Effetto antiossidante dell'azione complessa della vitamina E e dell'etiltiosolfanilato nel fegato e nei reni dei ratti in condizioni di stress ossidativo indotto da cromo(VI)
Mar 25, 2022
Bohdan Kotyk1,*, Ruslana Iskra1, Vira Lubunets2
Astratto:Lo scopo del nostro studio era di indagare l'efficacia e i benefici del complesso effetto della vitamina E e dell'etiltiosolfanilato (ETS) sullo stato del sistema pro/antiossidante nel fegato erenidi ratti in condizione di stress ossidativo indotto da Cr(VI). I ratti sono stati divisi in 8 gruppi.
Gruppi ricevuti: I (controllo) - soluzione fisiologica (150 ul) per 7 giorni; II – soluzione oleosa (1 ml) per 14 giorni; III, IV, VII, VIII - K2Cr2O7 (2,5 mg Cr(VI)/kg di peso corporeo (p.c.)) per 7 (III, IV) e per 14 (VII, VIII); V - vitamina E (20 mg/kg di peso corporeo) per 14 giorni; VI, VII, VIII - vitamina E in complesso con ETS (100 mg/kg pc) per 14 giorni. I risultati riportano che K2Cr2O7 ha causato lo stress ossidativo indotto da Cr(VI) a causa dell'attivazione dei processi di perossidazione lipidica (LP). L'azione del Cr(VI) per 7 giorni ha causato l'attivazione compensatoria del sistema di difesa antiossidante (AOS) in entrambi i tessuti. Tuttavia, l'azione più lunga del Cr(VI) è stata accompagnata dall'esaurimento dell'attività dell'enzima AOS e del contenuto di GSH. L'effetto complesso della vitamina E e dell'ETS ha ridotto l'intensità dello stress ossidativo indotto da Cr(VI) in entrambi i tessuti di ratto. I nostri risultati indicano proprietà antiossidanti positive della vitamina E e dell'ETS in condizioni di tossicità da Cr(VI).
Parole chiave:topi; sistema antiossidante; lo stress ossidativo; vitamina E; etiltiosolfanilato; bicromato di potassio; perossidazione.
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1. Introduzione
L'uso attivo del cromo per scopi industriali e agricoli ha portato a un significativo accumulo di composti contenenti Cr nell'ambiente [1-3]. I composti del cromo sono uno degli inquinanti più comuni negli ecosistemi acquatici e terrestri [4-6]. Le principali industrie che richiedono l'uso attivo di composti contenenti Cr sono la concia delle pelli, i preservanti del legno, la saldatura industriale dei metalli, la cromatura, la cromatura e la produzione di ferro cromato [1]. Il cromo è un metallo naturale, che si trova principalmente in due forme diverse: cromo trivalente (Cr(III)) e cromo esavalente (Cr(VI)). Cr(III) è l'ultimo stadio dell'ossidazione del cromo. La forma trivalente del cromo è comune in tutti i sistemi biologici, termodinamicamente stabile e mostra forti proprietà per formare composti di coordinazione. La forma esavalente (Cr(VI)) presenta forti proprietà tossiche e cancerogene e viene solitamente presentata come composti contenenti ossigeno di cromati (CrO42-) e dicromati (Cr2O72-) [1,7]. L'elevata tossicità dei composti Cr(VI) è associata alla capacità di essere facilmente assorbiti e trasportati rapidamente nelle cellule attraverso i canali del solfato [8,9]. Quindi Cr(VI) viene ridotto a Cr(III) in più fasi dopo la penetrazione nella cellula. Un gran numero di specie reattive dell'ossigeno (ROS) viene generato durante il processo di riduzione del Cr(VI) [10,11]. L'attivazione della formazione di ROS porta, a sua volta, allo sviluppo di stress ossidativo e danno tissutale. I processi di riduzione del Cr(VI) sono anche accompagnati da citotossicità, genotossicità, cancerogenicità e apoptosi attraverso la modulazione del gene regolatore p53 [12- 15]. Il sistema AOS è la principale barriera nella lotta allo stress ossidativo indotto da Cr(VI) [9]. I componenti enzimatici e non enzimatici del sistema AOS, come i flavoenzimi dipendenti da GSH e NADPH, stimolano e accelerano la riduzione del Cr(VI) altamente tossico a Cr(III) molto meno tossico. A loro volta, enzimi come SOD, CAT, GP e tripeptide GSH non enzimatico neutralizzano molti ROS, che si formano durante la riduzione del Cr(VI) [16,17]. Tuttavia, lo stress ossidativo indotto da Cr(VI) prolungato porta all'esaurimento delle risorse del sistema AOS e provoca danni a cellule, tessuti e organi ossidativi a causa dell'aumento dei processi pro-ossidanti [9,18]. I composti contenenti Cr(VI), come il dicromato di potassio (K2Cr2O7) alla dose di 8 mg/kg di peso corporeo provocano epatotossicità acuta nei ratti a causa dell'aumento dei processi necrotici e infiammatori e dell'esaurimento delle risorse del sistema AOS nel tessuto epatico degli animali [19] ]. Una singola iniezione sottocutanea di K2Cr2O7 a una dose di 10 mg/kg provoca anche stress ossidativo indotto da Cr(VI) e danni al tessuto epatico di ratto, seguiti da alterazioni degenerative dell'istoarchitettura e dilatazione dei sinusoidi epatici. Una dose simile di Cr(VI) provoca alterazioni degenerative delle cellule epiteliali tubulari, dilatazione cistica dei tubuli, congestione dei vasi sanguigni, cilindri ialini e dilatazione dello spazio di Bowman inrenidi ratti [14]. L'epatotossicità e la nefrotossicità causate da K2Cr2O7 sono accompagnate da stress ossidativo indotto da Cr(VI) acuto. La tossicità indotta da Cr(VI) stimola, in particolare, la formazione di ROS, l'iperattivazione dei processi di perossidazione, l'inibizione dell'attività degli enzimi antiossidanti, la diminuzione del GSH cellulare, nonché l'esaurimento dei gruppi sulfidrilici non proteici e l'accumulo di Cr(VI) fegato erenidi ratti e topi [14,20,21]. Si ritiene che il mantenimento dello stato antiossidante sia un fattore importante per ridurre e prevenire gli effetti negativi dello stress ossidativo indotto da Cr(VI) [14,22,23]. La neutralizzazione del Cr(VI) viene effettuata mediante riduzione enzimatica a Cr(V) e successiva trasformazione in sali contenenti Cr con la partecipazione di GR e NADPH. Antiossidanti non enzimatici come vitamina E, acido ascorbico, N-acetilcisteina, aglio in polvere e GSH hanno la capacità di ridurre il danno ossidativo causato da K2Cr2O7 [24,25]. La vitamina E è considerata l'antiossidante liposolubile non enzimatico più efficace, che protegge la membrana cellulare dalla perossidazione indotta dai radicali, stimola l'attivazione di enzimi antiossidanti e riduce l'intensità dello stress ossidativo causato dalla tossicità indotta da metalli pesanti. L'azione della vitamina E alla dose di 100 e 125 mg/kg di peso corporeo rispettivamente per 2 e 6 settimane, riduce il livello dei processi di perossidazione indotti da K2Cr2O7- e ripristina il contenuto di GSH e l'attività SOD nel fegato erenidi ratti [14,19,22]. La vitamina E alla dose di 125 mg/kg di peso corporeo mostra anche proprietà antiossidanti e antinfiammatorie e riduce l'intensità della tossicità indotta dal Cr(VI) nel fegato erenidi ratti [22].
L'etiltiosolfanilato appartiene a una classe di composti di tiosolfato. I tiosolfonati sono analoghi sintetici di composti organici di zolfo biologicamente attivi ottenuti da aglio, cipolla, broccoli e cavolfiore. I tiosolfonati sono più stabili dei loro analoghi naturali, mostrano un'ampia gamma di proprietà biologiche e sono caratterizzati da una bassa tossicità. Molti ricercatori hanno studiato negli ultimi anni le proprietà antitumorali, antinfiammatorie, antimicotiche, antimicrobiche e immunomodulatorie dei tiosolfati. Tuttavia, non ci sono studi sufficienti sulle proprietà antiossidanti dei tiosolfati. È noto che i tiosolfonati sono in grado di modulare i fattori di trascrizione, che sono coinvolti nell'attivazione dei geni del sistema AOS [26,27]. L'effetto antiossidante di questi composti si manifesta nella capacità di ridurre l'intensità dell'esaurimento del pool di GSH e la formazione di sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico (TBARS) nel fegato di ratto in condizioni di stress ossidativo [28]. Si sa molto poco sulle proprietà antiossidanti dei tiosolfati sotto l'azione tossica dei metalli pesanti. Tuttavia, i composti organici dello zolfo hanno mostrato un effetto antiossidante positivo contro lo stress ossidativo indotto da Cr(VI) [23,29-31]. I nostri studi precedenti indicano anche che l'etiltiosolfanilato esibisce proprietà antiossidanti ed elimina parzialmente gli effetti negativi dello stress ossidativo indotto da K2Cr2O7- nel tessuto del fegato di ratto [32].
Pertanto, date le proprietà antiossidanti positive della vitamina E, così come dei tiosolfati e dei loro analoghi naturali, il nostro studio mirava a indagare l'efficacia e i benefici del complesso effetto della vitamina E e dell'etiltiosolfanilato sullo stato del sistema pro/antiossidante nel fegato erenidi ratti in condizione di stress ossidativo indotto da Cr(VI).
2. Materiali e metodi
La sezione «Materiali e metodi» è stata preparata per analogia con la nostra precedente pubblicazione [32].
2.1. Design sperimentale.
Nel nostro lavoro, abbiamo utilizzato 40 ratti maschi Wistar del peso di 130- 140g. Abbiamo formato 8 gruppi di animali (5 ratti per gruppo): 1 gruppo di controllo e 7 gruppi sperimentali. Tutti i ratti sono stati alloggiati in condizioni standard e hanno ricevuto mangime standard e acqua potabile ad libitum.
I ratti di controllo intatti nel gruppo I hanno ricevuto un'iniezione intraperitoneale di soluzione salina fisiologica (150 µl) una volta al giorno per 7 giorni. Gli animali dei gruppi sperimentali III e IV sono stati trattati per via intraperitoneale con K2Cr2O7 disciolto in 150 µl di soluzione fisiologica (concentrazione di Cr(VI) 2,5 mg/kg di peso corporeo) rispettivamente per 7 e 14 giorni.
Il gruppo II ha ricevuto per via intragastrica 1000 µl di soluzione di olio di girasole (marchio «Oleina»; DSTU 4492: ISO 14024) una volta al giorno per 14 giorni e subito dopo è stata somministrata una soluzione fisiologica (150 µl) per via intraperitoneale una volta al giorno per 7 giorni.
Gruppo V: sono stati iniettati giornalmente per via intragastrica una soluzione oleosa di vitamina E alla dose di 20 mg/kg di peso corporeo per 14 giorni e subito dopo è stata somministrata una soluzione fisiologica (150 µl) per via intraperitoneale una volta al giorno per 7 giorni.
Gruppo VI: sono stati iniettati giornalmente per via intragastrica un complesso di soluzione oleosa di vitamina E [20 mg/kg di peso corporeo] ed etiltiosolfanilato (ETS) [100 mg/kg di peso corporeo] per 14 giorni e poi subito dopo iniettato giornalmente per via intraperitoneale con 150 µl di soluzione salina fisiologica per 7 giorni.
Gruppo VII/Gruppo VIII: ha ricevuto una soluzione oleosa intragastrica complessa di vitamina E [20 mg/kg di peso corporeo] e ETS [100 mg/kg di peso corporeo] per 14 giorni e subito dopo ha ricevuto K2Cr2O7 per via intraperitoneale ogni giorno alla dose di 2,5 mg Cr(VI)/kg di peso corporeo al giorno per 7 giorni/14 giorni.
Tutte le manipolazioni con animali nel nostro lavoro erano coerenti con le disposizioni della Convenzione europea per la protezione degli animali vertebrati utilizzati per scopi sperimentali e altri scopi scientifici (Strasburgo, 1986) e "Principi etici comuni per esperimenti sugli animali" (Ucraina, 2001). Il permesso di condurre ricerche è stato ottenuto dal Comitato di Bioetica dell'Istituto di Biologia Animale NAAS di Leopoli (Protocollo № 80).
Il lavoro ha studiato gli effetti del composto ETS (etil {0}} aminobenzenetiosolfato di nuova sintesi) in complesso con la vitamina E sul corpo del ratto. L'ETS è stato sintetizzato presso il dipartimento di tecnologia dei composti biologicamente attivi, farmacia e biotecnologia dell'Università Nazionale "Politecnico di Leopoli" secondo il protocollo descritto in dettaglio nel documento [33, 34].
Dopo la decapitazione degli animali, avvenuta in anestesia tiopentale, ilrenisono stati raccolti. Tutte le procedure attivaterenisono stati eseguiti a 4 gradi. Il materiale di ricerca erano gli omogenati renali di ratti, che sono stati preparati su tampone Tris-HCl 0.05 M con pH 7,4 nel rapporto di 1 g di tessuto e 9 ml di tampone (1:9, peso/volume ) e quindi centrifugato per 15 minuti a 1000 g. Dopo centrifugazione nei supernatanti ottenuti, sono stati determinati il contenuto di GSH, il livello dei prodotti di perossidazione e l'attività dell'enzima antiossidante.
2.1.1. Gruppi di animali.
Gruppi di animali sono stati confrontati secondo il seguente schema (Figura 1). Il gruppo I è un controllo intatto rispetto ai gruppi sperimentali III e IV, che non hanno ricevuto una soluzione oleosa. Controlli del gruppo II in relazione ai gruppi sperimentali V, VI, VII e VIII, che hanno ricevuto una soluzione oleosa. Abbiamo registrato la variazione percentuale (percentuale) degli indicatori per i gruppi sperimentali III e IV rispetto al gruppo I (controllo intatto). Abbiamo anche registrato la variazione percentuale degli indicatori per i gruppi sperimentali V, VI, VII e VIII rispetto al gruppo II (controllo del petrolio). Nella fase finale, abbiamo analizzato la variazione percentuale degli indicatori dei gruppi sperimentali III/IV rispetto al gruppo I (controllo intatto) e l'abbiamo confrontata con la variazione percentuale degli indicatori dei gruppi sperimentali VII/VIII rispetto al gruppo II (controllo dell'olio).
2.2. In lavorazione.
2.1.1. Concentrazione di LHP.
La misurazione del livello di LHP (idroperossidi lipidici) è stata eseguita in modo incoerente con i metodi di precipitazione delle proteine indotte dall'acido tricloroacetico e dei lipidi indotti dall'etanolo
estrazione [35]. Il tiocianato di ammonio interagisce con gli estratti di etanolo lipidico e avvia la reazione colorata. La registrazione dell'assorbanza del prodotto colorato è stata eseguita spettrofotometricamente (λ 480 nm). Il livello di LHP (SU/g di tessuto) è stato calcolato come differenza tra il controllo e i campioni sperimentali.
2.2.2 Concentrazione di TBARS.
La valutazione della concentrazione di TBARS (sostanze reattive dell'acido tiobarbiturico) si basa sul principio dell'interazione tra malondialdeide e acido tiobarbiturico in condizioni di acidità e temperatura elevata [35]. Il risultato dell'interazione tra malondialdeide e acido tiobarbiturico è la reazione del colore. La registrazione dell'assorbanza del prodotto colorato è stata eseguita spettrofotometricamente (λ 535 nm e λ 580 nm) e il livello di TBARS è stato calcolato come nmol MDA/g di tessuto.
2.2.3. Attività di MMG.
La misurazione dell'attività enzimatica della GP (glutatione perossidasi) viene eseguita in presenza di GSH prima e dopo l'aggiunta di idroperossido di butile terziario [35]. Valutare
l'attività GP si basa sul principio del tasso di ossidazione del GSH. I gruppi SH della molecola di GSH vengono ossidati in presenza di2-acido nitrobenzoico. L'anione dinitrofenile si forma come risultato dell'ossidazione del GSH. La registrazione dell'assorbanza del prodotto colorato è stata eseguita spettrofotometricamente (λ 412 nm) e l'attività GP è stata calcolata in nmol GSH/min. × mg di proteine.
2.2.4. Attività del GR.
La misurazione dell'attività enzimatica della GR (glutatione reduttasi) è stata eseguita in presenza di glutatione ossidato e NADPH [35]. La valutazione dell'attività GR si basa sul principio del tasso di riduzione del glutatione ossidato. La registrazione dell'assorbanza è stata eseguita spettrofotometricamente (λ 340 nm) per 1 minuto a 37 gradi. Il tasso di riduzione dell'estinzione è un indicatore dell'intensità della reazione. L'attività GR è stata calcolata in µmol NADPH/min. × mg di proteine.
2.2.5. Concentrazione di GSH.
La valutazione del livello di GSH (glutatione ridotto) si basa sul principio della formazione dell'anione dinitrofenil (prodotto colorato) dopo il legame dell'acido 2-nitrobenzoico al gruppo SH della molecola di GSH [36]. Il valore della concentrazione di GSH dipende dall'intensità della reazione cromatica. La registrazione dell'assorbanza del prodotto colorato è stata eseguita spettrofotometricamente (λ 412 nm) e il contenuto di GSH è stato calcolato come mmol di GSH/g di tessuto.
2.2.6. Attività di SOD.
La misurazione dell'attività enzimatica della SOD (superossido dismutasi) è stata eseguita in presenza di NADH e fenazine metosolfato [36]. La valutazione dell'attività SOD si basa sul principio della riduzione del nitroblue tetrazolio. L'intensità dell'inibizione del processo di riduzione del nitroblue tetrazolio indica l'intensità dell'attività enzimatica. La registrazione dell'assorbanza è stata eseguita spettrofotometricamente (λ 540 nm) e l'attività SOD è stata calcolata in unità standard per 1 mg di proteina.
2.2.7. Attività del CAT.
La misurazione dell'attività enzimatica della CAT (catalasi) è stata eseguita in presenza di sali di molibdeno, che interagiscono con il perossido di idrogeno [36]. Il prodotto colorato è stato formato come risultato della reazione. La registrazione dell'assorbanza del prodotto colorato è stata eseguita spettrofotometricamente (λ 410 nm) e l'attività CAT è stata calcolata in mmol/minuto × 1 mg di proteine.
2.2.8. Concentrazione proteica.
La concentrazione di proteine totali negli omogenati tissutali è stata misurata con il metodo Lowry [37] utilizzando i kit "Simko LTD" (Ucraina, Lviv). La misurazione di tutti i valori di assorbanza è stata eseguita su uno spettrofotometro "Unico" 1205 (USA).
2.3. Analisi statistica.
Tutti i dati sperimentali sono stati analizzati statisticamente dal software Microsoft Excel utilizzando l'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) e il test Tukey-Kramer. Tutti i valori sperimentali sono stati calcolati come valori medi (M) ± errore standard (SEM) e sono stati considerati statisticamente significativi a P <>
3. Risultati e discussioni
La sezione «Risultati e discussioni» è stata preparata per analogia con la nostra precedente pubblicazione [32].
3.1. Marcatori di stress ossidativo.
Abbiamo scoperto che la somministrazione intraperitoneale di dicromato di potassio per 7 e 14 giorni porta ad un aumento del contenuto di marcatori di stress ossidativo nel tessuto epatico e renale dei ratti maschi. L'esposizione a K2Cr2O7 a una dose di 2,5 mg Cr(VI)/kg di peso corporeo per 7 (III gruppo) e 14 giorni (IV gruppo) ha causato un aumento significativo del contenuto di TBARS nel fegato degli animali rispetto al gruppo I (controllo) di 69 e 75 per cento, rispettivamente (Tabella 1). Il livello di TBARS era anche significativamente elevato nel tessuto renale dei ratti dei gruppi sperimentali III e IV rispetto al controllo rispettivamente del 41 e 46 per cento. Una dose simile di Cr(VI) ha portato a un aumento significativo della concentrazione di LHP nel fegato di ratto dei gruppi sperimentali III e IV rispetto al gruppo I rispettivamente del 112 e del 127%. Il livello di LHP è stato anche significativamente aumentato nel tessuto renale di ratto dopo 7 (III gruppo) e 14 giorni (IV gruppo) di azione Cr(VI) rispetto al gruppo di controllo rispettivamente del 39 e 56 percento.
La ragione dell'aumento dell'intensità del processo di perossidazione nel fegato e nei reni dei ratti è l'iperattivazione indotta da Cr(VI) della generazione di radicali idrossile e superossido. La formazione di ROS indotta da Cr(VI) provoca danni alla struttura dei componenti lipidici della membrana cellulare e, di conseguenza, provoca un aumento del contenuto di TBARS [19,20,38]. Gli intermedi della riduzione del Cr(VI) entrano in reazioni simili a quelle di Fenton, interagiscono con il perossido di idrogeno e avviano i radicali idrossilici [19]. Secondo la letteratura, il Cr(VI) aumenta l'intensità della generazione di radicali superossido attivando i complessi enzimatici NADPH-ossidasi [39] e xantina-xantina ossidasi [40].
La somministrazione intragastrica di vitamina E (gruppo V) e vitamina E in complesso con ETS (gruppo VI) per 14 giorni ha portato a una significativa diminuzione del contenuto di TBARS nel fegato degli animali rispetto al gruppo II rispettivamente del 13 e del 16 percento (Tabella 1). Una leggera diminuzione del livello di TBARS è stata registrata anche nel tessuto renale dei ratti dei gruppi sperimentali V e VI rispetto al gruppo II rispettivamente del 5 e 3%. Il contenuto di LHP è stato significativamente ridotto nei gruppi sperimentali V e VI nel fegato di ratto rispetto al gruppo II rispettivamente del 12 e 16 percento. C'era anche una significativa diminuzione del livello di LHP nel tessuto renale di ratto di gruppi sperimentali simili rispetto al gruppo II rispettivamente del 10 e 8 per cento.
Il contenuto di TBARS nel fegato di ratto è rimasto al livello degli indicatori del gruppo II dopo 14 giorni di pretrattamento complesso con vitamina E ed ETS con la successiva actina di Cr(VI) per 7 giorni (gruppo VII). Il precedente impatto complesso della vitamina E e dell'ETS da parte dell'azione successiva del Cr(VI) per 14 giorni ha portato a un aumento del livello di TBARS nel tessuto epatico del gruppo VIII rispetto al gruppo II del 23%. Tuttavia, l'aumento del contenuto di TBARS nel tessuto epatico degli animali del gruppo VIII (23%) rispetto al gruppo II è stato del 52% inferiore all'aumento percentuale del contenuto di TBARS nel fegato di ratto del gruppo IV (75%) rispetto al gruppo I .
La concentrazione di TBARS è aumentata nel tessuto renale di ratto dopo 14 giorni di pretrattamento complesso con vitamina E ed ETS dall'azione successiva di Cr(VI) per 7 (gruppo VII) e 14 giorni (gruppo VIII) rispetto al gruppo II di 21 e 31 per cento, rispettivamente. Tuttavia, l'intensità dell'aumento del contenuto di TBARS nei reni di ratto dei gruppi VII (21%) e VIII (31%) rispetto al gruppo II era del 25 e del 21% inferiore all'aumento percentuale del livello di TBARS negli omogenati renali dei gruppi III (46%) e IV (52%) rispetto al gruppo I.
Il pretrattamento complesso con vitamina E ed ETS mediante la successiva actina di Cr(VI) per 7 giorni (gruppo VII) e 14 giorni (gruppo VIII) ha causato un aumento del contenuto di LHP nel tessuto epatico dei ratti rispetto al gruppo II del 17 e del 52%. , rispettivamente. Tuttavia, l'aumento del livello di LHP nel fegato di ratto dei gruppi VII (17%) e VIII (52%) rispetto al gruppo II era del 97% e del 75% inferiore all'aumento percentuale del contenuto di LHP negli omogenati di fegato dei gruppi III (114% ) e IV (127%) rispetto al gruppo I.
La concentrazione di LHP è aumentata nei reni degli animali dei gruppi VII e VIII rispetto al gruppo II rispettivamente del 16 e del 31%.
Tuttavia, l'aumento del contenuto di LHP nei reni di ratto dei gruppi VII (16%) e VIII (31%) rispetto al gruppo II era del 23 e del 25% inferiore all'aumento percentuale del livello di LHP nel tessuto renale dei gruppi III (39% ) e IV (56%) rispetto al gruppo I.
I dati della letteratura riportano che la vitamina E è caratterizzata da efficaci proprietà antiossidanti, inibisce i processi di perossidazione lipidica e riduce i livelli di ROS in vitro e in vivo [22]. La somministrazione orale di vitamina E attenua l'epatotossicità indotta da Cr(VI) e riduce il contenuto di TBARS nel fegato dei ratti [19]. La ragione della diminuzione dell'intensità dei processi di perossidazione nel tessuto epatico di ratto può anche essere la proprietà antiossidante del gruppo solforato, che è un componente strutturale della molecola ETS [32,42,43]. Questo gruppo funzionale ha le proprietà di ridurre il contenuto di LHP [41]. Gli S-alchiltiosolfonati, che sono gli analoghi strutturali sintetici dell'ETS, inibiscono l'attività del sistema xantina-xantina ossidasi e la generazione di ROS [27]. La vitamina E è un componente importante del citoplasma e della membrana cellulare. L'effetto antiossidante della vitamina E previene l'attivazione delle reazioni a catena di autossidazione lipidica dovute alla neutralizzazione dei radicali perossilici e alcossido. I radicali perossilici reagiscono anche più rapidamente con la vitamina E rispetto ai lipidi della membrana cellulare [14].
Pertanto, l'effetto tossico del Cr(VI) porta ad un aumento del contenuto di TBARS e LHP nel fegato e nel tessuto renale degli animali. Tuttavia, il precedente impatto della vitamina E con l'ETS riduce l'intensità dei processi di perossidazione nel fegato e nei reni dei ratti sotto l'azione dello stress ossidativo indotto dal Cr(VI).
3.2. Sistema antiossidante del glutatione.
C'è stato un aumento dell'attività di GP nel tessuto epatico dei ratti sotto l'azione di Cr(VI) per 7 (III gruppo) e 14 giorni (IV gruppo) rispetto a un gruppo I rispettivamente del 55 e del 15 percento (Tabella 2).
La somministrazione intraperitoneale di dicromato di potassio per 7 giorni (gruppo III) ha causato un aumento del contenuto di GSH cellulare nel tessuto epatico di ratto del 12% rispetto al controllo (gruppo I). Il livello di GSH non differiva dai valori di controllo nei reni degli animali del gruppo III (K2Cr2O7 14 giorni). Tuttavia, si è verificata una diminuzione del pool di GSH nel fegato e nei reni dei ratti dopo 14 giorni di azione Cr(VI) (gruppo IV) rispetto al gruppo I rispettivamente del 34% e del 36%. A sua volta, l'elevata sensibilità del tessuto renale alla tossicità indotta da Cr(VI) può essere la ragione dell'inattivazione del GP nei reni degli animali del gruppo IV [1, 16].
Gli autori suggeriscono anche che il meccanismo di inattivazione del GP in condizioni di tossicità da Cr(VI) sia effettuato legando il Cr(VI) al sito attivo dell'enzima e spostando direttamente i cofattori-metalli dal sito attivo [25].
L'attività di GR non è cambiata nel fegato degli animali del gruppo III rispetto al controllo. Ma 14 giorni di esposizione al Cr(VI) hanno portato a una diminuzione dell'attività GR nel tessuto epatico di ratto degli animali del 17% rispetto al gruppo I. L'inibizione dell'attività GR è stata osservata anche nel tessuto renale degli animali dopo 7 (III gruppo) e 14 giorni (gruppo IV) di iniezione di K2Cr2O7 rispetto al gruppo I rispettivamente del 45 e 43 percento.
Assumiamo che un Cr(VI)-una diminuzione indotta del contenuto di GSH possa essere la ragione della soppressione del GR in entrambi i tessuti dei ratti [44-46]. Le molecole di GSH forniscono la neutralizzazione diretta dei radicali liberi, svolgono un ruolo chiave nei meccanismi di protezione antiossidante delle cellule [47] e sono coinvolte nei processi di riduzione del Cr(VI) [19]. Pertanto, la diminuzione del contenuto di GSH nel fegato di ratti affetti da Cr(VI) potrebbe essere una conseguenza dell'uso intensivo di molecole di GSH nei processi di neutralizzazione dei ROS e dei radicali liberi in condizioni di stress ossidativo indotto da K2Cr2O7-.
I dati di letteratura descrivono anche il meccanismo diretto di inibizione dell'attività GR dovuto al legame specifico del metallo pesante alla coppia redox tiolo/tiolato e al residuo di istidina nel centro catalitico della forma ridotta dell'enzima. Quindi lo ione metallico legato provoca cambiamenti nella flessione dell'anello isoallossazinico del FAD e nell'idrofobicità del suo microambiente. Di conseguenza, l'attività enzimatica del GR è inibita [48].
La somministrazione di vitamina E (gruppo V) e vitamina E in complesso con ETS (gruppo VI) ha causato un aumento del livello di GSH nel fegato dei ratti rispetto al gruppo II rispettivamente del 15 e del 21%. Il precedente impatto complesso della vitamina E e dell'ETS da parte dell'azione successiva del Cr(VI) per 7 (gruppo VII) e 14 giorni (gruppo VIII) ha portato a un aumento del contenuto di GSH nel tessuto epatico rispetto al gruppo II del 21 e 23 percento , rispettivamente.
Non abbiamo trovato una differenza statisticamente significativa nei cambiamenti del contenuto di GSH nei tessuti animali dopo la somministrazione di vitamina E e vitamina E in complesso con ETS. Abbiamo osservato solo una tendenza ad aumentare i livelli di GSH nei reni degli animali dopo il trattamento per 14 giorni con vitamina E e vitamina E in complesso con ETS.
Secondo la letteratura, la vitamina E mostra proprietà epato- e nefroprotettive contro la tossicità indotta da Cr(VI), ripristina il contenuto di GSH e supporta l'attività degli enzimi AOS [14, 19]. Gli autori riportano inoltre che i tiosolfati sono responsabili dell'attivazione dipendente da Nrf2- degli elementi reattivi agli antiossidanti (ARE), che inducono l'attivazione degli enzimi del sistema di difesa antiossidante e lo scavenging dei radicali liberi. L'attivazione di ARE mediata da tiosolfato stimola l'attività dei geni che codificano per -GCS. Forse meccanismi simili sono coinvolti nell'aumento del contenuto di GSH sotto l'azione di ETS [26]. I dati della letteratura indicano anche che la stimolazione ARE induce l'espressione genica GR e GS. Questi enzimi svolgono un ruolo chiave nella sintesi e riduzione delle molecole di GSH [49].
Le molecole di tiosolfato hanno anche la capacità di trasformarsi in mono-, di- e trisolfuri. È possibile che i prodotti di trasformazione dei tiosolfati contenenti zolfo possano essere coinvolti nella biosintesi di nuove molecole di GSH [29].
Il pretrattamento complesso con vitamina E ed ETS mediante la successiva actina di Cr(VI) per 7 giorni (gruppo VII) e 14 giorni (gruppo VIII) ha mostrato solo una tendenza al ripristino dell'attività GP e GR nel fegato di ratto. Tuttavia, in questo caso non abbiamo riscontrato differenze statisticamente significative.
L'azione della vitamina E in particolare (gruppo V) e in combinazione con ETS (gruppo VI) per 14 giorni ha portato a un'attivazione di GP nel tessuto renale degli animali rispetto al gruppo II rispettivamente del 19 e del 22 per cento. Il precedente effetto complesso della vitamina E e dell'ETS mediante l'azione successiva del Cr(VI) per 7 giorni ha causato un aumento dell'attività del GP del 38% nei reni di ratto del gruppo VII rispetto al gruppo II (Tabella 2). Tuttavia, l'aumento dell'attività di GP nei reni di ratto del gruppo VII (38%) rispetto al gruppo II è stato del 47% inferiore alla percentuale di iperattivazione di GP nel tessuto renale di ratto del gruppo III (85%) rispetto al gruppo I.
A sua volta, l'attività GP è stata soppressa del 16% nel tessuto renale dei ratti dopo il precedente impatto della vitamina E nel complesso con ETS per 14 giorni dall'azione successiva di Cr(VI) per 14 giorni (gruppo VIII) rispetto al gruppo II. Tuttavia, la diminuzione dell'attività del GP nel tessuto renale degli animali del gruppo VIII (16%) rispetto al gruppo II è stata dell'11% inferiore alla percentuale di inattivazione del GP nei reni di ratto del gruppo III (27%) rispetto al gruppo I. Un leggero un aumento dell'attività GR (8%) è stato osservato dopo 14 giorni di esposizione complessa alla vitamina E ed ETS nel tessuto renale degli animali del gruppo VI rispetto al gruppo II.
Il precedente impatto complesso di vitamina E ed ETS da parte dell'azione successiva di Cr(VI) per 7 (gruppo VII) e 14 giorni (gruppo VIII) ha causato una diminuzione dell'attività GR nei reni di ratto rispetto al gruppo II del 17 e 36 percento, rispettivamente.
Tuttavia, l'intensità della diminuzione dell'attività GR nel tessuto renale di ratto dei gruppi VII (17%) e VIII (36%) rispetto al gruppo II era del 28 e 7% inferiore alla percentuale di inattivazione dell'attività GR negli omogenati renali dei gruppi III (45%) e IV (43%) rispetto al gruppo I.
Ipotizziamo che la stabilizzazione parziale dell'attività GP e la diminuzione dell'intensità della soppressione del GR nei reni di ratto sotto l'azione di Cr(VI) sia stata mediata dall'effetto antiossidante del complesso di vitamina E ed ETS. I risultati degli studi sopra descritti hanno indicato che la precedente esposizione alla vitamina E e all'ETS ha attenuato l'intensità dei processi LP indotti da Cr(VI) nei reni dei ratti. Secondo la letteratura, un forte aumento del contenuto di TBARS, LHP e prodotto di perossidazione proteica è accompagnato dall'interruzione dell'attività degli enzimi AOS correlati al GSH [50]. È possibile che il complesso effetto antiossidante della vitamina E e dell'ETS stabilizzi l'attività enzimatica di GP e GR riducendo il contenuto di LHP e TBARS nel tessuto renale degli animali.
Pertanto, l'iniezione intraperitoneale di K2Cr2O7 per 7 giorni porta a una leggera attivazione compensatoria di GP e ad un aumento del contenuto di GSH nel fegato dei ratti. Una leggera stimolazione GP si osserva anche dopo 14 giorni di azione Cr(VI). Tuttavia, 14 giorni di esposizione a K2Cr2O7 provocano l'esaurimento del pool di GSH epatico e l'inibizione dell'attività GR. L'esaurimento del contenuto di GSH indotto da Cr(VI) elimina nel tessuto epatico mediante un complesso pretrattamento intragastrico di vitamina E ed ETS. L'azione del Cr(VI) per 7 giorni porta all'attivazione compensatoria di GP e alla soppressione di GR nei reni dei ratti. A loro volta, 14 giorni di esposizione a K2Cr2O7 provocano l'inattivazione di GP, GR e deplezione del contenuto renale di GSH. Il precedente impatto complesso della vitamina E e dell'ETS attenua l'intensità dell'inattivazione del GR e stabilizza l'attività del GP nel tessuto renale di ratto in condizioni di stress ossidativo indotto da K2Cr2O7-.
3.3. Enzimi antiossidanti.
L'iniezione intraperitoneale di dicromato di potassio per 7 e 14 giorni ha portato a una diminuzione dell'attività della SOD nel tessuto epatico degli animali dei gruppi III e IV rispetto a un gruppo I rispettivamente del 17 e del 33 percento (Tabella 3). L'attivazione della SOD è stata osservata dopo 7 giorni di trattamento con Cr(VI) nel tessuto renale di ratto del gruppo III (21%), ma 14 giorni di azione con Cr(VI) hanno causato la soppressione dell'attività enzimatica della SOD nei reni degli animali del gruppo IV (18% ) rispetto al gruppo I.
L'attività del CAT è aumentata dell'11% dopo 7 giorni di esposizione al Cr(VI), ma 14 giorni di somministrazione di K2Cr2O7 sono stati accompagnati da una diminuzione dell'attività del CAT del 13% nel tessuto epatico di ratto del gruppo IV rispetto al gruppo I. Cr(VI) ) la tossicità per 7 giorni ha portato all'attivazione del CAT (del 15%), ma la tossicità del K2Cr2O7 per 14 giorni ha causato una diminuzione dell'attività enzimatica del CAT nel tessuto renale degli animali del gruppo IV rispetto al gruppo I.
Gli autori riportano che la ragione dell'attivazione di SOD (fegato e rene) e CAT (fegato) nei tessuti di ratto del gruppo III può essere la sovraespressione genica antiossidante o meccanismi compensatori del sistema AOS contro lo stress ossidativo indotto da Cr(VI) [51 ,52].
L'analisi dei dati della letteratura indica anche che il Cr(VI) è un forte inibitore dell'attività enzimatica SOD. Forse, questi dati possono spiegare l'inibizione dell'attività SOD dopo actina tossica più lunga di Cr(VI) nei tessuti di ratto del gruppo IV (Cr(VI) per 14 giorni). L'azione tossica del Cr(VI) porta all'inibizione dell'attività enzimatica della SOD e al deterioramento della struttura molecolare della SOD a causa dell'intensificazione dei processi di perossidazione [53]. I metalli pesanti, incluso il Cr(VI), hanno la capacità di inattivare gli enzimi AOS dopo il legame diretto al sito attivo degli enzimi corrispondenti [54]. Dopo che l'inattivazione SOD è stata soppressa, la dismutazione elabora O2- in H2O2. Di conseguenza, la stimolazione indotta da Cr(VI) della formazione di O2- e l'inibizione dei processi di utilizzo di O2- possono essere la causa dell'inattivazione dell'enzima AOS, incluso il CAT [55].
La vitamina E in particolare (gruppo V) e in combinazione con ETS (gruppo VI) ha stimolato l'attività CAT nel tessuto epatico degli animali rispetto al gruppo I rispettivamente del 15 e del 33 percento. C'era anche una probabile attivazione di CAT nei reni di ratto dei gruppi sperimentali V e VI rispetto al gruppo II rispettivamente del 23 e 28 per cento (Tabella 3).
Il pretrattamento complesso con vitamina E ed ETS mediante l'actina successiva di Cr(VI) per 7 giorni (gruppo VII) e 14 giorni (gruppo VIII) ha causato un aumento dell'attività CAT nel tessuto epatico di ratto rispetto al gruppo II del 17 e 9 percento, rispettivamente. L'attivazione del CAT è stata osservata anche nei reni di ratto del gruppo VII (13%) rispetto al gruppo II. Tuttavia, l'attività enzimatica CAT nel tessuto renale degli animali del gruppo VIII è rimasta al livello degli indicatori del gruppo II.
I dati della letteratura riportano che la vitamina E previene l'esaurimento dell'attività enzimatica di SOD, CAT e altri enzimi AOS nei tessuti di topi e ratti in condizioni di stress ossidativo [56,57]. La vitamina E attenua anche lo stress ossidativo indotto da Cr(VI) nei testicoli di ratto a causa del ripristino dell'attività SOD e CAT e della riduzione dell'intensità dei processi LP [58].
I tiosolfonati sono coinvolti nell'attivazione Nrf2-dipendente della stimolazione del gene AOS [26]. La stimolazione di Nrf2 porta, a sua volta, ad una maggiore espressione di geni che codificano per CAT [59]. L'allicina, uno degli analoghi naturali dei tiosolfati, è coinvolta nell'attivazione dei geni responsabili dell'espressione di SOD, CAT e Nrf2 [60]. È possibile che le proprietà antiossidanti di cui sopra della vitamina E, dei tiosolfati e dei loro analoghi naturali possano essere la ragione per ripristinare l'attività enzimatica del CAT sotto l'azione dello stress ossidativo indotto dal Cr(VI).
4. Conclusioni
Si conoscono poco le proprietà antiossidanti dei tiosolfati. Ci sono anche informazioni sufficienti che descrivono le proprietà protettive dei tiosolfati contro la tossicità indotta da metalli pesanti nei tessuti dell'organismo animale. I nostri studi precedenti indicano che il pretrattamento ETS può essere efficace nel correggere la tossicità epatica indotta da Cr(VI) negli organismi di ratto. Assumiamo che ulteriori studi sulle proprietà antiossidanti dell'ETS in combinazione con composti antiossidanti e riducenti cellulari siano importanti per una migliore comprensione del ruolo dei tiosolfati nei meccanismi di prevenzione dello stress ossidativo indotto dai metalli pesanti.
La generalizzazione dei risultati ottenuti indica che l'azione di K2Cr2O7 porta a epatotossicità e nefrotossicità indotta da Cr(VI) a causa dell'intensificazione dei processi LP e dell'aumento della formazione di LHP e TBARS in entrambi i tessuti animali. Il sistema AOS prevede meccanismi compensatori per contrastare lo stress ossidativo indotto da Cr(VI). Questi meccanismi sono accompagnati dall'attivazione di SOD, CAT e GP nel tessuto renale, nonché dalla stimolazione di CAT, GP e accumulo di GSH nel fegato dei ratti dopo 7 giorni di esposizione al Cr(VI). Tuttavia, un'azione più lunga del Cr(VI) per 14 giorni porta all'esaurimento delle risorse del sistema AOS a causa dell'inattivazione degli enzimi antiossidanti (SOD, CAT, GR, GP) e all'esaurimento del pool di GSH nei tessuti epatici e renali degli animali. Il complesso di vitamina E ed ETS mostra un effetto antiossidante contro la tossicità indotta da Cr(VI). Il pretrattamento intragastrico di questo complesso per 14 giorni si manifesta con una diminuzione dei processi LP indotti da Cr(VI) nel fegato e nei reni dei ratti. Il precedente impatto della vitamina E e dell'ETS previene anche l'esaurimento di CAT e GSH nel fegato, oltre a eliminare l'intensità dell'inattivazione di CAT, stabilizza l'attività di GP e GR nel tessuto renale di animali in condizioni di ossidativo indotto da K2Cr2O7- fatica. La vitamina E in particolare e in complesso con ETS sopprime l'elevazione dell'LHP e stimola il CAT in entrambi i tessuti di ratto. L'effetto antiossidante di questi composti porta anche all'accumulo di GSH epatico e all'attivazione renale del GP.
I risultati ottenuti indicano che il pretrattamento con vitamina E ed ETS ha parzialmente stabilizzato il disturbo indotto da Cr(VI) nei meccanismi dell'azione del sistema di difesa antiossidante nei reni di ratto. Inoltre, i risultati del nostro studio possono diventare parte del background per la creazione di metodi efficaci di prevenzione e correzione degli stati antiossidanti e pro-ossidanti nei reni interessati dall'azione dello stress ossidativo indotto da Сr(VI).
1 Dipartimento di Adattamento Biochimico e Ontogenesi degli Animali; Istituto di Biologia Animale della NAAS; Leopoli; Ucraina
2 Dipartimento di Tecnologia dei Composti Biologicamente Attivi; Farmacia e Biotecnologie dell'Università Nazionale Politecnica di Lviv; Ucraina
Riferimenti
1. Sahar, HO; Sherif, MS Effetti migliorativi dell'olio di semi d'uva sulla nefrotossicità indotta dal cromo e sullo stress ossidativo nei ratti. Ricerca veterinaria slovena Zbornik 2020, 57, 123- 131.
2. Husain, N.; Mahmood, R. La taurina attenua il danno cellulare e del DNA indotto da Cr(VI): uno studio in vitro che utilizza eritrociti e linfociti umani.Aminoacidi2020, 52, 35-53.
3. Tian-Guang, Z.; Ya-Li, Z.; Lei, Li.; Dong-Hai, Z. Effetti antagonisti del nano-selenio sul danno epatico dei polli da carne indotto dall'avvelenamento da Cr(VI) nel percorso AMPK. Scienze ambientali e ricerca sull'inquinamento International 2020, 27, 41585-41595.
4. Farag, AI; El-Sherry, ES Epatotossicità indotta dal cromo e potenziale effetto protettivo del selenio nel ratto albino maschio adulto: uno studio istologico, immunoistochimico e molecolare. Med. J. Cairo Univ 2020, 88, 187- 196.
5. Shih-Chang, F.; Jui-Ming, L.; Kuan-I, L.; Feng-Cheng, T.; Kai-Min, F.; Ching-Yao, Y.; Chin-Chuan, S.; Hsin-Hung, C.; Ren-Jun, H.; Ya-Wen, C.Cr(VI) induce l'apoptosi mitocondriale-dipendente mediata da ROS nelle cellule neuronali tramite l'attivazione della via di segnalazione Akt/ERK/AMPK. Tossicologia in vitro 2020, 65, 1- 16.
6. Fedala, A.; Adjroud, O.; Abid-Essefi, S.; Timoumi, R. Effetti protettivi del selenio e dello zinco contro la rottura della tiroide indotta dal dicromato di potassio, lo stress ossidativo e il danno al DNA nei ratti Wistar in gravidanza. Environ Sci Pollut Res Int 2021
7. Lui, X.; Li, P. Inquinamento delle acque superficiali nell'altopiano del Loess della Cina centrale con particolare attenzione al cromo esavalente (Cr6 plus): evento, fonti e rischi per la salute. Esposizione e salute 2020, 12, 1- 17, https://doi.org/10.1007/s12403-020-00344-x.
8. Chen, YQ; Murphy, A.; Sole H.; Costa M. Meccanismi molecolari ed epigenetici della cancerogenesi indotta da Cr(VI). Tossicologia e farmacologia applicata 2019, 377, 1-9,
https://doi.org/10.1016/j.taap.2019.114636.
9. Machado, AB; Caprara, JF; Diehl de Franceschi, I.; Tiglio, R.; Berlese, DB; Feksa, LR Effetti dell'esposizione cronica al cromo esavalente in acqua sui parametri di stress ossidativo nei ratti Wistar. Acta Scientiarum Scienze biologiche 2019, 41, 1- 10.
10. Fatma, M.; Ragda, A.; Mohamed, M. Potenziale epatoprotettivo dell'olio essenziale di Rosmarinus officinalis contro l'ematotossicità indotta da cromo esavalente, cambiamenti biochimici, istologici e immunoistochimici nei ratti maschi. Scienze ambientali e ricerca sull'inquinamento 2021, 28, 17445– 17456.
11. Wang, Y.; Wang, X.; Wang, L.; Cheng, G.; Zhang, M.; Xing, Y.; Zhao, X.; Liu, Y.; Liu, J. Mitofagia indotta da danno alla funzione mitocondriale nel rene di pollo esposto a Cr(VI). Ricerca sugli oligoelementi biologici 2021, 199, 703-711.
12. Zheng, X.; Li, S.; Li, J.; Lv, Y.; Wang, X.; Wu, P.; Yang, Q.; Tang, Y.; Liu, Y.; Zhang, Z. Il cromo esavalente induce l'apoptosi renale e l'autofagia alterando l'equilibrio della dinamica mitocondriale nei ratti. Ecotossicologia e sicurezza ambientale 2020, 204, 1-9.
13. Yang, D.; Yang, Q.; Divertimento.; Li, S.; Han, B.; Liu, Y.; Tang, Y.; Guo, X.; Lv, Z.; Zhang, Z. Disfunzione cardiaca indotta da cromo esavalente attraverso la compromissione della funzione mitocondriale e dell'approvvigionamento energetico mediata da Sesn2-. Chemosfera 2021, 264, 1- 10.
14. Balakrishnan, R.; Satish Kumar, CS; Rani, MU; Srikanth, MK; Boobalan, G.; Reddy, AG Una valutazione del ruolo protettivo del -tocoferolo sull'epatotossicità indotta dai radicali liberi e sulla nefrotossicità dovuta al cromo nei ratti. Giornale indiano di farmacologia 2013, 45, 490-495.
15. Zhang, Y.; Bianco, H.; Maggio.; Xiao, Y.; Xiao, la mitofagia iperattiva indotta da F. Cr(VI) contribuisce alla perdita mitocondriale e alla citotossicità negli epatociti L02. Giornale biochimico 2020, 477, 2607-2619.
16. Saidi, M.; Auacheri, O.; Saka, S.; Teboub, I.; Ailene, L. Effetti protettivi del nefrone della Curcuma sul danno ossidativo e sullo stress ossidativo nel ratto sotto avvelenamento subcronico da cromo. int. J. Biosci 2019, 15, 241-250.
17. Li, J.; Zheng, X.; Mamma, X.; Xu, X.; Du, Y.; Lv, Q.; Li, X.; Wu, Y.; Sole, H.; Yu, L.; Zhang, Z. La melatonina protegge dal danno cardiaco indotto dal cromo (VI) attivando il percorso AMPK/Nrf2. Giornale di
Biochimica inorganica 2019, 197, 1- 10.
18. Scienza diretta.
19. Shati, AA Effetto migliorativo della vitamina E sull'epatotossicità indotta da dicromato di potassio nei ratti. Journal of King Saud University - Science2014, 6, 181- 189.
20. Khalaf, AA; Hassanen, EI; Ibrahim, MA; Tohamy, AF; Aboseada, MA; Hassan, HM; Zaki, AR
L'acido rosmarinico attenua il danno ossidativo epatico e renale indotto dal cromo e il danno al DNA nei ratti. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology 2020, 34, 1- 12.
