Ossido di grafene antiossidante Nanoribbon come un nuovo agente sbiancante inibisce il meccanismo di melanogenesi correlato al fattore di trascrizione associato alla microftalmia

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ASTRATTO:Nelmelaninaprocesso di sintesi, le reazioni ossidative svolgono un ruolo essenziale ed è una buona strategia per inibire la produzione di melanina riducendo lo stress ossidativo. Il fullerene e i suoi derivati, o i complessi, erano considerati potenti scavenger di radicali liberi e abbiamo ulteriormente applicato sp2nanocarbon multistrato per scopriremelaninameccanismi inibitori della sintesi. Nel presente studio, abbiamo utilizzato nuovi nanomateriali, come nanotubi di carbonio a più pareti (MWCNT), MWCNT di tipo corto, nanonastri di ossido di grafene (GONR) e GONR di tipo corto, come agenti antiossidanti per regolaremelaninaproduzione. I risultati hanno mostrato che i GONR avevano capacità antiossidanti migliori nelle piattaforme di analisi dello stress ossidativo intracellulare ed extracellulare rispetto ad altri. Abbiamo proposto che i GONR abbiano gruppi funzionali contenenti ossigeno. Nel test 2′,7′-diclorodiidrofluoresceina diacetato, abbiamo scoperto che GONR potrebbe chelare ioni metallici per scavengere specie di ossigeno attive. Nella visione dell'intuizione molecolare, abbiamo osservato che questi nanomateriali hanno sottoregolato la sintesi di melanina diminuendo le espressioni geniche correlate al fattore di trascrizione associato alla microftalmia e c'erano conseguenze simili nelle espressioni proteiche. Per riassumere, GONRs è un potenziale agente come romanzoantiossidantee materiale cosmetico sbiancante per la pelle.

cistanceinibire la formazione di melanina

1. INTRODUZIONE

La pelle è l'organo che copre la superficie esterna del corpo umano. Poiché l'interfaccia è a contatto con l'ambiente, lo strato cutaneo svolge un ruolo importante nella protezione del corpo dagli agenti patogeni, evitando un'eccessiva perdita di acqua, regolando la temperatura corporea e così via. I melanociti crescono nella membrana basale dell'epidermide cutanea e rappresentano dal 5% al ​​10% del contenuto cellulare. Sono state caratterizzate come "ghiandole" unicellulari aventi dendriti sottili, lunghi, simili a stelle filanti e ramificazioni. I melanociti si muovono attraverso le cellule epidermiche nelle loro immediate vicinanze, creando una costellazione di cellule epidermiche attorno a ciascun melanocita. Ci sono molte cause interne ed esterne dell'invecchiamento della pelle e una di queste è la radiazione ultravioletta (UV) della luce solare.1 Durante l'esposizione ai raggi UV, i livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella pelle aumentano drasticamente, il che è noto come stress ossidativo. Diversi fattori di tossicità ambientale migliorano anche lo stress ossidativo della pelle, come pesticidi, tetracloruro di carbonio, metalli pesanti, ammine aromatiche e particolato 2.5(PM2.5).2 Nel meccanismo biochimico, gli ossidanti intracellulari sono generati dal sistema non enzimatico, trasformandoli in ROS per attivare la via della melanogenesi.

Oltre ai ROS, ci sono molti fattori che influenzano la produzione di melanina, tra cui l'espressione genica, l'infiammazione, i cambiamenti endocrini e l'assorbimento del pigmento.1 Nelle prime fasi della produzione di melanina, la tirosinasi svolge un ruolo nel catalizzare la tirosina in feomelanina ed eumelanina. I meccanismi di produzione di entrambi i pigmenti sono simili, tra cui l'idrossilazione della tirosina da L a 3,4-diidrossi-L-fenilalanina (L-DOPA) e l'ossidazione da L-DOPA a dopachinone. Nella fase successiva, la dopamina viene ossidata dalla proteina correlata alla tirosinasi 1 (TRP-1) e dalla proteina correlata alla tirosinasi 2 (TRP-2) inmelanosoma, che è regolata dal fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF). per formaremelanina.Infine, la melanina viene fatta maturare e precipitata all'interno dello strato corneo.4,5 Questi penetrano nei cheratinociti vicini dello strato basale e proteggono il loro DNA da qualsiasi mutazione o modifica indotta dai raggi UV. Il maturatomelaninaall'interno dei melanosomi viene trasferito ai cheratinociti6-9 e infine porta a una pigmentazione di lunga durata. Lentiggini, lentiggini e macchie marroni/nere causano talvolta problemi sociali negli uomini e nelle donne. Bloccare lo stress ossidativo o sopprimere l'attività della tirosinasi è una strategia per sottoregolare la sindrome dell'iperpigmentazione e dei disturbi dermatologici.Antiossidanticurano le iperpigmentazioni e i danni cellulari causati dai ROS.10,11 Pertanto, i composti antiossidanti sintetizzati hanno molte applicazioni biofunzionali nelle applicazioni per la cura della pelle.

Il fullerene (C60), il nanotubo di carbonio (CNT), il grafene e il nanoribbon di grafene (GNR) sono quattro tipi di nanocarbonio sp2 ampiamente studiati in tutto il mondo.12 Il fullerene e i suoi derivati ​​o complessi sono stati per molto tempo considerati potenti scavenger di radicali liberi. Yodo et al. utilizzato C60 idrosolubile come agente protettivo contro la degenerazione indotta da stress catabolico. Injac et al. ha concluso che C60(OH)24 è forteantiossidantecomposto quando lo stress ossidativo è troppo elevato. Okuda et al. ha suggerito che i complessi C60 possono prevenire il danno cellulare mediato da NO.13,14 Tong et al. hanno mostrato che i complessi C60 potrebbero essere candidati promettenti per il trattamento di malattie legate al cervello causate da livelli aumentati di superossido. In realtà, una società giapponese ha identificato fullereni con una forte attività antiossidante per uso cosmetico nel 2006. Lucente Schultz et al. ha dimostrato che la capacità di scavenging dei radicali dell'ossigeno dei CNT funzionalizzati a parete singola (SWCNT) è quasi 40 volte maggiore di quella del dendritico C60.15-19 Fenoglio et al. ha osservato che i CNT a parete multipla (MWCNT) possiedono una notevole capacità di scavenging dei radicali a contatto con una fonte esterna di radicali idrossilici o superossido.20 I calcoli della teoria del funzionale della densità hanno anche rivelato un modello di SWCNT come scavenger di radicali liberi. Nel 2004, Novoselov et al. hanno dimostrato per la prima volta che il grafene esibiva un forte effetto elettrico ambipolare e potrebbe essere promettente per le applicazioni elettroniche.21 Successivamente, hanno continuato a dimostrare che il grafene ha proprietà elettroniche che sono distintive per un gas 2D di particelle descritto dall'equazione di Dirac. 22,23 Dopo questi due articoli innovativi, è stata data sempre maggiore attenzione alla ricerca basata sul grafene.24-30 Esempio, Qiu et al. nel 2014 ha mostrato che l'ossido di grafene e il grafene a pochi strati mostrano significativiantiossidanteattività e può proteggere varie molecole biomolecolari dall'ossidazione.31Han et al. dimostrato sperimentalmente nel 2007 che il gap energetico dei GNR può essere controllato durante il processo di litografia modificando la larghezza del nastro.32 Tra i quattro nanocarburi, i GNR hanno ricevuto la minore attenzione. A nostra conoscenza, ci sono poche ricerche sulle proprietà antiossidanti dei nanonastri di ossido di grafene (GONR).31,33 Quindi, in questo studio, abbiamo preparato con cura MWCNT, MWCNT brevi, GONR e GONR brevi e miravamo a confrontare sistematicamente le loro proprietà antiossidanti e i risultati correlati .

2. RISULTATI E DISCUSSIONE

2.1. Morfologia di MWCNT e GONR.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm a 2-3 μm. Contemporaneamente, è stato osservato che il trattamento con acido nitrico irruvidisce le superfici lisce dei tubi. Alcune tacche e forme irregolari vengono visualizzate nell'immagine ad alto ingrandimento. Inoltre, utilizzando MWCNT e brevi MWCNT attraverso reazioni a microonde si ottengono rispettivamente GONR e shortGONR. Abbiamo anche illustrato le immagini TEM a basso e alto ingrandimento di GONR e GONR corto. A causa della maggiore decompressione longitudinale e del taglio orizzontale minore, sembra che i GONR fossero più corti dei MWCNT. D'altra parte, le immagini ad alto ingrandimento hanno mostrato diametri maggiori, cioè 0.11-0,18 μm, di GONRs rispetto a quelli di MWCNT, indicando che il processo di decompressione ha avuto successo. Allo stesso modo, i GONR corti hanno mostrato una lunghezza più corta e un diametro maggiore rispetto ai MWCNT corti. Nel compressore d'aria del nostro nuovo processo di decompressione, le strutture a strati sottili dei GONR erano inferiori a quelle ottenute nel primo rapporto per la stessa potenza delle microonde di 250 W mantenendo i MWCNT centrali più spessi.12 Ciò significava che l'eterostruttura MWCNT/GONR a core-shell sarebbe più probabile appaiono invece della struttura del nanonastro completamente decompressa attraverso tutte le potenze delle microonde nel nuovo processo. Per confrontare con il breve GONR nei nostri studi precedenti,34 la maggiore potenza delle microonde generava più tacche sul lato dei nastri e non formava bei bordi lisci. Si noti che abbiamo utilizzato due diversi tipi di griglie Cu nella Figura 1a. Per MWCNT e GONR di lunghezza sufficiente, è stata utilizzata la griglia Gu con una forma lacey stabilizzata con carbonio (prodotto n. 01881-F, Ted Pella, Inc., USA). I fori aperti in una pellicola di carbonio lacey impedivano una sovrapposizione dell'immagine di trasmissione tra i nano carboni e la pellicola di carbonio. Le reti grigio scuro appartengono al film di carbonio lacey. Tuttavia, per il corto MWCNT e il corto GONR era necessaria la griglia Gu con forma stabilizzata con carbonio (prodotto n. 01800-F, Ted Pella, Inc., USA). Ciò era dovuto al fatto che i buchi grossi nella pellicola di carbonio lacey causavano problemi per tenere il corto MWCNT e il corto GONR in modo efficiente. Come illustrato nella Figura 1, il contrasto grigio chiaro sotto i MWCNT corti e i GONR corti è un leggero strato di carbonio. Questo strato di carbonio ha stabilizzato la pellicola di formvar esposta al fascio di elettroni attraverso le sue proprietà di conduzione del calore e dell'elettricità.

2.2. Configurazioni di incollaggio di MWCNT e GONR.

Gli spettri Raman dei quattro nanocarburi sono presentati nella Figura 1b; la banda D di GONR era superiore a quella di MWCNT dopo il processo di decompressione. Ciò è stato attribuito al livello di ossidazione più elevato e a un numero maggiore di strutture marginali di GONR rispetto ai MWCNT. Questo fenomeno è anche simile a quello che abbiamo osservato in 2011.12 A causa dell'alto livello di grafitizzazione, la banda G dei MWCNT aveva il numero più basso di larghezza intera e metà massima. I rapporti ID/IG dei quattro nanocarburi erano 0.076, 0,502, 0,483 e 0,700, rispettivamente. In breve, la lunghezza ridotta e l'ossidazione della superficie aumentavano il livello di difetto e quindi aumentavano i rapporti ID/IG. Il picco D′ è presente in tutti i grafeni difettosi ed è visto come una misura di qualità.35 Come illustrato nella Figura 1b, i picchi D′ nei quattro spettri diventano più prominenti dopo il processo di taglio o decompressione, suggerendo che si tratta di processi distruttivi che introducono molti difetti. La figura 1c, d mostra gli spettri di spettroscopia fotoelettronica a raggi X dei quattro nanocarburi. Apparentemente, il picco D' è il più chiaro per i GONR brevi. Come mostrato nella Figura 1c, il livello di O è aumentato in modo significativo dal 7,6 percento (MWCNT) al 19,9 percento (GONR) a causa della forte capacità di ossidazione di KMnO4 in un ambiente acido. D'altra parte, il livello di O è leggermente aumentato dello 0,8 percento da MWCNT ai MWCNT corti. È importante sottolineare che il livello di O più alto è del 38,3 percento per il GONR corto, il che implica che le estremità dei nanonastri sarebbero più facili da collegare ai gruppi ossigenofunzionali rispetto alle superfici planari sp2. Il numero maggiore di larghezza intera e metà massimo e il passaggio all'elevata energia di legame dei picchi di C 1s dopo il processo di decompressione di entrambi MWCNT e MWCNT brevi sono illustrati nella Figura 1d. Per gli ossidi di grafene, i picchi deconvoluti nell'elevata energia di legame lato potrebbe essere assegnato a legami C−C(CC), C−O,CO e COOH.36 Abbiamo caratterizzato GONR (200W) nel 2013,37 e i risultati erano simili ai risultati di questo studio. Questo studio ha concluso i fenomeni degli spettri Raman, il che significa che più gruppi funzionali contenenti ossigeno sono stati generati durante la trasformazione da tubo a nastro (Figura 2).

2.3. Proprietà antiossidanti di MWCNT e GONR.

2.3.1. Determinazione dell'attività di scavenging dei radicali liberi 1,1-difenil-2-picrylidrazyl.

1,1-Difenil-2-picrylidrazyl (DPPH) l'attività di scavenging dei radicali liberi è unantiossidantepiattaforma applicata per rilevare la capacità antiossidante; i risultati per i quattro nanocarburi sono descritti nella Tabella 2. Nel test DPPH, la vitamina C a una concentrazione di 100 μM è stata utilizzata come controllo positivo. Per testare le attività antiossidanti di MWCNT, MWCNT brevi, GONR e GONR brevi, i dosaggi di 1, 5 e 10 mg/L sono stati incubati nella soluzione di reazione per misurare le proprietà. MWCNT, MWCNT brevi, GONR e GONR brevi avevano capacità inibitorie moderate a 1{{20}} mg/L (19,2 ±0,3, 12,1 ± 0,3, 26,8 ± 0,3 e 30,0 ± 0,4 percento), mentre la vitamina Ciad una condizione simile a 100 μM (93,4 ± 0,1 percento) per la soppressione.

2.3.2. Saggio di attività chelante di ioni.

All'interno della situazione di stress ossidativo, la ferrozina può sviluppare un complesso con Fe2 plus da misurare quantitativamente. In presenza di mediatori chelanti, il complesso si rompe, provocando la riduzione degli ioni ferrosi da un colore rosso scuro del complesso Fe2 plus. Abbiamo usato EDTA come controllo positivo. La tabella 2 mostra che i MWCNT, i MWCNT corti, i GONR e i GONR corti avevano un'attività chelante a 10 mg/L (29,2 ± {{10}}.8, 28,7 ± 0. 7, 69,7 ± 0,6 e 68,9 ± 0,3 percento), mentre il controllo positivo presentava una condizione simile a 100 μM (93,4 ± 0,1 percento).

2.3.3. Misurazione del potere antiossidante ferrico-riducente.

Il test del potenziale di riduzione del ferrico è un test semplice e affidabile utilizzato per quantificare la sintesi del complesso Fe (III) - ferricianuro. In questo saggio, il potere riducente dei quattro nanocarboni che producono il complesso ferroso Fe(III)-TPTZ è stato rilevato da variazioni del colore della soluzione da giallo a verde e blu. La tabella 2 dimostra che i poteri riducenti di MWCNT, MWCNT corto, GONR e GONR corto erano densità ottica (OD) 1,11, 1,13, 1,15 e 1,11 a 10 mg/L.

2.3.4. MWCNT e GONR inibiscono l'accumulo intracellulare di ROS.

Molti rapporti hanno dimostrato che i ROS distruggono l'integrità strutturale delle membrane cellulari, comprese le membrane cellulari e le membrane nucleari, causando danni cellulari e perdita della normale funzione.38-40 Inoltre, i ROS sono anche uno dei fattori importanti per catalizzare la formazione di tirosinasi e la l'inibizione della produzione di ROS è una buona strategia per sottoregolaremelanina synthesis. In this study, we used the 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFDA) staining assay to analyze the intracellular oxidative stress level in MWCNT and GONR treatment cells. Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) induced oxidative stimulations in MWCNT and GONR groups and was used as a negative control.41 When the concentration of PMA was 20 ng/mL, it induced oxidative stress, increasing the value to 38%; after treating GONRs and MWCNTs, the levels of ROS were downregulated to the normal level. The data showed that both materials inhibited oxidative stress levels, and the anti-oxidative effect of GONRs was higher than that of MWCNTs (Figure 3). Table 1 shows a similar consequence list. We contended that there are three reasons for our new findings: first, the order of solubility of these materials was as follows: short GONRs > GONRs >MWCNT corti > MWCNT, il che significa che l'area di contatto dei GONR corti era la più grande, quindi era superiore per ROSscavenging. In secondo luogo, GONR e MWCNT erano sp{0}}strutture di carbonio che potevano distruggere l'elettricità ROS attraverso l'adduzione o il trasferimento di elettroni.42 Abbiamo scoperto che ileffetti antiossidantidelle strutture dei nanoribbon erano migliori di quelle delle strutture dei nanotubi, quindi i nanoribbon facilitano il trasferimento degli elettroni rispetto ai nanotubi. Infine, nella Figura 1b, osserviamo che il sito di carbonio sp{1}} GONR conteneva più gruppi funzionali ossigeno rispetto ai MWCNT, i gruppi di acido carbossilico potrebbero chelare ioni metallici e i gruppi idrossilici potrebbero essere un donatore di H per scavenging ROS e inibire la produzione di melanina.

2.4. Citotossicità di MWCNT e GONR trattati in cellule di fibroblasti cutanei umani.

Per valutare la le proprietà dei GONR sulle cellule Hs68 (Figura 3) e le cellule sono state coltivate a diverse dosi di 1, 5 e 10 ug/mL. Abbiamo esaminato che le vitalità cellulari di MWCNT erano 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9 e 94,1 ± 4,7 percento a concentrazioni di 1, 5 e 10 mg/L, rispettivamente; le vitalità per il breve MWCNT sono state calcolate nello stesso ordine e sono risultate essere 93,9 ± 2,2, 86,4 ± 3,0 e 98,9 ± 2,1 percento. Abbiamo osservato che le cellule B16-F10 sono state incubate ad alte concentrazioni e la sopravvivenza cellulare delle cellule Hs68 era superiore all'80%, suggerendo che il MWCNT e il breve MWCNT non avevano effetti tossici sulle cellule dei fibroblasti cutanei umani. La vitalità cellulare di GONR e GONR breve erano 86,24 ± 2,1, 90,87 ± 3,5, 88,58 ± 2,5, 89,03 ± 3,6, 90,71 ± 2,8 e 90,64 ± 2,5 percento. Viene anche sottolineato nella Figura 4a che GONR e shortGONR non hanno avuto un effetto citotossico distinguibile sulle cellule HS68. In precedenti rapporti, l'uso di nanomateriali non testati per scopi cosmetici poteva essere considerato discutibile,43,44 e di solito era dovuto all'attacco del DNA dopo che le nanoparticelle erano entrate nelle cellule. Dopo il test di citotossicità, abbiamo scoperto che i nostri materiali non causavano tossicità alle normali cellule della pelle. Abbiamo concluso che dopo che i nanomateriali sono entrati nelle cellule, i nanomateriali inibiscono semplicemente la produzione di melanina diminuendo lo stress ossidativo e chelando gli ioni metallici e non danneggiano i mitocondri o il DNA, il che significa che MWCNT e GONR erano sicuri da usare.

2.5. Due tipi di MWCNT e GONR nell'attività della tirosinasi cellulare B16-F10 e nel contenuto di melanina.

Nelmelaninavia di sintesi, la tirosinasi svolge un ruolo critico. La tirosinasi si ossida e forma eumelanina e feomelanina attraverso una serie di reazioni biochimiche. Al fine di determinare se GONR e MWCNT inibiscono le attività della tirosinasi e causano una diminuzione della produzione di melanina, abbiamo analizzato l'attività della tirosinasi nelle cellule B16-F10. Abbiamo scoperto che i MWCNT e i MWCNT brevi inibivano l'attività della tirosinasi di circa il 17,1% e del 23% a 10 mg/L. I GONR e i GONR brevi hanno avuto un effetto migliore sopprimendo l'attività della tirosinasi alle stesse concentrazioni rispetto a un altro GONR. Erano anche in modo dose-dipendente e inibivano il 49,8% e il 44,7% dell'attività della tirosinasi, come mostrato nella Figura 4b.

Melaninaè un pigmento indispensabile nel corpo umano, ma la sovraespressione della melanina provoca spesso una serie di malattie. In studi precedenti, Xiao et al. ha usato un materiale simile, Radical Sponge, una nanoparticella di fullerene, come agente anti-melanina.45 Ci sono stati dei buoni risultati; circa il 20 per cento dimelaninala produzione potrebbe essere inibita. Al fine di migliorarne l'efficienza, abbiamo ulteriormente migliorato il materiale di prova per misurare il tasso di inibizione della melanina e il suo meccanismo molecolare, come mostrato nelle Figure 4c e 5. MWCNT e MWCNT brevi hanno ridotto il contenuto di melanina di 17,6 ± 5,5 e 13,2 ± 0. 2 percento a 10 mg/L e in modo dose-dipendente. I GONR e i GONR brevi hanno fortemente ridotto i valori a 32,0 ± 2,3 e 35,3 ± 3,4 percento a 10 mg/L. I risultati sperimentali suggerivano che tutti e quattro i tipi potessero inibire la sintesi della melanina e che i GONR avessero un effetto più forte. D'altra parte, abbiamo anche osservato che il GONR corto ha una migliore efficacia nell'inibire la produzione di melanina. Concludiamo che i GONR corti hanno più gruppi funzionali e possono prevenire efficacemente la tirosinasi catalizzata da ioni metallici, inibendo ulteriormente la produzione di melanina (Figura 2). Nella tabella 1, osserviamo che lo sforzo del tipo corto che chela ioni metallici è maggiore del tipo normale; ciò significa che questi brevi GONR potrebbero essere potenzialmente applicati in campo cosmetico come agenti per la cura della pelle.

2.6. Il meccanismo di MWCNT e GONR ha inibito il contenuto di melanina cellulare B16-F10.

Le cellule rispondono allo stress ossidativo esterno regolando l'espressione proteica. Le cellule B16-F10 migliorano l'espressione genica c-myc e l'AMPK sovraregolato per diminuire i livelli ossidativi,46 e in questo lavoro, MITF è un fattore di trascrizione specifico della tirosinase per regolare la via del segnale di sintesi molecolare della melanina.47-49 Nella Figura 5a, MWCNTs e GONRs downregolare il fattore di trascrizione associato alla microftalmia riducendo lo stress ossidativo e quindi anche i geni a valle TRP-1 e TRP-2 sono stati sottoregolati. Per il livello proteico, è stato trovato un fenomeno simile, per cui MWCNTs e GONRs hanno regolato la via della melanogenesi correlata a MITF e quindi hanno infine ridotto ilmelaninacontenuto (Figura 5b).

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3. MATERIALI E METODI SPERIMENTALI

3.1. Preparazione di MWCNT e GONR.

Il processo rilevante per la produzione di GONR è stato riportato in un articolo precedente.12MWCNT (0.05 g) è stato sospeso in H2SO4/H3PO4 9:1 e trattato con un reattore a microonde (CEM-Discover) con la potenza impostata a 250 W per 2 min. Dopo l'aggiunta di KMnO4 (0,25 g) alle soluzioni, le soluzioni sono state trattate con la stessa potenza delle microonde a 65 gradi per 4 min12. Abbiamo quindi modificato questo processo utilizzando un tempo di microonde del secondo stadio più breve di 8 minuti utilizzando un compressore d'aria. Qui, il compressore d'aria viene utilizzato per controllare la temperatura del reattore a microonde durante il processo. La potenza delle microonde è stata fissata a 250 W nelle prove preliminari.

3.2. Preparazione di Short MWCNT e Short GONR.

Il processo rilevante per la produzione di GONR brevi è stato riportato nel nostro articolo precedente.34 Il tempo di trattamento acido è stato scelto come 8 h. La potenza del microonde è stata impostata a 250 W, che è la stessa di quella per ottenere i GONR.

3.3. DPPH Attività di scavenging radicale.

DPPH è stato usato frequentemente per decidere la capacità di scavenging dei campioni e le proprietà antiossidanti.50 DPPH è un reagente viola che cambia il colore da viola a giallo se i radicali liberi vengono trasferiti all'analita. Alla soluzione sono stati aggiunti campioni antiossidanti positivi con concentrazioni adeguate e i campioni sono stati analizzati a 517 nm per 30 minuti. Abbiamo utilizzato le percentuali del DPPH rimanente oltre ai campioni di test per misurare il numero diantiossidantinecessario per ridurre i precedenti radicali DPPH. Come controllo positivo è stata utilizzata la vitamina C a 100 μM. L'attività di scavenging (percentuale) è stata misurata come

3.4. Attività di chelazione dei metalli.

Lo ione metallico è il fattore che causa l'eccessiva ossidazione dei lipidi e Fe2 plus è uno degli ioni più influenti.50 Diverse concentrazioni di nanobiomateriali (1 μL) sono state caricate in una piastra a pozzetti 96-, che conteneva 2 mM FeCl2·4H2O ( 10 μL), quindi caricato in ferrozina (5 mM, 20 μL). La miscela è stata completamente miscelata con 69 μLmentolo e mantenuta a temperatura ambiente per 10 minuti. Quindi, la soluzione di reazione del campione è stata osservata a 562 nm. L'EDTA è stato utilizzato come controllo positivo a 100 μM e la formula di calcolo dell'attività di chelazione dei metalli era basata sull'eq 1.

3.5. Ridurre il potere.

Il calcolo del potere riducente si basa su uno studio precedente.50 Innanzitutto, 2,5 μL di materiali di grafene sono stati miscelati con tampone PBS (67 mM, pH 6,8) e K3Fe(CN)6 (2,5 μL, 20%) e quindi incubati a 50 gradi per 20 min. Quindi, il 10 percento di acido tricloroacetico (160 μL) è stato miscelato con agenti a 300 g centrifugato per 20 minuti. La lunghezza di assorbimento è stata determinata a 700 nm dopo essere stata miscelata con 25 μL di FeCl3 (2 percento). L'idrossianisolo butilato (BHA) è stato utilizzato a 100 μM.

3.6. Esami di proliferazione cellulare.

La linea cellulare di dermalfibroblasti umani HS68 è stata impiegata per analizzare il rapporto di proliferazione cellulare. L'HS68 è stato incubato nel mezzo dell'Aquila modificato (DMEM) di Dulbecco contenente il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina e streptomicina mescolati.50,51 Dopo essere stato trattato con diverse concentrazioni di campioni, abbiamo applicato MTT per rilevare il rapporto di proliferazione cellulare. 8000 cellule sono state seminate in 96-piastre a pozzetti e trattate con campioni per 24 ore. La soluzione del supernatante è stata rimossa e abbiamo usato la soluzione MTT per la coltura per 2 ore a 37 gradi. Dopo l'incubazione, è stato spostato il mezzo contenente MTT e lo si è sciolto con dimetilsolfossido (DMSO). La soluzione è stata letta a OD 590 nm e la velocità è stata calcolata con l'eq 1.

3.7. Valutazione del contenuto di melanina cellulare.

Abbiamo utilizzato un metodo con piccole modifiche basato sul test precedente.52,53 I pellet cellulari di B16−F10 dal Bioresource Collection and Research Center (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Taiwan) sono stati disciolti in una miscela di 2,0 N NaOH e il 10 percento di DMSO. Il campione è stato successivamente riscaldato per 1 ora a 90 gradi e centrifugato a 10,{11}}g per altri 10 minuti per ottenere il surnatante chiarificato. Ilmelaninail conteggio è stato determinato monitorando la DO del supernatante a 475 nm.

3.8. Attività della tirosinasi cellulare B16-F10.

Per l'attività della tirosinasi cellulare B16-F10, abbiamo fatto riferimento al lavoro precedente con alcune modifiche.50 Le cellule erano colture di 12-piastre a pozzetti a 105 cellule ciascuno. Dopo i trattamenti con campioni, le cellule sono state lisate in Triton X-100/PBS all'1% e tirosina 2 mML (50 μL) per 3 ore. Dopo l'incubazione, abbiamo rimosso il supporto e abbiamo letto l'assorbanza a OD 590 nm. La formula dell'attività della tirosinasi è stata calcolata dall'eq 1.

3.9. Rilevazione di ROS mediante colorazione DCFDA.

Facendo riferimento allo studio precedente,54 1.2 1.105 cellule B16−F10 sono state seminate in6-piastre a pozzetti e trattate con varie concentrazioni di campioni. Le cellule sono state sospese in PBS e quindi caricate con DCFDA (5 μM) in DMEM non fenolico per 30 minuti a 37 gradi. Il citometro a flusso (Guava, Merck, Germania) è stato utilizzato per rilevare il segnale fluorescente di DCFDA. Le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione del DCFDA erano rispettivamente di 488 e 535 nm.

3.10. Reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale.

Abbiamo seguito i metodi di Lin et al. (2018).1 La reazione a catena quantitativa in tempo reale della trascrizione inversa-polimerasi (qRT-PCR) consisteva in un'esclusiva sonda di primer per generare fluorescenza. Ha utilizzato una tecnica di rilevamento della fluorescenza che rileva ogni ciclo utilizzando un 7500 qRT-PCRSystem (Applied Biosystems, USA). Ha rilevato il ciclo in base alla quantità di fluorescenza rilasciata, quindi è stato calcolato il prodotto di ciascun ciclo per il contenuto generato, ottenendo risultati quantitativi in ​​tempo reale. Trizol (Invitrogen, USA) è stato utilizzato per estrarre un RNA completo del tessuto polmonare, secondo la direzione data dal produttore. Successivamente, è stato utilizzato un kit di trascrizione inversa (Takara, Giappone) per generare il DNA. Nella qRT-PCR utilizzando primer, elencati nella Tabella 1, in primo luogo, il campione è stato riscaldato per formare un singolo filamento di DNA; quindi si è verificato un legame del primer per formare un DNA a doppio filamento (dsDNA), dopo di che è stato combinato SYBR Green dsDNA, per il quale è stato utilizzato il kit di reagenti SYBR green plus (Roche,Basel, Swiss), che ha provocato il rilascio di fluorescenza. Il risultante è stato fatto passare attraverso un sistema di rilevamento della fluorescenza. Il rilevamento dei segnali fluorescenti è avvenuto durante la fase di allungamento o ricottura di ciascun ciclo; dopo il rilevamento, il contenuto del campione è stato respinto dalle intensità di fluorescenza rilevate.55 I livelli di espressione dei geni bersaglio sono stati normalizzati a livelli di -tubulina utilizzando il metodo 2−ΔΔCt .

cistanche effetto sbiancante sulla pelle ad azione antiossidante

3.11. Test Western Blot.

Le cellule B16-F10 sono state lisate a 4 gradi durante la notte con un tampone del test di radioimmunoprecipitazione (Thermo Scientific Co., USA), che contiene inibitori della proteasi. Il kit di analisi delle proteine ​​​​dell'acido bicinconinico (BCA, Sigma-Aldrich Corp., USA) è stato utilizzato per quantificare il proteinamount. Le proteine ​​del campione sono state separate su gel di sodiododecil solfato-poliacrilammide al 10% e trasferite su una membrana di apolivinilidene difluoruro (PVDF) (Pall LifeScience, Ann Arbor, MI, USA). La membrana PVDF è stata bloccata con un tampone bloccante (Thermo Scientific) per 1 ora e incubata con l'anticorpo primario specifico per una notte a 4 gradi. Successivamente, la membrana è stata lavata con tampone Tween 20 salino tamponato con Tris due volte e incubata con anticorpi secondari per 1,5 ore. Successivamente, la membrana è stata immersa nei reagenti di rilevamento della chemiluminescenza (Thermo Scientific) e analizzata da un MiniChemi Chemiluminescenceimager (Beijing Sage Creation Science, Cina). Fonti di anticorpi includevano anti-MITF di coniglio, anti-TRP di coniglio-1, anti-TRP di coniglio-2 e -actina (Thermo Scientific).

3.12. Analisi dei materiali.

TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV) è stato utilizzato per osservare la morfologia del nanocarbonio. Lo spettrometro Amicro Raman (PTT, RAMaker) è stato applicato per verificare le modalità di risonanza del nanocarbonio. Sono state inoltre effettuate misure di spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) per la determinazione dell'analisi compositiva.

3.13. Analisi statistica.

Tutti i campioni e gli esperimenti standard sono stati ripetuti almeno tre volte. Abbiamo applicato il test t di Student per confrontare ed esprimere statisticamente la media dei valori tematici ± deviazione standard.

4. CONCLUSIONI

Per riassumere, abbiamo osservato che il breve GONR era potenziale materiale per la produzione di prodotti per la cura della pelle grazie alle sue molteplici proprietà biofunzionali (Figura 6). I risultati hanno mostrato che il nanocarbonio svolgeva un ruolo come antiossidante extracellulare e intracellulare. Nel frattempo, il nanocarbonio ha inibito l'attività della tirosinasi e lamelaninacontenuto e non ha causato gravi lesioni alle cellule del pigmento. Questo lavoro ha stabilito le funzioni anti-melanogenesi di quattro tipi di nanocarbonio; studi futuri saranno esaminati il ​​meccanismo di questi composti su specifiche espressioni geniche e proteiche legate alla maturazione, al trasporto e all'accumulo della melanina.

cistanche bienfaits

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