Applicazioni dell'aptamero nelle neuroscienze Parte 2

Un altro neurotrasmettitore, la serotonina, svolge un ruolo nelle attività di neuromodulazione che influenzano il sonno, l’aggressività, l’appetito e l’attività sessuale. Viene prodotto in diverse parti del corpo, come il cervello, il midollo spinale, le piastrine e l'intestino [81-84].

La serotonina è un neurotrasmettitore che svolge un ruolo importante nella salute fisica e mentale umana. Nel corpo umano, la serotonina regola l’umore, controlla l’appetito e il sonno e promuove sensazioni di piacere fisico e benessere. Tuttavia, anche la serotonina svolge un ruolo importante nell’influenzare la memoria.

La ricerca ha scoperto che la serotonina può promuovere il miglioramento della memoria regolando la segnalazione tra i neuroni. Quando le persone vengono stimolate positivamente, il corpo rilascia serotonina, che aiuta a rafforzare le connessioni tra i neuroni e migliora l’efficienza della memoria. La serotonina può anche rendere le persone più creative, migliorare l’agilità mentale e aiutare le persone a imparare e pensare più velocemente.

Inoltre, la serotonina può aiutare a ridurre i sintomi di ansia e depressione, problemi dell’umore che possono avere un impatto negativo sulla concentrazione e sulla memoria delle persone. Un umore e uno stato mentale felici possono spesso promuovere il riconoscimento e la capacità di apprendimento di cose nuove da parte delle persone.

Per riassumere, la serotonina svolge un ruolo indispensabile nella nostra salute fisica e mentale, nell’apprendimento e nella memoria. Possiamo aumentare il rilascio di serotonina e [migliorare la memoria] modificando le nostre abitudini alimentari, la quantità di esercizio fisico, i metodi di apprendimento, ecc., coltivando una mentalità positiva e sana e sfidando costantemente noi stessi per promuovere continuamente il miglioramento della memoria. Si può vedere che dobbiamo migliorare la memoria, e la Cistanche deserticola può migliorare significativamente la memoria, perché la Cistanche deserticola ha effetti antiossidanti, antinfiammatori e antinvecchiamento, che possono aiutare a ridurre l’ossidazione e le reazioni infiammatorie nel cervello, proteggendo così il cervello. salute del sistema nervoso. Inoltre, Cistanche deserticola può anche promuovere la crescita e la riparazione delle cellule nervose, migliorando così la connettività e la funzione delle reti neurali. Questi effetti possono aiutare a migliorare la memoria, l’apprendimento e la velocità di pensiero e possono anche prevenire lo sviluppo di disfunzioni cognitive e malattie neurodegenerative.

Fai clic su Scopri gli integratori per aumentare la memoria

Gli squilibri dei livelli di serotonina periferica sono stati collegati a diverse condizioni patologiche, tra cui ipertensione, malattie renali e depressione. Pertanto, l’utilizzo della serotonina per prevedere lo stato patologico e per avviare un trattamento adeguato ha importanza clinica.

È stato sviluppato un dosaggio plasmonico per la serotonina con un coniugato aptamero-AuNP per il quale l'aggregazione è alterata in presenza di serotonina. Il cambiamento nell'aggregazione delle particelle può essere misurato come uno spostamento della lunghezza d'onda di picco dell'assorbimento.

Il test ha mostrato una risposta specifica alla serotonina e non ha fornito segnali statisticamente significativi con i suoi metaboliti, 5-acido idrossiindolacetico (5-HIAA), epinefrina o norepinefrina quando ciascuno è stato testato a 1 µM.

Anche il siero bovino fetale, in quanto imitante del siero umano, non ha avviato alcun segnale [85]. Recentemente, sono state sviluppate neurosonde impiantabili con transistor ad effetto di campo (FET) per monitorare i livelli di serotonina nel tessuto cerebrale. Le superfici ultrasottili In2O3 dei FET su scala nanometrica sono state modificate con aptameri e queste neurosonde hanno consentito limiti di rilevamento della serotonina fM in vivo con un biofouling minimo [86].

Con ulteriori sonde neurologiche, saranno possibili registrazioni spaziotemporali dell'attività neurale in modo che le funzioni cerebrali possano essere comprese a un livello molto più profondo. aumento della pressione ed edema polmonare.

È importante quantificare l'adrenalina circolante per osservare questi stati patologici correlati. A questo scopo è stato sviluppato un metodo di rilevazione colorimetrico, basato sull'interazione dell'adrenalina con Au-NP funzionalizzate con aptameri. Il sistema è meno costoso e più specifico di altre tecniche per quantificare l'adrenalina, come la cromatografia liquida e la spettrofotometria.

Inoltre, mediante spettroscopia UV-visibile è stato determinato un limite di rilevamento di 0,9 nM, che è il limite di rilevamento più basso registrato per l'adrenalina utilizzando qualsiasi metodo colorimetrico. Gli analoghi dell'epinefrina, dell'acido 3,4-diidrossifenilacetico (DOPAC), del triptofano, dell'acido ascorbico, della dopamina, della tirosina e dell'acido omovanillico, hanno mostrato una risposta minima o nulla, il che indica un'elevata specificità del sensore apta [87].

Un cambiamento nel livello di un singolo neurotrasmettitore può indicare una qualsiasi delle diverse malattie, il che rende altamente improbabile che si possa ottenere una diagnosi di malattia sulla base della misurazione di un singolo neurotrasmettitore. Pertanto, la capacità della maggior parte degli aptasensori di essere integrati in una piattaforma multiplex si tradurrà in strumenti diagnostici più adatti alle cliniche e con il potenziale per supportare identificazioni di malattie più accurate.

2.3. Rilevazione di biomarcatori
Un biomarcatore è qualsiasi sostanza, struttura o processo nel corpo che determina un risultato o indica la presenza di una malattia specifica. Molti biomarcatori sono sostanze che possono essere misurate nei biofluidi come sangue, saliva e urina.

Il problema principale della caratterizzazione dei biomarcatori per le malattie neurologiche è la barriera emato-encefalica (BBB) ​​attraverso la quale molte molecole, comprese molte proteine, non possono passare. Sebbene le proteine ​​siano i biomarcatori dominanti per alcune malattie, è più probabile che piccoli peptidi, come il neuropeptide Y o frammenti di proteine, passino attraverso la BEE e vengano rilevati nella circolazione.

I metaboliti sono un altro importante gruppo di biomarcatori per i disturbi neurologici. NeoVentures Biotechnology Inc. ha sviluppato un approccio di selezione degli aptameri chiamato FRELEX, che consente la selezione degli aptameri in base alla competizione tra un breve oligonucleotide attaccato a una superficie e il bersaglio. Come per cell-SELEX e altre forme di SELEX a commutazione di struttura, questo protocollo può essere eseguito con un campione contenente una miscela di componenti senza previa conoscenza del bersaglio o dei target per i quali verranno selezionati gli aptameri.

Con queste forme di SELEX, le controselezioni vengono eseguite con particolari sottoinsiemi di componenti per guidare la selezione di aptameri che soddisfano le specificità desiderate. Utilizzando FRELEX, gli aptameri sono stati selezionati rispetto al siero di topi transgenici che sovraesprimevano la proteina tau umana.

Per indirizzare la selezione dell'aptamero verso la tau umana e le conseguenze della sovraespressione di tau, nella controselezione è stato utilizzato il siero di topi wild-type. Il gruppo ha identificato le sequenze di aptameri arricchite utilizzando NGS e ha caratterizzato alcuni aptameri per topi transgenici in stadio avanzato e topi wild-type confrontando le loro abbondanze relative.

Hanno ipotizzato che la differenza nell'abbondanza rifletta la rispettiva concentrazione degli epitopi (aumentata in risposta alla sovraespressione di tau) con cui gli aptameri possono interagire [29].

3. Applicazioni diagnostiche e terapeutiche

Le malattie neurodegenerative (ND) comportano la degenerazione dei neuroni nel cervello che provoca la perdita di strutture e funzioni del sistema nervoso centrale. La ND può essere causata dall’invecchiamento, da fattori genetici e ambientali.

La demenza è una delle malattie neurodegenerative più comuni legate all'età, così come la malattia di Alzheimer (AD). La malattia di Parkinson (MdP) può essere dovuta a mutazioni genetiche e/o tossine ambientali. Altre malattie comuni con collegamenti genetici sono la sclerosi laterale amiotrofica (SLA), la sclerosi multipla (SM), la malattia di Huntington (HD) e le malattie da prioni.

Sfortunatamente, per queste malattie non sono disponibili né cure efficaci né strategie di diagnosi precoce. Come gli anticorpi ampiamente utilizzati, gli aptameri sono diventati agenti interessanti da applicare allo sviluppo di nuovi biosensori per la diagnosi precoce delle ND e la cura di queste malattie [88].

3.1. Morbo di Alzheimer

Essendo un disturbo cerebrale progressivo legato all'età che provoca carenze mentali, l'AD è la forma più comune di demenza. La sua patologia è caratterizzata dall'aggregazione dell'amiloide (A) derivata dalla proteina precursore dell'amiloide (APP) e iniziata nella regione cerebrale dell'ippocampo.

Sebbene gli scienziati abbiano ipotizzato che la neurotossicità indotta da A fosse correlata alle placche di A insolubili (AP) e alle fibrille (AF), prove recenti indicano che anche gli oligomeri di A solubili (AO) sono associati all'insorgenza di AD.
Pertanto, l’AO è stato identificato come un biomarcatore interessante per la diagnosi precoce dell’AD, e l’AO e la tau sono considerati bersagli terapeutici significativi per il trattamento dell’AD [89].

3.1.1. Diagnostica AD

Gli aptameri descritti in precedenza contro l'AO avevano basse affinità e specificità, ma studi successivi hanno avuto più successo nell'identificare aptameri che riconoscevano selettivamente le fibrille di una forma 40-residua di polimeri A (A 40) ma non A 40 [90].

Tuttavia, gli aptameri mancavano di elevata specificità per le fibrille A 40 rispetto alle fibrille di numerose altre proteine ​​amiloidogeniche testate. È stato anche dimostrato che un aptamero di DNA selezionato per interagire con l'oligomero -sinucleina (-syn) con affinità 68-nM lega AO con affinità 25-nM [91]. Nel 2019, utilizzando gli stessi aptameri ottenuti da Tsukakoshi et al., è stato sviluppato un aptasensore elettrochimico privo di etichetta per un riconoscimento più specifico dell'AO [92].

L'aptamero si autoassembla sugli elettrodi a barra d'oro tramite l'interazione del tiolo (-S) e il sistema ha un limite di rilevamento di 30 ppm, determinato dall'EIS. Questo è stato il primo aptasensore utilizzato con successo per monitorare l'aggregazione della proteina A basata sull'EIS, cosa possibile grazie all'elevata selettività dell'aptamero tra le specie A. Con una facile fabbricazione e una rigenerazione efficace, questo aptasensore potrebbe essere uno strumento diagnostico promettente per la diagnosi precoce dell'AD e per dimostrare l'accumulo di proteina A [92].

Un aptasensore per rilevare gli oligomeri A è stato sviluppato utilizzando l'aptamero -syn DNA [91] in complesso con blu di metilene (MB) e attaccato ad anodicalumina nanoporosa. L'elevato coefficiente di assorbimento di MB per la luce bianca ha comportato una bassa intensità di luce bianca riflessa.

In presenza di oligomeri A, il complesso aptamero/MB si dissociava e l’aumento della luce riflessa veniva rilevato mediante spettroscopia di riflettanza interferometrica (IRS) [93]. L'aptasensore aveva un limite di rilevamento di 20:00 e una buona risposta agli oligomeri A, nell'intervallo di concentrazione da 0,5 a 50 nM. I grovigli neurofibrillari (NFT) sono segni patologici dell'AD.

La formazione di NFT ha inizio nell'ippocampo e l'entità della formazione di NFT è associata alla gravità della demenza nell'AD. L'iperfosforilazione della proteina tau associata ai microtubuli promuove la sua capacità di reclutare e organizzare la tau normale in filamenti, che diventano NFT. Pertanto, l’iperfosforilazione della tau viene proposta come una delle cause principali dell’AD.

Oltre ai suoi normali ruoli nel promuovere l'assemblaggio dei microtubuli e nella stabilizzazione dei microtubuli assemblati, è stato osservato mediante elettroforesi capillare (CE) di non equilibrio che tau si lega a tre oligonucleotidi ssDNA selezionati casualmente, uno dei quali, ssDNA1, si lega a tau381 con elevata affinità (Kd {{ 3}} nM) [94].

È stato sviluppato un test aptamero/sandwich anticorpale utilizzando ssDNA1 per rilevare le concentrazioni femtomolari della proteina tau nel plasma umano mediante risonanza plasmonica superficiale (SPR) [95].

In un altro studio, gli aptameri del DNA sono stati selezionati rispetto all'intera proteina tau di 441 aminoacidi (tau441) mediante una tecnica di selezione rapida basata sul partizionamento dell'elettroforesi capillare con tre cicli di selezione completati in un solo giorno. Cinque aptameri scelti dai risultati del sequenziamento ad alto rendimento sono stati valutati da SPR per la loro capacità di riconoscimento della tau.

Il potenziale analitico dell'aptamero con maggiore affinità è stato dimostrato mediante un test di anisotropia con fluorescenza in fase omogenea. Questo aptamero ad alta affinità legava la proteina tau441 e le isoforme più corte, tau352, tau381 e tau383 con limiti di rilevamento di 28 nM, 6,3 nM, 3,2 nM e 22 nM, rispettivamente, in questo test [96].

3.1.2. Terapie d.C

Come una delle potenziali terapie, sono stati selezionati gli aptameri dell'RNA per inibire l'aggregazione dell'A40. Durante la selezione, un oligomero A è stato coniugato a nanoparticelle d'oro (A -AuNP) e due aptameri sono stati identificati come candidati aptameri dopo SELEX.

I ragazzi del 10-20 nM. Questi aptameri hanno inibito la formazione di placche e fibrille A, come rivelato dalla microscopia elettronica a trasmissione e da un test di immunoassorbimento enzimatico A40 (ELISA) [97].

Il peptide esca (DP) dell'alcol deidrogenasi (ABAD), che interagisce con A, antagonizza la citotossicità del peptide A. La sequenza ABAD-DP è stata inserita tra due tioli che formano un legame disolfuro nella tioredossina (TRX) per creare l'aptamero del peptide TRX1-ABAD-DP-TRX2. La sua espressione stabile nelle cellule NIH 3T3 utilizzando virus adeno-associati è stata verificata con colorazione immunofluorescente.

L'aptamero espresso potrebbe legare il peptide A e migliorare la vitalità cellulare. Questa indagine ha confermato l'efficace inibizione dell'effetto citotossico del peptide A da parte degli aptameri peptidici [98]. Le proteine ​​tau normalmente si associano e stabilizzano i microtubuli, ma la loro iperfosforilazione può provocare aggregati proteici chiamati "tauopatia", che sono tossici.

L'aptamero del DNA Tau-1, che è stato selezionato contro il tau441 umano, inibisce l'oligomerizzazione di Tau1 in vitro [99]. Questa inibizione è stata convalidata anche in studi su colture cellulari utilizzando cellule HEK293 [100]. La beta-secretasi (BACE1) ha un ruolo nella produzione di A e l'inibizione dell'espressione di BACE1 è letale nei topi. Il trattamento per l’AD potrebbe comportare la modulazione di BACE1.

Tuttavia, il suo ampio sito attivo rende BACE1 un bersaglio impegnativo per gli inibitori di piccole molecole. Per aggirare questo problema, gli aptameri degli acidi nucleici potrebbero essere nuovi strumenti per inibire l’attività di BACE1. Questo enzima ha una coda citoplasmatica, B1-CT, che funge da sito di aggancio per proteine ​​come la chaperone di rame per la superossido dismutasi-1 (CCS) e la proteina legante il fattore di ribosilazione dell'ADP (GGA1).

Il ruolo fisiologico della B1-CT è in gran parte sconosciuto. L'aptamero di RNA che mirava al B1-CT si legava alla metà prossimale della membrana del terminale C di BACE1, impedendo il reclutamento di CCS, consentendo il legame di GGA1 a BACE1 e regolando il trasporto di BACE1 agli endosomi di riciclo [101].

Per colpire specificamente BACE1, gli aptameri del DNA, BI1 e BI2, sono stati generati contro BACE1, che ha inibito BACE1 ma né l’alfa né la gamma-secretasi. Utilizzando una linea cellulare HEK293 trasfettata stabilmente, hanno espresso il precursore della proteina amiloide (APP) e, utilizzando un test FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfer) in vitro, hanno dimostrato che il livello A era ridotto e che il deficit cellulare veniva risolto in una linea cellulare neuronale primaria in coltura [102]. L'efficienza dell'aptamero è stata ulteriormente migliorata mediante l'aggiunta di colesteriltetraetilenglicole (TEG).

3.2. Morbo di Parkinson

La malattia di Parkinson (MdP) è la seconda malattia neurodegenerativa più comune e colpisce circa sette milioni di persone in tutto il mondo. Pur essendo una malattia progressiva caratterizzata da caratteristiche motorie e non motorie, ha un impatto clinico significativo sui pazienti a causa della perdita di mobilità e controllo muscolare.

La perdita dei neuroni dopaminergici striatali e la perdita neuronale nelle aree non dopaminergiche caratterizzano la malattia di Parkinson. La perdita di neuroni è generalmente associata alla caratteristica formazione dei corpi di Lewy. Pertanto, la presenza di corpi di Lewy contenenti oligomeri -syn nel cervello è considerata un possibile bersaglio terapeutico e diagnostico per la malattia di Parkinson.

3.2.1. Diagnostica della DP

Il primo aptamero, "M5-15", selezionato contro -syn mancava di specificità per gli oligomeri e poteva anche legarsi ai monomeri -syn [103]. È stato dimostrato che gli aptameri del DNA, poi selezionati, interagiscono con gli oligomeri -syn e non con i monomeri -syn, ma si legano agli oligomeri A 1-40.

I ricercatori hanno anche esplorato la specificità dell'aptamero per gli oligomeri -syn rispetto ad altre proteine ​​con strutture prevalentemente a fogli, come la struttura dell'elica a fogli della pirrolochinolina chinina glucosio deidrogenasi (PQQH), e hanno dimostrato che l'aptamero non legava PQQH [91]. è stato segnalato che un numero elevato di aptasensori è in grado di quantificare i -sinoligomeri.

Un aptasensore colorimetrico, che impiega un aptamero di DNA contro il -sinoligomero, è stato adsorbito su nanoparticelle d'oro (AuNP), che hanno impedito l'aggregazione delle nanoparticelle indotta dal sale. Il suo legame con l'oligomero -syn impedisce l'assorbimento dell'aptamero sulla superficie degli AuNP, il che consente l'attivazione dell'aggregazione degli AuNP in elevate concentrazioni saline e si traduce in un cambiamento di colore.

Questo sistema è stato segnalato con un LoD di 10 nM. Tuttavia, il siero (anche al 2%) ha contribuito ad assorbire i composti nell'intervallo di cambiamento di colore nel test e ha interferito con l'aggregazione dipendente dal sale delle aptameri-Au-NP.

Gli aptasensori che utilizzano EIS e SPR erano più sensibili, con LoD di 1 pM e 8 pM, rispettivamente [104]. Un aptasensore EIS è stato trovato altamente specifico per gli oligomeri rispetto ai monomeri e non influenzato dalla presenza di siero [104]. Un progetto elaborato per un aptasensore elettrochimico per rilevare l'oligomero -syn prevedeva un ibrido formato dalla sequenza complementare di un aptamero oligomero -syn collegato a una superficie d'oro attraverso un legame tiolico e includeva deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) e dTTP per estendere le 30 estremità dell'aptamero e la sua complementare con un polipo aggiuntivo.

L'ssDNA esteso si lega al blu di metilene e promuove la sua associazione con la superficie dell'oro, creando così un segnale elettrochimico. Inoltre, il sistema conteneva l'esonucleasi I (Exo I), specifica per ssDNA. Quando l'aptamero è stato rimosso dal complesso binario con il suo complemento mediante il suo legame con l'oligomero -syn, i filamenti complementari sono stati digeriti da Exo I, prevenendo l'accumulo di blu di metilene sulla superficie dell'oro e diminuendo così il segnale elettrochimico.

Il limite di rilevamento era 22:00 (S/N=3) e il recupero del segnale in presenza di concentrazioni di siero al 10% e inferiori era molto accettabile tra il 95,3 e il 107% [105]. Tuttavia, la sua complessità e l'incorporazione di enzimi rendono questo sistema meno probabile che sia stabile per la conservazione e riproducibile sul campo. Una combinazione di elettroforesi capillare-spettrometria di massa (CE-MS) con estrazione in fase solida (SPE) per preconcentrare il target con una microcartuccia modificata con aptamero in un grande volume di campioni iniettati ha ridotto il limite di rilevamento di 100-volte rispetto ai sistemi CE-MS.

In questo nuovo sistema, il campione viene pulito e il volume viene ridotto al minimo per un'analisi migliorata mediante l'uso di una micro cartuccia che trattiene selettivamente il bersaglio. Un adsorbente di affinità aptamero (AA) nella cartuccia si è rivelato un'alternativa superiore a un anticorpo L'assorbente a base di immunoaffinità (IA) poiché gli elettroliti di fondo necessari per risciacquare il sistema denaturano anche gli anticorpi.

Lo sviluppo di un AA-SPE-CE-MS è stato ottenuto modificando la microcartuccia con l'aptamero M5-15 DNA. Il sistema ha dimostrato un LoD di 2,8 nM e un intervallo di rilevamento lineare compreso tra 7 e 140 nM di -syn nel campione di sangue.

Inoltre, l'identificazione delle proteoforme -syn libere e N-acetilate è stata possibile grazie al rilevamento della massa altamente accurato e al potere risolutivo del sistema MS. Infine, la microcartuccia è risultata stabile anche con BGE acido e potrebbe essere utilizzata per circa 20 analisi con una bassa probabilità di quantificazione errata del target [106].

For more information:1950477648nn@gmail.com