Proprietà inibitorie degli enzimi antiossidanti e idrolizzanti dell'amido degli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga

Per maggiori informazioni contattare:tina.xiang@wecistanche.com

Astratto: La maggior parte dei benefici per la salute derivati ​​dai cereali sono attribuiti ai loro composti bioattivi. Questo studio ha valutato i livelli dei composti bioattivi e ilantiossidantee idrolizzante dell'amidoenzimiproprietà inibitorie di sei ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga (codificato AS1828-1, 4, 6,8, 9, 11) in vitro. Gli ibridi di mais sono stati coltivati ​​presso l'International Institute of Tropical Agriculture (ITA), Nigeria. I composti bioattivi (fenoli totali, tannini,flavonoidi, e fitato) livelli, antiossidanti (DPPH" e ABTS capacità di scavenging e potere riducente) e idrolizzante dell'amidoenzimiLe attività inibitorie (-amilasi e x-glucosidasi) degli ibridi di mais sono state determinate mediante spettrofotometria. Allo stesso tempo, i carotenoidi sono stati quantificati utilizzando un sistema HPLC a fase inversa. Gli intervalli dei composti bioattivi erano:11.25-14.14 mg GAE/g (fenoli totali),3.62-4.67 mg QE/g (flavonoidi totali), 3.{{1{ {34}}}}.29 mg/g (tannini),3.66-4.31 percento (fitato),8.92-12.11ug/g (xantofille totali),2.{{19 }}.89 ug/g (carotene totale) e 3.17-3.77 ug/g(carotenoidi di provitamina A totali). Estratti degli ibridi di mais hanno eliminato il DPPH"(SC50: 9. 07-26,35 mg/mL) e ABTS*(2,{{30}},68 TEACmmol/g), Fe3 più Fe2 più ridotti (0,25±0,64-0 0,43±0,01 mg GAE/g) e -amilasi e -glucosidasi inibite, con intervalli di IC50 di 26.28-52,55 mg/mL e 47.72-63,98 mg/mL, rispettivamente. Tra i sei cloni degli ibridi di mais, AS{50}} ha avuto il più alto (p<0.05)levels of="" tannins="" and="" phytate="" and="" the="" strongest="">antiossidantee attività inibitorie degli enzimi idrolizzanti dell'amido. Sono state osservate correlazioni significative tra i fenoli totali e i seguenti: ABTS*(p<0.01, r="0.757)," dpph"sc50=""><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase=""><0.01,r=-0.836) and="" α-glucosidase=""><0.05, r="-0.582).Hence," the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids(especially="" as1828-9)="" may="" be="" beneficial="" for="" alleviating="" oxidative="" stress="" and="" postprandial="">

Parole chiave: fenoli totali; flavonoidi totali; tannini; carotenoidi; acido fitico; saggio di inibizione dell'alfa-glucosidasi; test di inibizione dell'alfa-amilasi

1. Introduzione

La fornitura di colture alimentari ad alto rendimento, nutrienti e salutari è essenziale per affrontare le sfide poste dalla malnutrizione e dalle malattie ad essa associate. Pertanto, diversi approcci sistematici, come l'allevamento di graffette resistenti alle malattie con una migliore qualità nutrizionale, sono stati impiegati nei programmi di ricerca sulla selezione delle piante per soddisfare le esigenze dietetiche della popolazione globale in rapido aumento. Ciò è diventato più imperativo considerando la drastica riduzione della quantità e della qualità dell'approvvigionamento alimentare globale causata dall'inquinamento ambientale, dal riscaldamento globale e dallo sviluppo di

nuove fonti di biocarburanti [1]. Nell'Africa subsahariana, è stato dimostrato che il mais (Zea mays L.) contribuisce alla sicurezza alimentare e alla riduzione della povertà tra le famiglie a basso reddito [2].

I genotipi del mais giallo-arancione sono noti per le loro eccellenti qualità nutrizionali e salutistiche dovute ai composti bioattivi che contengono, inclusi carotenoidi, composti polifenolici, acido fitico [3-5] e tocoferoli [6]. Tuttavia, la prospettiva della sicurezza alimentare e del miglioramento della nutrizione attraverso l'aumento della produzione di mais nell'Africa subsahariana è minacciata dalla pianta emiparassita radice, Striga hermonthica(Del.)Benth provoca perdite di resa fino al 100% in caso di grave infestazione a causa della perdita di acqua e nutrienti attraverso il parassitismo [7,8]. Di conseguenza, S. hermonthica pone un limite abiotico alla produzione di mais nell'Africa subsahariana, derivante da un cambio di paradigma rispetto al tradizionale sistema di coltivazione dei cereali che prevedeva lunghi periodi di maggese. Un sistema così tradizionale di coltivazione dei cereali assicurava che il livello del banco di semi di Striga nel terreno fosse tollerabile per le piante9]. Per mitigare le perdite nella resa e nella qualità del mais causate dall'infestazione da S.hermonthica, il miglior metodo di controllo è piantare genotipi di mais resistenti alla striga. Questa strategia è facilmente adattabile, specialmente in combinazione con altre pratiche di gestione [10].

Il nostro recente studio ha rivelato che gli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga contengono carotenoidi, polifenoli e acido fitico [3]. Questi composti bioattivi sono noti per agire come antiossidanti e sopprimere l'iperglicemia postprandiale, tra gli altri benefici per la salute [4,5,11,12]. Tra i composti bioattivi nel chicco di mais arancione, le attività inibitorie degli enzimi antiossidanti [13,14] e digestivi [15] dipendono dai composti fenolici, che esistono principalmente nella forma legata. Inoltre, è noto che i composti fenolici possiedono diverse altre bioattività come l'inibizione degli enzimi di conversione della xantina ossidasi e dell'angiotensina 1-, che sono implicati rispettivamente nella patogenesi della gotta e dell'ipertensione renina-dipendente [11], e anti- proprietà infiammatorie, antimicrobiche, antitumorali, anti-Alzheimer e antiallergiche tra le altre attività biologiche[16]. Pertanto, i composti fenolici di origine alimentare stanno attirando una grande attenzione sia da parte degli scienziati che dei consumatori a causa dei loro benefici per la salute umana [16].

L'obiettivo di questo studio era di valutare in vitro i livelli dei composti bioattivi e le proprietà inibitorie degli enzimi antiossidanti e idrolizzanti dell'amido di sei ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga. Lo studio ha anche testato le associazioni tra i costituenti bioattivi e ilantiossidantee attività inibitorie degli enzimi idrolizzanti dell'amido dei sei ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla strige.

2. Risultati e discussione

2.1. Componenti bioattivi in ​​ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla strige a sei tubazioni

I componenti bioattivi determinati nei sei gasdotti Ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga(AS1828-1(AS1), AS1828-4(AS4), AS1828-6(AS6), AS{{ 8}} (AS8), AS1828-9(AS9), AS1828-11(AS11))in questo studio includevano fenoli totali,flavonoidi, tannini, carotenoidi e acido fitico. I livelli di fenoli totali, flavonoidi totali, tannini e acido fitico sono presentati nella Tabella 1. I fenoli totali variavano da 11,25 a 14,14 mg GAE/g rispettivamente in AS4 e AS9; i flavonoidi totali variavano da 3,62 a 4,67 mg QE/g rispettivamente in AS11 e AS6; il contenuto di tannino variava da 3,64 a 6,29 mg/g rispettivamente in AS1 e AS9; e il contenuto di acido fitico variava dal 3,66% in AS6 al 4,47% in AS1.

Pertanto, AS9 conteneva il più alto (p<0.05)total phenolics="" and="" tannin="" levels,="" while="" as6="" had="" the="" highest="" total="" flavonoids="" content.="" the="" total="" phenolic="" concentrations="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" are="" higher="" than="" the="" values="" previously="" reported="" in="" yellow="" maize="" hybrids,="" including="" 2.15="" mg="" gae/g[15]and="" 2.08="" mg="" gae/g[17].="" similarly,="" the="" levels="" of="" total="" flavonoids="" detected="" in="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" in="" this="" study="" are="" higher="" than="" the="" 0.93±="" 0.03="" mg="" oqe/g="" recently="" reported="" in="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour="" [17].="" although="" the="" tannin="" levels="" are="" within="" the="" range(2.1-7.3="" mg/g)previously="" reported="" in="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" [3],="" the="" values="">

comparativamente superiore all'intervallo di tannini condensati (da 33,70 a 158,55 mg/100 g, equivalenti a 0,34-1,59 mg/g) riportato nei genotipi di mais pigmentato [13].

I livelli più elevati di fenoli totali, flavonoidi totali e tannini osservati nei sei gasdotti ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga, rispetto ai valori nella letteratura esistente per questi polifenolici in genotipi di mais giallo non resistenti alla striga, possono essere collegati a possibili differenze nel loro corredo genetico [3]. È noto che la biosintesi dei polifenolici e di altri metaboliti secondari vegetali aumenta in presenza di fattori di stress come difesa cellulare e/o meccanismo adattativo della pianta per resistere a condizioni sfavorevoli [16,18]. Inoltre, la germinazione dei semi di Striga è stimolata dalla produzione di strigolattoni (ormoni vegetali) nelle radici della pianta di mais, che la pianta rilascia sotto stress [19]. Pertanto, è possibile che il tratto di resistenza a S. hermonthica possa aver sovraregolato la biosintesi dei composti polifenolici nel mais per resistere al parassita. Ciò è supportato da un precedente rapporto secondo cui la resistenza post-attaccamento a S. hermonthica comportava l'ispessimento della parete cellulare della pianta e l'accumulo di molti piccoli vacuoli e depositi fenolici che sono densamente colorati all'interno della cellula vegetale [20].

I composti fenolici sono noti per la loro attività antiossidante dovuta alle loro proprietà redox, che consentono loro di agire come quencher di ossigeno singoletto, donatori di idrogeno e agenti riducenti [21]. Inoltre, è stato anche riportato che i composti fenolici inattivano gli enzimi digestivi, tra cui la lipasi pancreatica, l'amilasi e l'a-glucosidasi attraverso un legame non specifico con i singoli enzimi [22]. Come riportato in precedenza da Villiger et al.[23] i composti fenolici possiedono un'elevata affinità per le proteine ​​tramite legame idrogeno e idrofobo, migliorando la loro capacità di inibire enzimi come -amilasi e -glucosidasi mediante denaturazione delle proteine.

The phytic acid contents were comparable (p>0.05)tra i sei gasdotti ibridi di mais giallo-arancio resistenti alle strige. Questa gamma concorda con il nostro precedente rapporto sul contenuto di acido fitico degli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga [3]. L'acido fitico possiede attività antiossidante, oltre al suo effetto inibitorio contro lo sviluppo di calcoli renali [24], nonché proprietà antitumorali [25]. Le proprietà antiossidanti dei componenti bioattivi, in particolare i costituenti fenolici (flavonoidi e tannini) negli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga, possono anche prevenire e/o rallentare la degradazione ossidativa di alcuni nutrienti endogeni del mais che sono altamente inclini a ossidazioni, come acidi grassi insaturi e vitamine [16]. Inoltre, i componenti bioattivi negli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga possono ridurre la velocità con cui si formano alcuni prodotti ossidativi tossici, mantenendo così la qualità nutrizionale e prolungando la durata di conservazione dei prodotti alimentari che ne derivano [26].

The carotenoid content in the Striga-resistant yellow-orange maize hybrids is presented in Table 2. Total β-carotene (9-cis-β-carotene + 13-cis-β-carotene + all-trans-β-carotene) ranged from 2.42 to 2.89ug/g; total xanthophylls (lutein+zeaxanthin) ranged from8.92 to 12.11l ug/g; and total provitamin A carotenoids(β-cryptoxanthin+β-carotene+α-carotene） ranged from 3.17 to 3.77 μg/g,in AS6 and AS9,respectively. There were no significant differences(p>0.05) nel contenuto di carotenoidi del giallo-arancio resistente alla Striga

ibridi di mais. Gli intervalli di carotenoidi ottenuti in questo studio confermano quelli precedentemente riportati da Alamu et al. per gli ibridi di mais giallo biofortificati con provitamina A [27]. Inoltre, le xantofille totali avevano un valore più elevato rispetto ai carotenoidi della provitamina A totale negli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga, corroborando i risultati di Ortiz et al. [28].

I carotenoidi potrebbero aver integrato le attività inibitorie degli enzimi antiossidanti e idrolizzanti dell'amido dei composti fenolici negli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga, in conformità con le loro bioattività riportate. Ad esempio, è stato segnalato che i carotenoidi possiedono attività antiossidante come meccanismo principale alla base dei loro benefici per la salute [29]. Conferiscono inoltre effetti protettivi contro malattie croniche non trasmissibili come il cancro[30] e le malattie cardiovascolari [31]. Inoltre, è stato riportato che la -criptoxantina riduce significativamente il rischio di diabete di tipo 2 (T2D) e mitiga la resistenza all'insulina [32,33].

2.2. Attività antiossidante di sei ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga

L'attività antiossidante degli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga (Tabella 3) ha rivelato che i sei cloni della pipeline mostravano tutti attività antiossidante eliminando i radicali liberi (grado ABTS plus e DPPH*) e riducendo gli ioni ferrici (Fe3 plus) a ioni ferrosi (Fe2 più). L'attività antiossidante variava significativamente (p<0.05) among="" the="" hybrids,="" with="" as9="" having="" the="" strongest=""><0.05) free="" radicals="" scavenging="" abilities(7.28="" teac="" mmol/g="" and="" sc50,="" 9.07±="" 0.27="" mg/ml="" for="" abts+="" and="" dpph,="" respectively)and="" ferric-reducing="" power="" (0.43="" mg="" gae/g).="" it="" is="" pertinent="" to="" recall="" that="" as9-9="" also="" had="" the="" highest="" level="" of="" total="" phenolics="" and="" tannins,="" as="" presented="" earlier="" in="" table="" 1.="" the="" dpph°scavenging="" abilities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" obtained="" in="" this="" study="" (sc50:="" 9.07="" to="" 26.35="" mg/ml)="" are="" more="" potent="" than="" those="" reported="" by="" rodriguez-salinas="" et="" al.="" [13]="" for="" pigmented="" maize="" genotypes(ic50:="" 31="" to="" 52="" mg/ml)="" since="" a="" lower="" sc50="" or="" ic50="" is="" indicative="" of="" a="" stronger="" activity="" [34].="" however,="" vitamin="" c,="" a="" standard="" antioxidant="" with="" a="" lower="" sc50(4.63±0.28="" mg/ml),="" had="" a="" stronger="" dpph*scavenging="" activity="" than="" all="" of="" the="" six="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids.="" similarly,="" the="" abts·+="" scavenging="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" (2.65-7.68="" teac="" mmol/g)is="" higher="" than="" the="" value="" (294.81±="" 2.23="" umol="" teac/g)reported="" by="" irondi="" et="" al.[17]="" for="" provitamin="" a="" yellow="" maize="" flour.="" the="" stronger="" antioxidant="" activity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="" hybrids="" over="" the="" non-striga-resistant="" pigmented="" maize="" genotypes="" may="" be="" attributed="" to="" the="" increased="" deposition="" of="" polyphenolic="" compounds="" in="" their="" defense="" against="" s.="" hermonthica="" [20],="" which="" may="" have,="" consequently,="" enhanced="" the="" antioxidant="" capacity="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

La capacità di scavenging dei radicali liberi e il potere di riduzione del ferro degli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga suggeriscono che possono essere utili nel proteggere il corpo dagli attacchi ossidativi precipitati dai radicali liberi e dalle specie reattive dell'ossigeno. Pertanto, gli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga possono avere un effetto protettivo contro il danno ossidativo delle biomolecole nel corpo, inclusi acidi nucleici, proteine, lipidi e carboidrati [35] e le malattie croniche legate allo stress ossidativo [36] .

2.3. Attività inibitorie degli enzimi amido-idrolizzanti degli ibridi di mais giallo-arancio biofortificati resistenti alla striga a sei condotte

L'attività inibitoria degli enzimi di idrolisi dell'amido (-amilasi e -glucosidasi) delle sei tubazioni Ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga, espressa come IC50 (concentrazione di estratto che ha inibito l'attività enzimatica del 50 percento), è presentata nella Tabella 4. L'IC50 i valori degli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga su -amilasi e -glucosidasi variavano da 26,28 a 52,55 mg/mL e da 47,72 a 63,98 mg/mL in AS9 e AS4, rispettivamente. Pertanto, tra i sei ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga, AS9 con i valori IC50 più bassi sia per -amilasi che -glucosidasi, ha mostrato il più forte (p<0.05)inhibitory activity="" on="" these="" two="" enzymes.="" interestingly,="" there="" was="" no="" significant="" (p="">0.05) differenza nei valori IC50 di AS9 e acarbosio (un farmaco antidiabetico standard) sull'amilasi, indicando che le capacità inibitorie dell'amilasi di AS9 e acarbosio erano comparabili. Tuttavia, ad eccezione della capacità inibitoria dell'amilasi dell'AS9 che era paragonabile a quella dell'acarbosio, le attività inibitorie dell'amilasi e della glucosidasi dell'acarbosio erano più forti di quelle degli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga. Fabila-Garcia et al. [15]. I loro risultati hanno rivelato che l'estratto di mais giallo aveva la più alta attività inibitoria della glucosidasi, espressa in percentuale (69,8 percento), tra i genotipi del mais. Inoltre, Irondi et al. [17] hanno recentemente riportato valori di o-amilasi e -glucosidasi IC50 di 237,12±2,60 e 157,18±1,05 ug/mL, rispettivamente, per la provitamina A farina di mais giallo. Relativamente all'estratto di seta di mais, che è stato segnalato [37] per inibire l'a-amilasi e la -glucosidasi con valori medi di IC50 rispettivamente di 218,4 e 221,4 ug/mL, i sei ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga hanno avuto un effetto inibitorio più debole su c-amilasi e x-glucosidasi.

Sia la c-amilasi che l'o-glucosidasi sono coinvolte nella digestione dei carboidrati alimentari. Mentre -amilasi nell'intestino tenue idrolizza l'amido -1,4 legami per rilasciare oligosaccaridi e disaccaridi, -glucosidasi nel bordo della spazzola dell'intestino tenue completa la digestione idrolizzando ulteriormente gli oligosaccaridi e i disaccaridi per produrre monosaccaridi riassorbibili, compreso il glucosio e fruttosio [38]. Quindi, l'inibizione di questi due enzimi digestivi è un approccio terapeutico consolidato per alleviare l'iperglicemia postprandiale nella gestione del T2D e un meccanismo d'azione chiave

di molti agenti antidiabetici [39], inclusi farmaci, prodotti naturali e alimenti funzionali. Inoltre, gli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga hanno avuto un effetto inibitorio più sostanziale sulla -amilasi che sulla -glucosidasi. Questo modello di inibizione degli enzimi idrolizzanti dell'amido ha implicazioni terapeutiche benefiche e concorda con il modello riportato in studi precedenti [17,A0]. Pertanto, i sei ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga, in particolare AS9, possono avere alcuni vantaggi nel controllo dell'iperglicemia postprandiale.

2.4. Correlazioni tra i componenti bioattivi, attività inibitorie degli enzimi antiossidanti e idrolizzanti dell'amido degli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga a sei tubazioni

Tra i componenti bioattivi, i fenolici totali erano significativamente correlati con ABTS· plus (p<><0.01,r=-0.867), reducing=""><0.05,r=0.633), α-amylase="" ic50=""><0.01,r=-0.836)and α-glucosidase="" ic50=""><0.05,r=-0.582) (table="" 5).="" as="" earlier="" stated,="" lower="" dpph"="" scs0="" and="" enzyme="" ics0="" values="" are="" indicative="" of="" stronger="" scavenging="" and="" inhibitory="" activities="" of="" a="" given="" sample="" on="" dpph*="" and="" enzymes,="" respectively="" [34].="" thus,="" when="" taken="" together,="" the="" negative="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" dpph·sc50,="" α-amylase="" ic50="" and="" α-glucosidase="" ic50,="" as="" well="" as="" the="" positive="" correlations="" between="" total="" phenolics="" and="" abts="" scavenging="" ability="" and="" reducing="" power,="" suggest="" that="" phenolic="" compounds="" may="" have="" contributed="" majorly="" to="" the="" observed="" antioxidant="" and="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" of="" the="" striga-resistant="" yellow-orange="" maize="">

3. Materiali e metodi

3.1. Sostanze chimiche e reagenti

Trolox, quercetina, acido L-ascorbico, acido gallico, ABTS (2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolina-6-acido solfonico)), DPPH(2,2-difenile -2-picrylidrazyl), -glucosidasi da Bacillus stearothermophillus, p-nitrofenilglucopiranoside (PNPG), -amilasi, amido solubile e acarbosio sono stati acquistati da Sigma (St. Louis). Sono stati utilizzati gradi analitici di tutte le altre sostanze chimiche e solventi.

3.2. Collezione di campioni

Campioni di semi secchi di sei ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga (codificato AS1828-1,4,6,8,9,11) tutti coltivati ​​a Saminaka (8 gradi 39'E, 10 grado 34' N; altitudine di 760 m; precipitazioni annuali di 1149 mm; la temperatura di 18.1-37.3 gradi; tipo di suolo, nitosol districi) e Zaria (7 gradi 45'E, 11 gradi 8'N ; altitudine di 622 m; precipitazioni annue di 1076 mm; temperatura media di 13.9-35.5 gradi; tipo di suolo, Ferric Luvisols) sono stati raccolti dal programma di miglioramento del mais dell'Istituto internazionale di agricoltura tropicale (IITA), Ibadan, Nigeria. Gli ibridi sono stati piantati a maggio per due stagioni, in un design a blocchi completi randomizzato in tre repliche, durante la stagione delle piogge. I campioni sono stati macinati in farina (dimensione del setaccio di 0,50 mm) con Perten Laboratory Hammer Mill (3102, USA) e confezionati ermeticamente in sacchetti per campioni opachi per ulteriori analisi di laboratorio.

3.3. Preparazione1 dell'Estratto dei Campioni

Per preparare un estratto dalla farina di ibridi di mais giallo-arancio resistente alla striga, 1 g di farina è stato immerso in 10 mL di metanolo in una provetta da centrifuga da 50 mL coperta per una notte (12 h) con agitazione intermittente. Successivamente, la miscela è stata centrifugata a 3000 rpm per 10 minuti, quindi il surnatante (estratto metanolico) è stato raccolto e conservato a-4 grado C fino all'analisi [41].

3.4.Determinazione del contenuto totale di fenolici

Il metodo Folin-Ciocalteu descritto da Singleton et al. [42] è stato adottato per determinare il contenuto fenolico totale dell'estratto di farina degli ibridi di mais giallo-arancio resistente alla strige, una porzione (300 ul) dell'estratto è stata dispensata in una provetta (in triplicato). Successivamente, sono stati aggiunti 1,5 mL di reagente Folin-Ciocalteu (reagente Folin-Ciocalteu stock diluito 10 volte con acqua distillata) e 1,2 mL di soluzione di Na2CO3 (7,5 percento p/v) e la miscela è stata incubata al buio per 30 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, l'assorbanza è stata letta a 765 nm contro un bianco. Il contenuto fenolico totale è stato calcolato utilizzando una curva di calibrazione dell'acido gallico ed espresso come acido gallico equivalente (GAE) in un campione mg/g.

3.5. Determinazione del contenuto totale di flavonoidi

Il protocollo descritto da Kale et al. [43] è stato impiegato per determinare il contenuto totale di flavonoidi dell'estratto di farina di ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga. In breve, 0,5 ml dell'estratto sono stati dispensati in provette; ciò è stato seguito dall'aggiunta di 1,5 ml di metanolo,0,1 ml di cloruro di alluminio (10 percento), 0,1 ml di acetato di potassio 1 M e 2,8 ml di acqua distillata. La miscela di reazione è stata agitata su vortex e incubata a temperatura ambiente per 30 minuti, dopodiché l'assorbanza è stata letta a 514 nm. Il contenuto totale di flavonoidi degli estratti è stato espresso come quercetina equivalente (QE) in mg/g di campione.

3.6. Determinazione del contenuto di tannino

Il contenuto di tannini degli estratti di farina degli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga è stato quantificato con il metodo colorimetrico precedentemente descritto da Joslyn [44], con una leggera modifica. Una porzione del campione (0.5 g) è stata dispersa in 5 mL di HC1 all'1% in metanolo e lasciata per 15 min. Successivamente, la miscela è stata centrifugata a 3{{10}}00 rpm per 10 min. Una porzione di 0,1 mL del surnatante è stata dispensata nella provetta contenente 7,5 mL di acqua distillata, dopodiché sono stati aggiunti 0,5 mL di reagente Folin-Dennis e 1 mL di soluzione di Na2CO3 (35%) e il volume è stato portato a 10 mL con 0,9 mL di acqua distillata Dopo la miscelazione, la miscela di reazione è stata incubata per 30 minuti a temperatura ambiente e l'assorbanza è stata letta a 760 nm. Il contenuto di tannino, espresso come equivalente di acido tannico (TAE) in mg/g di campione, è stato calcolato da una curva standard dell'acido tannico.

3.7. Quantificazione del contenuto di carotenoidi del campione

Il contenuto di carotenoidi della farina degli ibridi di mais giallo-arancio resistente alla Striga è stato determinato adottando il metodo descritto da Howe e Tanumihardjo [45]. I carotenoidi sono stati estratti dalle farine mescolando 0,6 g del campione con 6 mL di etanolo (contenente 0,1 percento di idrossil toluene butilato). La miscela è stata posta in un bagno d'acqua a 85 gradi per 5 minuti. Successivamente, l'olio interferente nella miscela è stato saponificato con idrossido di potassio (80% p/v) a 85 gradi in un bagno d'acqua per 5 minuti. La sospensione è stata quindi miscelata utilizzando una macchina a vortice e riportata a bagnomaria per altri 5 minuti. È stato immediatamente trasferito in un bagno di ghiaccio e sono stati aggiunti 3 mL di acqua deionizzata fredda. Il contenuto di carotenoidi dalla miscela è stato separato tre volte consecutive con 3 mL di n-esano mediante centrifugazione a 1000 rpm per 10 s. Lo strato superiore della miscela è stato distribuito in un tubo concentratore da 50 mL. La frazione esano combinata è stata lavata tre volte con acqua deionizzata, agitata su vortice e centrifugata per 10 s a 1000 rpm. La frazione n-esano è stata essiccata utilizzando un concentratore TurboVap (LIV) sotto azoto gassoso per 25 minuti. L'estratto secco è stato ricostituito con metanolo/diclorometano (1 mL, 50:50 v/v) e un'aliquota di 100 μL è stata iniettata nel sistema HPLC per quantificare i carotenoidi. Il sistema HPLC (Water Corporation, Milford, MA, USA) comprendeva una colonna di guardia, una colonna carotenoide C30 YMC （4,6 × 250 mm, 3 μM）, una pompa HPLC binaria （Waters 626）, un campionatore automatico (Waters 717) e un rivelatore di fotodiodi (Waters 2996). Il sistema funzionava con il software Empower 1 (Waters Corporation). La fase mobile era costituita dal solvente A, contenente metanolo:acqua (92:8 v/v) con 10 mmol/L di acetato di ammonio, e dal solvente B, contenente il 100% di etere metil-terziario-butilico. L'eluizione del gradiente è stata eseguita a una portata di 1 mL/min nelle seguenti condizioni: 29 min di gradiente lineare dall'83 percento al 59 percento A; 6 minuti di gradiente lineare dal 59 percento al 30 percento A; 1 min di mantenimento a 30 percento A;4 min di gradiente lineare dal 30 percento all'83 percento A e un 4-min mantenimento all'83 percento . I cromatogrammi dei carotenoidi sono stati generati a 450 nm e i carotenoidi specifici sono stati identificati e quantificati utilizzando il metodo degli standard esterni basato sulla curva di calibrazione degli standard puri e sul confronto dello spettro di assorbimento e della coeluizione con i carotenoidi standard.

3.8. Determinazione del contenuto di acido fitico

Il metodo di Wheeler e Ferrel [46] è stato impiegato per determinare il contenuto di acido fitico delle farine. L'estrazione è stata effettuata agitando meccanicamente una miscela di 1 g di farina e 25 mL di acido tricloroacetico (TCA) al 3 percento per 1 ora e la sospensione è stata centrifugata per 15 minuti a 3500 rpm. Un'aliquota di 10 mL del surnatante è stata miscelata con una soluzione di cloruro ferrico da 4 mL e la miscela è stata riscaldata in un bagno d'acqua bollente per 45 minuti. La sospensione risultante è stata centrifugata a 3500 rpm per 15 minuti e il surnatante è stato accuratamente decantato. Successivamente, il precipitato è stato lavato due volte disperdendolo in 25 mL di TCA al 3 percento, riscaldando in un bagno d'acqua bollente per 10 minuti e centrifugando a 3500 rpm per 10 minuti. Il volume del precipitato è stato portato a 30 mL con acqua distillata e la miscela è stata riscaldata in un bagno d'acqua bollente per 30 minuti. La sospensione calda è stata filtrata con l'ausilio di carta da filtro Whatman (n. 2) e il precipitato è stato lavato con 60 mL di acqua distillata calda per garantire una filtrazione completa. Successivamente, il precipitato trattenuto sulla carta da filtro è stato sciolto con 40 mL di HNO3 3,2 M caldo in un matraccio tarato da 100 mL. Un'aliquota di 0,5 mL è stata trasferita in una provetta da centrifuga e diluita con 7 mL di acqua distillata, dopo di che sono stati aggiunti 2 mL di KSCN 1,5 M e il volume è stato portato a 10 mL con 0,5 mL di acqua distillata. L'assorbanza è stata letta (entro 1 min) a 480 nm. Il contenuto di acido fitico delle farine è stato calcolato utilizzando un rapporto atomico Fe/P di 4:6.

3.9. 2,2-Azinobis(3-etil-benzotiazolina-6-acido solfonico) catione radicale (ABTS· plus )Saggio di ScaOenging/

La capacità degli estratti di farina degli ibridi di mais giallo-arancio resistente alla striga di eliminare l'ABTS" è stata studiata adottando la procedura riportata da Reet al. [47]. Il reagente di lavoro ABTS* plus è stato preparato miscelando accuratamente lo stesso volume di soluzioni acquose di ABTS plus (7 millimoli/L) e K2S2Os (2,45 millimoli/L) e incubazione della miscela

in un armadio buio a temperatura ambiente per 16 h. Successivamente, l'assorbanza del reagente è stata regolata a 0.70±0.02 con etanolo (95 percento) a 734 nm. Quindi 0,2 ml dell'estratto e 2,0 ml del reagente ABTS* sono stati dispensati nella provetta, miscelati bene e incubati a temperatura ambiente per 15 minuti al buio. Infine, l'assorbanza è stata letta in uno spettrofotometro UV-Visible (Milton Roy Company, USA) a 734 nm. La capacità di scavenging ABTSe ​​plus degli estratti di farina è stata successivamente calcolata da una curva standard di Trolox ed è stata espressa come capacità antiossidante equivalente di Trolox (TEAC).

3.10. 2,2-Difenil-2-picrylidrazyl Radical (DPPH") Saggio di scavenging

Il protocollo riportato da Cervato et al. [48] ​​è stato impiegato per determinare la capacità degli estratti di farina di eliminare il DPPH", utilizzando la vitamina C (acido ascorbico) come antiossidante di riferimento. In breve, una miscela di reazione contenente 1.0 ml di diverse concentrazioni (8, 16 , 24, 32 mg/mL） dell'estratto （o vitamina C） e 3.0 ml di soluzione di grado DPPH （60 μM） è stato incubato a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Successivamente, l'assorbanza è stato letto a 517 nm e la "capacità di scavenging (percentuale) di DPPH degli estratti è stata calcolata ed espressa come concentrazione di estratto che ha eliminato il 50% di DPPH"(SC50).

3.11. Ridurre il test di potenza

La capacità degli estratti di farina di ridurre Fe3 plus a Fe2 plus è stata testata adottando il protocollo descritto da Oyaizu [49]. In breve, una miscela di estratto (2,5 ml), tampone fosfato di sodio 200 mM (pH 6,6) (2,5 ml) e ferricianuro di potassio 1% (2,5 ml) è stata incubata a 50 gradi per 20 minuti , dopo di che sono stati aggiunti 2,5 mL di acido tricloroacetico al 10%. Successivamente, la miscela è stata centrifugata a 650 × g per 10 minuti. Una porzione di 2,5 mL del surnatante è stata dispensata in una provetta, e 2,5 mL di acqua distillata e 1 mL di 0,1 percento di cloruro di ferrico sono stati aggiunti e miscelati accuratamente, e l'assorbanza è stata letta a 700 nm. Infine, il potere riducente degli estratti è stato calcolato ed espresso in milligrammi equivalenti di acido gallico per grammo di campione.

3.12. Saggio di inibizione dell'alfa-amilasi

Il saggio di inibizione dell'alfa-amilasi è stato condotto adottando la procedura descritta da Kwon et al. [50]. In questo test sono stati utilizzati il ​​pancreas suino -amilasi (EC3.2.1.1) e l'amido solubile (substrato). Diverse diluizioni degli estratti di farina, per un totale di 500μL e 500μL di 0.02 M tampone fosfato di sodio (pH6,9 con 0,006 M NaCl) contenente 0,5 mg/mL di soluzione di amilasi sono stati miscelati e incubati a 37 gradi per 10 minuti. Successivamente, sono stati aggiunti 500 μL di soluzione di amido all'1% in tampone fosfato di sodio 0,02 M e la miscela di reazione è stata incubata a 37 gradi per 15 minuti. Successivamente, l'idrolisi dell'amido catalizzata dall'amilasi è stata interrotta aggiungendo 1,0 mL di reagente colorato DNSA (1% 35-acido dinitrosalicilico e 12% di tartrato di sodio e potassio in 0,4 M NaOH). La miscela di reazione è stata successivamente incubata per 5 minuti in un bagno d'acqua bollente, raffreddata a temperatura ambiente e diluita con 10 mL di acqua distillata. L'assorbanza della miscela è stata letta a 540 nm. Nell'esperimento è stato incluso un test di riferimento che escludeva l'estratto di farine. Successivamente, la percentuale di inibizione dell'amilasi è stata calcolata come segue:

(A540R - A540S)× 100 percento di inibizione =A540R

dove A540R è la lettura dell'assorbanza del riferimento; A540S è la lettura dell'assorbanza del campione.

3.13. Saggio di inibizione dell'alfa-glucosidasi

Alpha-glucosidase inhibitory activity of the flours extracts was conducted by adopting the procedure reported by Kim et al. [39], using Bacillus stearothermophillus α-glucosidase (EC3.2.1.20) and para-nitrophenylglucopyranoside (PNPG) as the substrate. Five (5)units of an aliquot of α-glucosidase were incubated with 20 μg/mL of the extract for 15 min. The hydrolytic reaction was initiated by adding 3 mM PNPG prepared in 20 mM phosphate buffer, pH6.9, which served as a substrate. The hydrolytic reaction was allowed to proceed for 20 min at37°C, after which 2 mL of 0.1 M Na>CO: è stato aggiunto per terminare la reazione. Nell'esperimento è stato incluso un test di riferimento senza l'estratto di farina. L'assorbanza del p-nitrofenolo giallo rilasciato dall'idrolisi catalizzata dalla glucosidasi del PNPG è stata letta a 400 nm e la percentuale di inibizione della o-glucosidasi è stata calcolata così:

(A400R - A400S)× 100 percento di inibizione =A400R

dove A400R è la lettura dell'assorbanza del riferimento; A400 È la lettura dell'assorbanza del campione.

3.14. Analisi dei dati

I dati ottenuti in questo studio (da determinazioni triplicate) sono stati espressi come valori medi ± deviazione standard (DS). Utilizzando il pacchetto software statistico SPSS (16a versione), è stata eseguita un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) sui dati e i valori medi sono stati confrontati utilizzando il test post hoc di Tukey a p<0.05. the="" associations="" between="" the="" bioactive="" components,="" the="" antioxidant,="" and="" the="" starch-hydrolyzing="" enzymes="" inhibitory="" activities="" were="" calculated="" using="" the="" pearson="" correlation="" test.="" column="" representations="" of="" the="" mean="" values="" were="" done="" using="" graphpad="" prism="" (5th="">

4. Conclusioni

I sei ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga contenevano importanti costituenti bioattivi (fenoli totali, flavonoidi totali, tannini, acido fitico e carotenoidi). I loro estratti hanno mostrato una forte attività antiossidante e hanno inibito gli enzimi di idrolisi dell'amido (-amilasi e -glucosidasi). Tra gli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla striga, l'AS1828-9 aveva le attività inibitorie degli enzimi antiossidanti e idrolizzanti più potenti. Sono state osservate correlazioni significative tra il contenuto fenolico totale e la capacità di scavenging del grado ABTS* plus , DPPH, il potere riducente, l'attività inibitoria della -amilasi e della -glucosidasi degli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla Striga. Le attività inibitorie degli enzimi antiossidanti e idrolizzanti dell'amido suggeriscono che gli ibridi di mais giallo-arancio resistenti alla strige (soprattutto AS1828-9) possono essere utili nel prevenire e/o alleviare lo stress ossidativo e l'iperglicemia postprandiale.