Le saune sono benefiche o dannose per la malattia del rene policistico autosomico dominante? Esame con il modello del mouse Ⅰ

Sfondo astratto:Proteine ​​da shock termico (Hsps), la cui espressione è indotta daTrattamenti termali, funzione nella protezione dei renidisopprimendo l’apoptosiEmantenimento della vitalità tubulare renale. Inoltre, recentemente, è stato indicato che l'espressione delle Hsps può essere un bersaglio terapeutico per la malattia renale policistica autosomica dominante (ADPKD). Abbiamo indagato ileffetto della terapia con sauna seccasu topi modello ADPKD.

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Metodi e risultati:I topi (topi maschi DBA/2FG pagati) sono stati classificati in tre gruppi: controlli, TS: topi pagati sottoposti a sauna prolungata con somministrazione di acqua contenente il 4% di saccarosio, SW: topi paganti a cui è stata somministrata acqua contenente il 4% di saccarosio. Il gruppo TS è stato sottoposto a sessioni di sauna due volte a settimana per quattro settimane. Il gruppo TS ha raggiunto ed è stato mantenuto a una temperatura rettale di circa 39,0 gradi fino a quando non è stato accuratamente rimosso dal dispositivo a raggi infrarossi lontani. Dopo 4 settimane di trattamento in sauna, i livelli di creatinina e di azoto ureico nel sangue (BUN) sono stati determinati mediante un metodo enzimatico. La proteina da shock termico (HSP) o le proteine ​​correlate alla crescita cellulare e alle dimensioni sono state analizzate mediante western blotting. Il gruppo TS ha mostrato livelli di creatinina e BUN leggermente più alti rispetto ai gruppi di controllo e SW, tuttavia le differenze non erano significative. Tuttavia, l’ingrossamento delle cisti nel gruppo TS si è ridotto significativamente rispetto a quello del gruppo di controllo. L'espressione di HSP90 era leggermente diminuita nei gruppi TS e SW rispetto al gruppo di controllo (p < 0.01 o p < 0,001, rispetto al gruppo di controllo), così come l'espressione di Erk , che è collegato allo sviluppo e alla proliferazione delle cisti (p < 0,05, TS rispetto al controllo). L'espressione di Hsp27 e il livello di fosforilazione nel gruppo SW erano paragonabili a quelli del gruppo di controllo. Tuttavia, il gruppo TS aveva livelli aumentati di Hsp27 e fosforilazione (NS). L'espressione della pro-caspasi-3 nel gruppo TS era leggermente inferiore a quella del gruppo di controllo. Tuttavia, l'attività della caspasi-3 in tutti i gruppi non ha mostrato differenze.

Conclusione:I risultati di questo studio hanno indicato che 4 settimane di trattamento con sauna potrebbero causare una disidratazione transitoria e una disfunzione renale correlata e portare al rischio di stimolare la crescita delle cisti mediante una maggiore espressione di Hsp27. Inoltre, abbiamo concluso che la prevenzione della disidratazione e della crescita delle cisti potrebbe essere soppressa assumendo una quantità adeguata di acqua direttamente dopo il trattamento in sauna.

I. Introduzione

Malattia del rene policistico autosomico dominante(ADPKD) è una malattia genetica caratterizzata dalla crescita di numerose cisti in entrambi i reni. L'ADPKD è causata prevalentemente da mutazioni nei geni della malattia del rene policistico 1 (PKD1) e PKD2, che codificano rispettivamente per la policistina 1 (PC1) e PC2. Nel corso decennale della malattia, i pazienti sviluppano grandi cisti renali piene di liquido che compromettono la funzionalità renale. Attualmente, il numero di pazienti affetti da ADPKD in Giappone è stimato a 31,000, pari a circa il 3-5% di tutti i pazienti in dialisi). Circa il 50% dei pazienti con ADPKD sviluppa una malattia renale allo stadio terminale entro i 602 anni di età). Tolvaptan, un antagonista del recettore 2 (V2) della vasopressina, è stato approvato come primo agente terapeutico per l'ADPKD e il suo uso clinico è iniziato nel maggio 2014 in Giappone. Sebbene si tratti di un farmaco efficace nel ridurre il tasso di crescita delle cisti, attualmente non esiste una cura per l’ADPKD e non è possibile arrestare la formazione di cisti nei reni.

La terapia termale, compresa la balneoterapia (BT) e la terapia termale (ST), è stata spesso utilizzata a livello globale come fisioterapia o terapia alternativa. In ambito clinico, l’obiettivo principale della terapia termica è ottenere risultati di trattamento efficaci senza danneggiare i tessuti normali. Una recente revisione sistematica ha dimostrato che la BT e la ST forniscono un significativo sollievo dal dolore e un miglioramento della qualità della vita nelle malattie croniche del sistema muscolo-scheletrico o del tessuto connettivo. La stimolazione termica induce proteine ​​da shock termico (Hsps) che sono essenziali per la sopravvivenza cellulare attraverso la loro funzione di chaperon proteici. Il ruolo delle Hsps nella salute e nelle malattie renali è variabile. L'induzione delle Hsps può essere benefica o dannosa per il rene, a seconda delle Hsps specifiche, del tipo di cellula e del contesto). Nel tessuto renale, le Hsps rappresentano una parte importante del sistema di difesa intracellulare, che viene attivato da diversi tipi di stress cellulare. Le varie Hsps all'interno della cellula stabilizzano le strutture cellulari e aumentano la resistenza cellulare all'apoptosi e alla necrosi6), 7). Negli ultimi anni è stato riportato che le Hsps svolgono un ruolo dannoso nell'ADPKD e pertanto costituiscono bersagli terapeutici8), 9). Pertanto, abbiamo mirato a studiare l'effetto delle saune su animali modello ADPKD, quando viene ripetuto il carico di calore che aumenta la temperatura rettale di circa 2 gradi e la mantiene per circa 30 minuti. II Materiali e metodi 1. Topo modello di malattia renale policistica autosomica dominante (ADPKD). Tutte le procedure sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio approvate dalla Kumamoto Health Science University (N. 18-07) . Topi maschi DBA/2FG-pcy (pcy)10), 11) (8 settimane, n=12) (Kyudo, Kumamoto, Giappone) con peso corporeo iniziale di 20,9±0,7 g sono stati usati come topi modello ADPKD in questo studio sperimentare. Topi DBA maschi (8 settimane, n=3) sono stati utilizzati come riferimento per il modello murino ADPKD. La Figura 1 mostra l'aspetto e il rene asportato come esempi tipici di topi pcy (Fig. 1A, B). Tutti gli animali sono stati alloggiati in condizioni di umidità e temperatura controllate con un ciclo luce/buio di 12:12-h e hanno avuto libero accesso a cibo standard per topi e acqua del rubinetto.

Nove topi pcy (di 8 settimane) sono stati divisi casualmente nei seguenti tre gruppi: gruppo di controllo: topi pcy come controllo (n=3), gruppo TS: topi pcy esposti a stimolazione termica sistemica ripetuta (n {{3} }); e gruppo SW: topi pcy a cui è stata fornita acqua contenente il 4% di saccarosio (n=3). Ai topi del gruppo TS è stata fornita acqua contenente il 4% di saccarosio durante la notte, dopo la stimolazione termica sistemica per prevenire la disidratazione. In uno studio precedente, avevamo scoperto che la perdita di peso corporeo era di circa il 3－4% dopo la stimolazione termica sistemica12). Quando ai topi pcy è stata somministrata acqua con saccarosio al 4%, la quantità di acqua consumata è aumentata significativamente da 5,6 ± 0,6 ml a 7,4 ± 0,7 ml (p < 0,001 , Figura 1C). L'assunzione di acqua saccarosiata durante la notte al 4% corrispondeva effettivamente a un'elevata assunzione di liquidi equivalente al 14 ± 7% del peso corporeo. Il gruppo SW ha consumato acqua durante la notte alla stessa frequenza del gruppo TS.

Fig. 1 A: mouse DBA (Lt) e mouse 2FG-pcy (Rt). B: Rene di DBA (Lt) o 2FG-pcy (Rt), barra della scala=1 cm. C: Quantità di acqua assunta o di acqua saccarosiata al 4% durante la notte dopo la sauna ai topi pcy di 8 settimane. I dati sono mostrati come media ± DS. n=3. ＊＊＊ p < 0.001 (L'analisi statistica ha utilizzato il test T per dati appaiati).

2. Stimolazione termica sistemica (sauna)

L'intensità del calore della sauna è stata fissata facendo riferimento ad uno studio precedente13). Tuttavia, la temperatura rettale di alcuni topi pcy superava i 42 gradi a causa del loro piccolo volume corporeo rispetto a quelli dei topi DBA normali e dei topi 129X1/SvJ. Pertanto, è stato tentato di aumentare la temperatura rettale di 1 grado, ma a causa della limitazione del controllo del sistema di sauna secca a raggi infrarossi lontani (fornito dall'Università di Kagoshima), la temperatura rettale è stata impostata per aumentare a circa 39 gradi. Non sono stati riscontrati rapporti sulla frequenza delle saune per l'ADPKD; pertanto è stata adottata la frequenza minima effettiva della sauna (due volte a settimana) stabilita in uno studio sulla relazione tra il bagno in sauna e le malattie cardiovascolari e altre cause di mortalità di Laukkanen et al.14). Nello specifico, i topi hanno ricevuto un trattamento con sauna a 43 gradi per dieci minuti e poi a 37 gradi per 35 minuti per elevare la temperatura rettale da 37,1 ± 0,1 grado a 39,3 ± 0,3 gradi utilizzando il sistema di sauna secca a raggi infrarossi lontani. La temperatura rettale dei topi è stata mantenuta a circa 39,0 gradi, finché non sono stati estratti dal dispositivo per la sauna. Il gruppo TS è stato esposto alla sauna per quattro settimane, due volte a settimana.

3. Procedura analitica

I dati fisiologici sono stati ottenuti da tutti i topi alla fine del periodo di studio di quattro settimane. Campioni di urina delle 24 ore sono stati raccolti in gabbie metaboliche ed è stata determinata l'assunzione di liquidi. Sono stati raccolti campioni di sangue dalla vena cava inferiore e i livelli di creatinina plasmatica e di azoto ureico nel sangue (BUN) sono stati misurati utilizzando un analizzatore automatico biochimico Hitachi 7180 (Hitachi High-Technologies Corporation, Tokyo, Giappone), con Aqua-auto Kainos CRE -II kit di test o kit di test UN-II (Kainos, Tokyo, Giappone) utilizzando il metodo enzimatico.

4. Studi istologici

I reni sono stati fissati con una soluzione tampone di paraformaldeide fosfato al 4% e incorporati in paraffina. I campioni di rene sono stati sezionati a intervalli di 2-μm e colorati con ematossilina ed eosina (H&E), e le cisti dei tubuli sono state quantificate su 2 sezioni/topo (rene destro) utilizzando ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, STATI UNITI D'AMERICA). Le aree con lacerazioni e bolle dei tessuti identificate con un ingrandimento maggiore (× 40) sono state escluse dall'analisi, come riportato in precedenza15).

5. Westernblotting

L'elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE) e il blotting sono stati eseguiti utilizzando procedure standard. Aliquote contenenti 15 µg di proteine ​​sono state sottoposte a SDS-PAGE. Sono stati utilizzati anticorpi prodotti contro le seguenti proteine: Hsp27 (1:1,000, sc-9012, Santa Cruz Biotechnology), fosfo-Hsp27 (1:1,000, #2401S, Tecnologia di segnalazione cellulare), total-Akt (1:1,000, #9272, Tecnologia di segnalazione cellulare), fosfo-Akt (1:1,000, #9275, Tecnologia di segnalazione cellulare), Erk1 /2 (1:1,000, #9102, Tecnologia di segnalazione cellulare), fosfo-Erk1/2 (1:1,000, #9101, Tecnologia di segnalazione cellulare), mTOR (1:1 ,000, #2972, Cell Signaling Technology), fosfo-mTOR (1:1,000, #2971, Cell Signaling Technology), caspasi 3 (1:500, ab4051, Abcam, Cambridge, UK), caspasi scissa-3 (1:1,000, #9661, Cell Signaling Technology) e -actina (1:1,000, sc-130656, Biotecnologia di Santa Cruz). Le macchie sono state rilevate utilizzando il sistema di rilevamento western blotting ECL Prime (GE Healthcare, Regno Unito) secondo le istruzioni del produttore. I dati hanno mostrato una quantificazione relativa contro -actina, che è stata utilizzata come controllo interno.

6. Analisi statistica

Per l'analisi statistica, i dati tra i gruppi TS e SW sono stati confrontati utilizzando il test U di Mann-Whitney. I gruppi sono stati confrontati utilizzando un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dal test di Tukey per identificare le differenze. Le differenze sono state considerate statisticamente significative con p <0,05. I dati sono espressi come media ± deviazione standard (SD) o media ± errore standard della media (SEM). GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) è stato utilizzato per l'analisi statistica.

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