loro peso corporeo. Quindi i topi carichi di peso sono stati individualmente costretti a nuotare in recipienti cilindrici (diametro 40 cm), che sono stati riempiti con acqua (25 ˘ 1 ˝C) fino a una profondità di 30 cm. L'esaurimento è stato classificato come perdita di movimenti coordinati e mancata risalita in superficie entro 10 s e il tempo di nuoto è stato registrato immediatamente. L'acqua della piscina è stata sostituita dopo ogni sessione.



2.6.3. Analisi dei parametri biochimici relativi alla fatica


Il siero è stato preparato per la determinazione dell'azoto ureico nel sangue (BUN) e dell'acido lattico nel sangue (BLA). I fegati sono stati preparati per la determinazione degli equivalenti di malondialdeide (MDA), superossido dismutasi totale (SOD), glutatione perossidasi (GSH-Px) e glicogeno epatico (HG). Tutti i parametri biochimici sono stati determinati utilizzando kit disponibili in commercio e tutte le procedure sono state conformi alle istruzioni del produttore. In breve, il contenuto di HG è stato determinato utilizzando il reagente antrone a 620 nm, mentre il BLA è stato determinato utilizzando il reagente cloruro blu nitrotetrazolio a 530 nm. BUN è stato valutato dall'ureasi con il metodo dell'enzima accoppiato alla glutammato deidrogenasi a 640 nm. L'attività del GSH-PX è stata misurata in un sistema accoppiato misurando la diminuzione del nucleotide della trifosfopiridina (NADPH) a 340 nm. Il test per l'attività SOD si basava sulla sua capacità di inibire l'ossidazione da parte dell'O2 prodotta dal sistema xantina-xantina ossidasi. Un'unità di attività SOD è stata definita come la quantità che ha ridotto l'assorbanza a 450 nm del 50%. Il contenuto di equivalenti MDA è stato determinato a 532 nm facendo reagire con TBA per formare un prodotto cromoforico stabile.


2.7. Analisi statistica


Le determinazioni chimiche sono state effettuate in triplicato ei risultati sono espressi come valori medi. I saggi antiossidanti sono stati eseguiti in triplicato ei risultati sono stati espressi come valori medi ˘ deviazioni standard. Il comportamento e i dati biochimici sono stati analizzati dal software statistico SPSS (SPSS 19.0 Inc., Chicago, IL, USA). Per il confronto tra gruppi è stata utilizzata un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA unidirezionale) con il test della differenza meno significativa (LSD). I valori di P inferiori a 0.05 sono stati considerati statisticamente significativi. I risultati sono stati espressi come media ˘ errore standard della media (SEM).


3. Risultati


3.1. Analisi chimiche di OSK e OSD


Come mostrato nella Tabella 1, il contenuto di TF e TP nell'OSD era molto più alto di quello nell'OSD, mentre il contenuto di TPS nell'OSD era molto più basso di quello nell'OSD. I composti di isoquercitrina e quercetina-3-O-gentiobiosio sono stati rilevati solo nell'OSD mediante HPLC (mostrato nella Figura 1).


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3.2. Attività antiossidante in vitro di OPD, OSK e OSD


Come mostrato nella Tabella 2, l'attività antiossidante dell'OPD e dell'OSD è stata dimostrata da DPPH, FRAP e dai saggi di potere riducente e l'OSD ha mostrato un'attività antiossidante molto migliore dell'OPD. Tuttavia, l'OSK ha mostrato un debole effetto nel test di riduzione della potenza e nessun effetto nei test DPPH e FRAP. Pertanto, l'OSD era la parte attiva dei baccelli di gombo per l'attività antiossidante



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3.3. Effetti sull'attività locomotoria di OPD, OSK e OSD


Le attività locomotorie dei topi sono state testate il 20giorno dopo il trattamento con OSD. Come mostrato nella Figura 2, una dose elevata di gruppi OSD (0.6 g/kg) ha ridotto significativamente la distanza totale dei topi nel nuovo ambiente rispetto al gruppo di controllo (p=0. 04). Tuttavia, non sono stati osservati effetti significativi per altri gruppi sulla distanza totale. Questi risultati hanno mostrato che i baccelli e i semi di gombo non avevano alcun effetto eccitatorio sul sistema nervoso centrale. Inoltre, si potrebbe dedurre che l'OSD potrebbe possedere un leggero effetto sedativo a dosi elevate (0,6 g/kg).



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3.4. Effetti sul tempo di esaurimento del nuoto di OPD, OSK e OSD (WLST)


Come mostrato nella Figura 3, dopo l'integrazione di OPD, OSK e OSD per 21 giorni, il trattamento con OPD (3 g/kg) e OSD (0.3 e 0.6 g/kg) potrebbe prolungare notevolmente il tempo di nuoto dei topi, che si estendeva fino a 57,84 ˘ 12,37, 46,51 ˘ 5,82 e 70.05 ˘ 12.07 min (p < 0="" .05,="" p="">< 0.05="" e="" p="">< 0.{{70}}1),="" rispettivamente,="" molto="" più="" lungo="" di="" quello="" nel="" gruppo="" di="" controllo="" (15,20="" ˘="" 1,49="" min).="" nel="" frattempo,="" il="" trattamento="" con="" opd="" ({78}},75="" e="" 1,5="" g/kg),="" osd="" (0,15="" g/kg)="" e="" osk="" (0,6,="" 1,2="" e="" 2,4="" g/kg)="" non="" ha="" mostrato="" un="" aumento="" significativo="" del="" tempo="" di="" nuoto="" nei="" topi="" (="" 14.73="" ˘="" 1.28,="" 23.96="" ˘="" 3.70="" e="" 27.34="" ˘="" 5.72="" min,="" rispettivamente)="" rispetto="" al="" gruppo="" di="" controllo="" (p="0.897," p="0.398" e="" p="0.268," rispettivamente="" ),="" ma="" l'osd="" (0,15="" g/kg)="" ha="" mostrato="" una="" tendenza="" all'aumento="" del="" tempo="" di="" nuoto,="" ma="" non="" ha="" rivelato="" una="" differenza="" significativa="" (p="0.225)." inoltre,="" gli="" anova="" unidirezionali="" hanno="" mostrato="" differenze="" significative="" sul="" tempo="" esauriente="" di="" nuoto="" dei="" topi="" tra="" i="" gruppi="" (f="" (3,="" 40)="12.839," p=""><0,001). il="" tempo="" di="" nuoto="" del="" gruppo="" ad="" alta="" dose="" di="" osd="" (0,6="" g/kg)="" ha="" mostrato="" una="" marcata="" differenza="" rispetto="" al="" gruppo="" a="" dose="" media="" (0,3="" g/kg)="" (p="0.019)," ed="" è="" stato="" osservato="" lo="" stesso="" risultato="" tra="" 0.{77}}g/kg="" e="" 0.{79}}gruppi="" g/kg="" (p="0.034)," dimostrando="" che="" l'osd="" potrebbe="" prolungare="" il="" tempo="" di="" nuoto="" completo="" in="" modo="">

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3.5. Effetto dell'OSD sui parametri biochimici nei topi dopo il test di nuoto con carico di peso


Come ha mostrato il risultato del test di nuoto con carico di peso, l'OSD potrebbe prolungare notevolmente il tempo di nuoto dei topi; tuttavia, il trattamento con OSK non ha mostrato un aumento significativo del tempo di nuoto nei topi. Pertanto, i parametri biochimici sono stati determinati solo sui topi trattati con OSD.


3.5.1. Effetto dell'OSD su BLA, BUN e HG


La differenza di contenuto BLA, BUN e HG tra i gruppi era significativa (BLA: F (3, 40)=8.257, p < {{10}}.{{="" 20}}01;="" bun:="" f="" (3,="" 40)="8.596," p="">< 0.{{3{{32="" }}}}01;="" hg:="" f="" (3,="" 36)="6.960," p="">< 0.{{40}}="" 01).="" come="" mostrato="" nella="" tabella="" 3,="" i="" livelli="" di="" bla="" e="" bun="" nei="" gruppi="" osd="" erano="" significativamente="" inferiori="" a="" quelli="" del="" gruppo="" di="" controllo="" 24="" ore="" dopo="" il="" test="" di="" nuoto="" con="" carico="" di="" peso="" (bla:="" p="">< 0.05,="" p="">< 0,05="" e="" p="">< 0,01="" rispettivamente="" per="" 0,15,="" 0,3="" e="" 0,6="" g/kg;="" bun:="" p="">< 0,01="" per="" 0,15,="" 0,3="" e="" 0,6="" g/kg).="" i="" livelli="" di="" hg="" nei="" gruppi="" osd="" erano="" significativamente="" più="" alti="" rispetto="" al="" gruppo="" di="" controllo="" (p=""><0,05, p=""><0,01 e="" p=""><0,01 per="" 0,15,="" 0,3="" e="" 0,6="" g/kg,="">


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3.5.2. Effetto dell'OSD su GSH-PX, MDA e SOD


Le differenze di attività SOD, GSH-PX e MDA equivalenti tra i gruppi erano significative (MDA: F (3, 40)=8.355, p < 0.{{18}="" }01;="" sod:="" f="" (3,="" 42)="9.876," p="">< 0.001;="" gsh-px:="" f="" (="" 3,="" 40)="7.959," p="">< 0.001).="" come="" mostrato="" nella="" tabella="" 4,="" l'equivalente="" mda="" nei="" gruppi="" osd="" era="" significativamente="" inferiore="" a="" quello="" del="" gruppo="" di="" controllo="" dopo="" il="" test="" di="" nuoto="" con="" carico="" di="" peso="" (p="">< 0.01,="" p="">< 0.{="" {45}}1="" e="" p="">< 0.01="" per="" 0,15,="" 0,3="" e="" 0,6="" g/kg,="" rispettivamente).="" inoltre,="" i="" livelli="" di="" sod="" e="" gsh-px="" nei="" gruppi="" osd="" erano="" significativamente="" più="" alti="" rispetto="" al="" gruppo="" di="" controllo="" (sod:="" p=""><0,01, p=""><0,01 e="" p=""><0,01; gsh-px:="" p=""><0,05, p=""><0,01 e="" p="">< 0,01="" per="" 0,15,="" 0,3="" e="" 0,6="" g/kg,="">


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4. Discussione


Il baccello di gombo immaturo è un ortaggio sano che viene consumato nella maggior parte delle aree del mondo. Studi precedenti hanno riportato che i baccelli di gombo immaturi avevano effetti antiossidanti e anti-fatica [25,46], ma i suoi costituenti attivi e i potenziali meccanismi non erano chiari. Per studiare le attività antiossidanti e anti-fatica dei baccelli di gombo, abbiamo suddiviso i baccelli freschi di gombo in semi e bucce e ottenuto OSD, OSK e OPD attraverso un processo di estrazione, quindi l'attività antiossidante in vitro di OSD, OSK e L'OPD è stato rilevato con DPPH, FRAP e potere riducente e l'effetto anti-fatica in vivo di OSD, OSK e OPD è stato studiato utilizzando il test di nuoto con carico di peso. I nostri risultati hanno mostrato che l'OSD non solo possiede una buona attività antiossidante in vitro, ma ha anche prolungato significativamente il tempo di nuoto dei topi rispetto al gruppo di controllo, mentre l'OSD non ha mostrato alcun effetto in entrambi. Il tempo esauriente del nuoto è una misura diretta che riflette oggettivamente la resistenza all'esercizio del corpo [47] e la promozione della resistenza all'esercizio è correlata a tempi di nuoto più lunghi. Pertanto, come suoi semi va dedotta la parte antiossidante e antifatica dell'OPD. Inoltre, in questo studio, l'OSD (0.3{{10}}, 0,60 g/kg) potrebbe prolungare notevolmente il tempo di nuoto dei topi e le dosi equivalenti umane di semi di gombo potrebbero essere 0,9 ~1,8 g/kg (4,5~8,9 g/kg per i baccelli di gombo) in base alla superficie corporea [48]. Queste dosi possono essere raggiunte da una porzione umana di verdura. Tuttavia, i costituenti attivi dell'ocra non sono ancora chiari. I risultati dell'analisi chimica nel presente studio hanno mostrato che il contenuto di polifenoli nell'OSD è circa 24 volte superiore a quello dell'OSD, ma il contenuto di polisaccaridi nell'OSD è molto inferiore a quello dell'OSD (Tabella 1).


Moreover, total flavonoids content and two compounds of isoquercitrin and quercetin-3-O-gentiobiose were only detected in OSD and were not detected in OSK (Table 1). It has been proven that okra seeds contained epigallocatechin oligomers, catechin, and its oligomers, isoquercitrin, quercetin-3-O-gentiobiose, and other catechin and quercetin derivatives [27–29]. Furthermore, previous studies have reported that polyphenols like catechin and flavonoids like quercetin possess anti-fatigue activity due to their antioxidant activity [35,36,49–51]. Therefore, we deduced that polyphenols and flavonoids of OSD might be the antioxidant and anti-fatigue constituents. As for the reason that the effect of OPD was less than the effect of OSD, it might be that the high content of mucilaginous polysaccharides can affect the assimilation of polyphenols and flavonoids in OPD, which needs to be researched in the future. When it comes to the anti-fatigue mechanism of OSD, an open-field test showed that OSD had no central nerve stimulation in mice, which proved that the anti-fatigue of OSD was not through central excitation. Apart from this, it was likely that OSD possessed a slight sedative effect in high doses (>0,6 g/kg). Sono necessari più dati per dimostrarlo perché la piccola riduzione della locomozione potrebbe anche essere il risultato di una ridotta motivazione all'esplorazione o un possibile effetto ansiogeno. Tuttavia, in questa ricerca, il test in campo aperto è stato utilizzato per escludere la possibilità che l'OSD svolgesse un'attività anti-fatica mediante un effetto eccitatorio sul sistema nervoso centrale e non presentavano più dati per dimostrare l'effetto sedativo dell'OSD. Inoltre, è stato dimostrato che le specie di ossido reattivo eccessivo (ROS) prodotte durante l'esercizio fisico esauriente sono la componente principale dell'affaticamento fisico. Un eccesso di ROS può influenzare i vari processi metabolici ed enzimatici attaccando gli acidi grassi polinsaturi per produrre MDA e portare alla disfunzione dei biofilm [13,52].


Per questo motivo, i ROS non solo influenzano direttamente l'attività enzimatica durante l'approvvigionamento energetico e i processi di accoppiamento eccitazione-contrazione, ma accelerano anche l'accumulo di rifiuti inclusi BLA e BUN. Inoltre, l'aumento del livello di BLA è un'importante causa di affaticamento a causa dell'abbassamento del pH nei tessuti e un contenuto più elevato di BUN indica una minore resistenza all'esercizio. Pertanto, potrebbe non solo migliorare la resistenza all'esercizio, ma anche alleviare l'affaticamento fisico e promuovere il recupero promuovendo l'attività dei sistemi antiossidanti enzimatici tra cui SOD e GSH-PX, o integrare direttamente gli antiossidanti. Nel presente studio, la determinazione dei parametri biochimici che è stata condotta 24 ore dopo il test di nuoto indica che il trattamento OSD ha ridotto significativamente i livelli di BLA e BUN nel sangue, MDA nel fegato e ha aumentato i livelli di HG, SOD e GSH nel fegato durante il recupero dell'affaticamento, che ha dimostrato che l'OSD potrebbe alleviare l'affaticamento fisico e favorire il recupero. Considerando i risultati dei saggi antiossidanti in vitro nella nostra ricerca, si potrebbe dedurre che l'OSD ha svolto l'effetto anti-fatica non solo attraverso lo scavenging diretto dei radicali liberi ma anche promuovendo le attività degli enzimi antiossidanti tra cui SOD e GSH-PX.


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5. Conclusioni


In conclusione, il presente studio ha indicato che l'OSD è la parte anti-fatica del gombo ed è probabile che polifenoli e flavonoidi siano i costituenti attivi dell'OSD a causa della loro attività antiossidante. Tuttavia, la fatica è un fenomeno complesso e il presente studio sui meccanismi anti-fatica del gombo è molto preliminare. Maggiori dettagli devono ancora essere chiariti in futuro.



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