Le vescicole batteriche della membrana esterna inducono uno spostamento trascrizionale nell'Arabidopsis verso l'attivazione del sistema immunitario che porta alla soppressione della crescita del patogeno nella pianta

Astratto

I batteri Gram-negativi formano vescicole sferiche sulla periferia cellulare, che successivamente si dissociano dalla parete cellulare batterica per formare vescicole extracellulari. È stato dimostrato che queste strutture su scala nanometrica, note come vescicole della membrana esterna (OMV), promuovono infezioni e malattie e possono indurre tipiche reazioni immunitarie sia nei mammiferi che nelle piante ospiti. Per comprendere meglio l'ampio cambiamento trascrizionale che le piante subiscono in seguito all'esposizione agli OMV, abbiamo trattato piantine di Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) con OMV purificati dal batterio patogeno vegetale Gram-negativo Xanthomonas campestris pv. campestris e hanno eseguito analisi RNA-seq su OMV e piante trattate in modo simulato a 2, 6 e 24 ore dopo la sfida. Lo spostamento trascrizionale più pronunciato si è verificato nei primi due punti temporali testati, come evidenziato dal numero di geni espressi in modo differenziale e dal cambiamento di piega medio. Gli OMV inducono un importante spostamento trascrizionale verso l'attivazione del sistema immunitario, sovraregolando una moltitudine di percorsi immunitari tra cui una varietà di recettori immunitari. Confrontando la risposta di Arabidopsis agli OMV e agli elicitori purificati, è stato rivelato che gli OMV inducono una serie simile di geni e percorsi come singoli elicitori, tuttavia, sono stati rilevati percorsi attivati ​​dagli OMV e non da altri elicitori. Il pretrattamento delle piante di Arabidopsis con OMV e la successiva infezione con un agente patogeno batterico ha portato a una significativa riduzione della crescita dei patogeni. Le mutazioni nel recettore del fattore di allungamento vegetale (EFR), nel recettore della flagellina (FLS2) o nel corecettore della chinasi 1 associata insensibile ai brassinosteroidi (BAK1), non hanno influenzato in modo significativo l'effetto di priming immunitario degli OMV. Insieme, questi risultati mostrano che gli OMV inducono un ampio cambiamento trascrizionale nell'Arabidopsis che porta alla sovraregolazione di molteplici percorsi immunitari e che questo cambiamento trascrizionale può facilitare la resistenza alle infezioni batteriche.

PAROLE CHIAVE

Arabidopsis thaliana, infezione batterica, vescicole extracellulari, OMV, vescicole della membrana esterna, immunità vegetale, RNA-seq, Xanthomonas campestris pv. campestris

benefici della cistanche per il sistema immunitario degli uomini

1. INTRODUZIONE

Le piante sono costantemente confrontate con microbi dannosi che prosperano sui loro tessuti e ostacolano la normale crescita. Una risposta di difesa efficiente dipende in gran parte dal rilevamento e dall’identificazione rapidi e accurati del microbo invasore. A questo scopo, le piante utilizzano ampi sistemi di sorveglianza per monitorare l’invasione di agenti patogeni (Cook et al., 2015). Si ipotizza che la prima linea del sistema di sorveglianza della pianta, o la prima interfaccia cellulare in cui piante e microbi interagiscono, sia lo spazio intercellulare, l'apoplasto. Lì, il riconoscimento dei microbi invasori è mediato da recettori di riconoscimento di pattern (PRR) legati alla membrana ed esposti a livello extracellulare (Boutrot & Zipfel, 2017; Couto & Zipfel, 2016). I PRR riconoscono determinanti microbici che sono ampiamente presenti e conservati tra molti microbi e sono noti come modelli molecolari associati ai microbi o ai patogeni (MAMP) (Ranf et al., 2016). Poiché i microbi subiscono la mutagenesi a un ritmo elevato, i recettori immunitari utili evoluzionistici sono adattati per rilevare regioni altamente conservate di componenti microbici cruciali che non possono essere facilmente scartati o mutati a causa di un grave costo in termini di fitness. Ad esempio, la flagellina batterica è un elemento cruciale nella fisiologia di molti microbi, inclusi i patogeni, ed è attualmente uno dei MAMP meglio studiati (Felix et al., 1999; Zipfel et al., 2004). La percezione della flagellina, o dell'epitopo sintetico flg22 (costituito da 22 aminoacidi altamente conservati all'estremità N dell'elemento costitutivo del flagello, la flagellina), da parte del recettore immunitario vegetale affine flagellina sensing 2 (FLS2), porta a un importante cambiamento trascrizionale , seguita da un'efficace risposta immunitaria che arresta l'infezione (Chinchilla et al., 2007; Gómez-Gómez & Boller, 2000). Molti MAMP conosciuti sono associati alla parete cellulare del microbo. Ad esempio, la chitina fungina (Fesel & Zuccaro, 2016), il peptidoglicano batterico (PG) (Erbs et al., 2008; Gust et al., 2007), i lipopolisaccaridi batterici (LPS) (Dow et al., 2000; Silipo et al ., 2005), flagellina (Boutrot & Zipfel, 2017; Felix et al., 1999) e altro ancora. Tuttavia, non è del tutto chiaro come questi componenti associati alla parete cellulare interagiscano con i loro recettori immunitari affini nella planta. Se ciò avvenga a causa della morte cellulare e/o della degradazione della parete cellulare o tramite il rilascio attivo di componenti come il flagello, è un argomento che necessita di ulteriori indagini (Bahar, 2020).

Un esempio del rilascio attivo di frammenti della parete cellulare da parte di batteri Gram-negativi è il distacco delle vescicole extracellulari (EV) che fuoriescono e si staccano dalla membrana esterna nell'ambiente circostante (Kulp & Kuehn 2010; Théry et al., 2018 ). Questi veicoli elettrici batterici sono comunemente chiamati vescicole della membrana esterna (OMV) e d'ora in poi aderiremo a questa nomenclatura (Schwechheimer & Kuehn, 2015). Il processo di rilascio dell'OMV avviene continuamente e in varie condizioni ambientali, anche durante la colonizzazione dell'ospite (Gurung et al., 2011; Ionescu et al., 2014; Jin et al., 2011). Oltre alle molecole integrali della membrana esterna come le proteine ​​della membrana esterna (OM), gli LPS e i lipidi, gli OMV incapsulano i fluidi periplasmatici, costituiti da una vasta gamma di molecole come proteine, enzimi che degradano la parete cellulare, polisaccaridi e acidi nucleici (Kuehn & Kesty, 2005). Poiché gli OMV vengono rilasciati durante la colonizzazione dell'ospite e poiché il loro carico è costituito da MAMP, si è tentati di ipotizzare che agiscano come trasportatori di elicitori immunitari fornendo le molecole stimolanti in prossimità dei loro recettori immunitari affini (Bahar, 2020; Katsir & Bahar, 2017). In effetti, è stato dimostrato che gli OMV inducono il sistema immunitario sia dei mammiferi che delle piante quando presentati ai loro ospiti (Bahar et al., 2016; Ellis & Kuehn, 2010; Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). Mentre nelle cellule dei mammiferi sia l'LPS che i componenti proteici degli OMV agiscono come elicitori immunitari (Ellis et al., 2010), nelle piante non è ancora chiaro quali molecole di OMV siano i principali elicitori immunitari.

Oltre a modulare la risposta immunitaria dell'ospite, è stato dimostrato che gli OMV trasportano anche fattori di virulenza e sono coinvolti in una moltitudine di processi. Ciò include la comunicazione cellula-cellula (Deatheragea & Cooksona, 2012; Mashburn & Whiteley, 2005; Raposo & Stahl, 2019), il rilascio di tossine alle cellule bersaglio (Ellis & Kuehn, 2010; Kadurugamuwa & Beveridge, 1996), la formazione di biofilm (Schooling & Beveridge, 2006), l'estinzione dei composti antimicrobici (Manning & Kuehn, 2011), la risposta allo stress (MacDonald & Kuehn, 2013), il trasferimento genico orizzontale (Fulsundar et al., 2014; Velimirov & Ranftler, 2018) e la virulenza (Ellis & Kuehn, 2010; Kunsmann et al., 2015). Mentre la maggior parte di questi esempi provengono da studi su batteri patogeni dei mammiferi, studi recenti con batteri patogeni delle piante supportano anche il fatto che gli OMV promuovono la virulenza batterica e la colonizzazione delle piante. Ionescu et al. (Ionescu et al., 2014) hanno dimostrato che la produzione di OMV da parte del patogeno vegetale Xylella fastidiosa durante la colonizzazione dei vasi xilematici inibisce l'attaccamento batterico agli elementi che conducono l'acqua della pianta (lo xilema), alterando l'equilibrio tra le forme sessili e mobili della pianta. patogeno verso la forma mobile. Si ritiene che questa forma promuova la dispersione cellulare nello xilema, portando a un declino più rapido della pianta (Ionescu et al., 2014). Altri due studi hanno dimostrato che fattori di virulenza come lipasi/esterasi e xilanasi secrete di tipo II e effettori secreti di tipo III vengono secreti in associazione con OMV (Chowdhury & Jagannadham, 2013; Sidhu et al., 2008; Solé et al ., 2015) suggerendo che l'OMV potrebbe avere un ruolo importante nella virulenza batterica. La complessità molecolare degli OMV, insieme alle sue funzioni duplici e forse opposte nell'ospite (indurre l'immunità e promuovere la virulenza), ci spinge a studiare la risposta trascrizionale più ampia delle piante di Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) alla sfida dell'OMV e a verificare se questo cambiamento trascrizionale indurrebbe resistenza o suscettibilità a successive infezioni batteriche.

2. MATERIALI E METODI

2.1 Materiale vegetale e condizioni di crescita

In questo studio sono state utilizzate la linea Col-0 di tipo selvatico di Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) e le seguenti linee mutanti: bak- (Schlesinger et al., 2011) e falls ever (Nekrasov et al., 2009). I semi di Arabidopsis sono stati sterilizzati in superficie e seminati su piastre di agar Murashige e Skoog (MS) come descritto (Bahar et al., 2016). Le piastre sono state mantenute al buio a 4◦C per 2–4 giorni e poi spostate a 22◦C per la germinazione per 5–8 giorni. Piantine germinate di dimensioni simili sono state trasferite in piastre a pozzetti 24- (due piantine per pozzetto) contenenti 1 ml di terreno MS con l'1% (p:v) di saccarosio (Duchefa Biochemie) e coltivate per altri 8-10 giorni a le stesse condizioni prima della sfida con l'elicitore come descritto di seguito. Per i test di priming, i semi della linea Col-0 di Arabidopsis wild type e delle linee mutanti (fall ever and back-) sono stati germinati come descritto sopra e poi trapiantati in vasi 7 × 7 × 6 cm (1 piantina/vaso) contenenti la miscela soil Green #7611 (Evenari, Ashdod, Israele) e coltivato con un fotoperiodo di 9,5 ore a 22–24˚C. Le piante erano

2.2 Purificazione delle vescicole della membrana esterna batterica

Stock di glicerolo di Xanthomonas campestris pv. campestris(Xcc) 33913 sono stati striati su piastre di Nutrient Agar (Difco, NA, Becton, Dickinson e Company) e fatti crescere per 2–5 giorni a 28°C. Sono state raccolte singole colonie e utilizzate per inoculare uno starter di 3-mL YEB (brodo di estratto di lievito) contenente 10 ug/ml di cefalexina idrato (Cp, Sigma-Aldrich). Gli starter sono stati coltivati ​​durante la notte a 28◦C con agitazione a 185–200 giri al minuto e poi utilizzati per inoculare 500 ml di terreno PSB (brodo di peptone saccarosio) con antibiotici (come descritto sopra) in 2-L Flasks con un rapporto di ∼1:1000 (v:v). Le colture sono state coltivate come descritto sopra fino a un OD600 di 0,6–0,8, quindi le cellule batteriche sono state centrifugate e gli OMV sono stati estratti dal surnatante come descritto (Mordukhovich & Bahar, 2017). La preparazione di OMV grezza è stata quindi sottoposta a centrifugazione su gradiente Optiprep per ottenere OMV purificati, come descritto (Bahar et al., 2016; Mordukhovich & Bahar, 2017). Ciascun lotto di OMV è stato purificato da 1,5-L di coltura batterica ed è stato infine risospeso in 1 ml di PBS (pH 7,3). Gli OMV purificati sono stati utilizzati immediatamente o conservati a 4°C fino a 7 giorni prima dell'uso. La distribuzione delle dimensioni degli OMV è stata misurata utilizzando un dispositivo di diffusione dinamica della luce (Zetasizer Nano ZS, Malvern Panalytical, Worcestershire, Regno Unito) e aveva un diametro medio di 121,7 ± 55,43 nm (SD). La concentrazione delle particelle è stata misurata in modo simile ed è fornita nella descrizione di ciascun esperimento di seguito.

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

2.3 Sfida della piantina di Arabidopsis con OMV

Per esaminare la risposta trascrizionale di Arabidopsis alla sfida dell'OMV, sono state utilizzate piantine di Col-0 coltivate in piastre a 24-pozzetti come descritto sopra. Il giorno prima del test OMV, il terreno MS è stato prelevato dalle piastre e sostituito con 250 ul di dH2O sterile, e le piastre sono state lasciate sul banco per tutta la notte. La mattina dopo, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 20 ul di OMV purificati (30 ug per ml corrispondenti a 1,44 × 109 particelle per pozzetto) o dH2O sterile come mock. Le piantine sono state raccolte 2, 6 e 24 ore dopo la sfida, asciugate su carta e congelate con azoto liquido in provette Eppendorf Safe-Lock da 2- ml (Amburgo, Germania). Ad ogni punto temporale, sono stati raccolti quattro pozzetti trattati con OMV e quattro pozzetti trattati in modo simulato, che rappresentano quattro repliche biologiche per ciascun trattamento in ogni punto temporale.

2.4 Purificazione dell'RNA

L'RNA è stato estratto dalle piantine di Arabidopsis utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen) secondo le istruzioni del produttore. L'RNA è stato ulteriormente purificato utilizzando il kit Turbo DNA-free (Ambion, Thermo Fisher Scientific) e il kit di pulizia e concentrazione dell'RNA (Norgen Biotek) secondo le istruzioni del produttore. I campioni di RNA purificati sono stati sottoposti ad analisi di concentrazione e qualità utilizzando una macchina TapeStation 2200 (Agilent Technologies), RNA Screen Tape e RNA Screen

2.5 Costruzione e sequenziamento di librerie di RNA

Per ciascun trattamento e punto temporale, sono stati selezionati per l'analisi due campioni che mostravano la purezza più elevata. Le librerie di mRNA TruSeq (Illumina) con cattura PolyA sono state preparate dai campioni di RNA selezionati presso il Crown Institute of Genomics presso il Weizmann Institute of Science (Rehovot, Israele). Ogni campione è stato etichettato e dai campioni è stato preparato un pool. Questo pool è stato quindi caricato all'interno di due corsie NGS ed eseguito nella macchina di sequenziamento Illumina HiSeq, in modalità di esecuzione ad alto rendimento, lettura singola (SR) 60 (v4).

2.6 Il sequenziamento legge l'elaborazione iniziale

The raw sequence reads were cleaned with Trimmomatic software v 0.36 (Bolger et al., 2014), removing low-quality reads and remaining adapter sequences. The clean reads were mapped to the reference Arabidopsis TAIR10 reference genome (Lamesch et al., 2012) using bowtie2 (Langmead & Salzberg, 2012) and quantification of gene expression was done using RSEM (Li & Dewey 2011). Principal component analysis and sample correlation matrix were calculated with the function cor() and pre-comp (), respectively, of the R base package version 3.6.1. DEGs were determined using the DESeq2 tool (Love et al., 2014). The FDR (false discovery rate) cutoff chosen was FDR < 0.05. The LogFC (Log of the fold change) cutoff for the up-regulated and the downregulated genes, was > 

2.7 Ontologie geniche e descrizioni geniche 

Le ontologie genetiche (GO) sono state recuperate utilizzando le annotazioni GO di TAIR (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/go/index.jsp). Le descrizioni dei geni, secondo i modelli genetici, sono state ottenute utilizzando la ricerca della descrizione dei geni di TAIR (http://www.arabidopsis.org/tools/bulk/genes/). L'arricchimento di GO è stato calcolato utilizzando lo strumento web AgriGO (http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/index.php) utilizzando il locus del genoma di Arabidopsis (TAIR10) come riferimento

2.8 Convalida quantitativa della PCR e dell'RNA-seq

Per convalidare i dati RNA-seq, campioni di RNA di piantine mock e OMV sono stati utilizzati per la sintesi del cDNA, seguiti da PCR quantitativa (qPCR) utilizzando primer gene-specifici (Tabella Supp. S4), come descritto (Bahar et al. , 2016). Complessivamente, sono stati testati 17 GRADI dal set di dati RNA-seq, utilizzando quattro repliche biologiche di RNA di piantine trattate con OMV o finte. L'espressione relativa dei geni testati è stata confrontata con l'espressione dell'ubiquitina, utilizzando una macchina PCR in tempo reale 7500 Fast (Applied Biosystems), come descritto (Bahar et al., 2016).

2.9 Confronto della risposta trascrizionale dell'Arabidopsis ai MAMP e agli OMV 

Il nostro set di dati indotto da OMV è stato confrontato con i trascrittomi disponibili di Arabidopsis sfidati con flg22, (Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OG (Davidsson et al. , 2017) e LPS (Livaja et al., 2008). Per il confronto dei dati, è stato eseguito l'arricchimento dei termini GO e i GO indotti sono stati visualizzati mediante diagrammi di Venn come descritto sopra.

2.10 Esperimenti di priming dell'Arabidopsis

Testare l'effetto priming degli OMV Xcc su Arabidopsis infetto da Pseudomonas syringae pv. pomodoro DC3000 (Pst), abbiamo seguito la procedura descritta da Zipfel et al. (2004). In breve, foglie di piante di Arabidopsis di 6-8 settimane, coltivate come descritto sopra, sono state infiltrate con 50-100 ul di OMV Xcc purificati (30 ug/ml, corrispondenti a 3,6-7,2 × 109 particelle per foglia), 1 μM flg22 o acqua utilizzando una siringa senza ago. Per ciascun trattamento sono state utilizzate 5 foglie/pianta e tre repliche di piante. L'inoculo Pst è stato preparato coltivando il batterio su piastre medie King's B (20 g/L di peptone, 1,5 g/L di MgSO4 x7H2O, 10 ml/L di glicerolo e 15 g/L di agar) a 28°C per 2–3 giorni, e quindi risospendere le colonie con acqua e regolare la concentrazione dell'inoculo a 105 CFU/ml. L'inoculo Pst è stato infiltrato nelle foglie innescate 24 ore dopo l'adescamento, utilizzando una siringa senza ago (in ciascuna foglia sono stati infiltrati circa 100 ul). La crescita batterica è stata determinata a 0 (1 ora dopo l'inoculazione) e 2 giorni dopo l'inoculazione (dpi) raccogliendo e pesando le foglie inoculate, facendole macerare in 1 ml di 10 mM MgCl2 e piastrando 10- volte diluizioni seriali su King's Piastre di agar B. Il numero di CFU su ciascuna piastra è stato determinato 2 giorni dopo e calcolato per g di foglia.

FIGURA 1 Risposta trascrizionale dell'Arabidopsis agli OMV a 2, 6 e 24 giorni dalla sfida. Analisi dei componenti principali (A) e matrice di correlazione del campione (B) della risposta trascrizionale delle piantine di Arabidopsis all'OMV, o simulato, a 2, 6 e 24 ore dopo la sfida

2.11 Saggi di crescita batterica in vitro 

Per valutare l'effetto degli OMV Xcc purificati sulla crescita di Pst in vitro, i Pststarter sono stati coltivati ​​in terreno liquido King's B per 24 ore a 28°C e quindi utilizzati per inoculare tre diverse colture contenenti 12 ml di terreno King's B ciascuna, in {{3 }}provette Falcon ml con un rapporto di 1:100. Le colture batteriche sono state modificate con OMV da 30 ug/ml (1:50 o 1:100, corrispondenti rispettivamente a 1,44 × 109 o 7,2 × 108 particelle per ml), o PBS come controllo, e incubate per 20 ore a 28°C. La crescita batterica è stata misurata utilizzando uno spettrofotometro (Amersham Biosciences) a una densità ottica (OD) di 600 nm in 22 ore.

3. RISULTATI

3.1 L'analisi RNA-seq rivela un ampio insieme di geni di Arabidopsis espressi in modo differenziale in risposta alla sfida dell'OMV

Per studiare il cambiamento trascrizionale nell'Arabidopsis in seguito alla sfida con OMV, abbiamo trattato piantine di Arabidopsis con OMV purificati dal patogeno batterico Xanthomonas campestris pv. campestris 33913 (Xcc) e RNA vegetale raccolto a 2, 6 e 24 ore dopo la sfida (hpc). L'RNA dei campioni trattati con OMV e simulati è stato quindi sequenziato e analizzato come descritto in Materiali e metodi. Le analisi della correlazione principale (Figura 1A) e della matrice di correlazione del campione (Figura 1B) mostrano che le repliche biologiche in ciascun trattamento si raggruppano strettamente insieme, un'indicazione della somiglianza della risposta trascrizionale complessiva tra le repliche biologiche. I campioni trattati con OMV a 2 e 6 hpc si raggruppano insieme, indicando che il trattamento con OMV ha avuto un effetto maggiore sulla risposta trascrizionale rispetto al tempo di campionamento (Figura 1B). D'altra parte, i campioni trattati con OMV si raggruppano insieme al rispettivo trattamento simulato a 24 hpc, indicando che il cambiamento trascrizionale indotto dagli OMV in questo momento era diminuito ed era simile a quello delle piante trattate simulatamente.

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

Ad ogni punto temporale testato, le piantine trattate con OMV sono state confrontate con piantine trattate in modo simulato e sono stati estratti i geni differenzialmente espressi (DEG). In tutti i momenti combinati, è stato riscontrato che un totale di 984 e 175 geni erano significativamente (log fold change > 1 o ← 1, valore p e FDR < 0.05) up- o down-regolati, rispettivamente, in risposta alla sfida OMV (Figura 2A; Tabella Supp. S1). L'espressione genica Log fold-change (LogFC) variava da un massimo di 9,08 (AT1G26410, 6 hpc), che corrisponde a oltre 500-fold change, a -5.73 (AT3G17520, 24 hpc). Il numero più alto di DEG è stato trovato a 2 e 6 hpc, dove sono stati identificati un totale di 647 e 876 DEG, rispettivamente (regolati verso l'alto e verso il basso combinati). A 24 hpc furono trovati 121°. Più del 50% dei geni sovraregolati a 2 e 6 ore dopo la sfida OMV erano condivisi tra loro (Figura 2B). Per esaminare il cambiamento temporale dell'espressione genica, abbiamo estratto tutti i DEG sovraregolati che sono stati trovati in tutti i punti temporali (37 geni) e abbiamo confrontato il loro cambiamento di piega nel tempo (Figura 2C). L'espressione di modifica della piega di questi geni era significativamente diversa tra i diversi punti temporali (ANOVA unidirezionale; F2, 108=8.1633, p=0.0005). Un confronto post hoc utilizzando il test Tukey Kramer HSD ha indicato che il LogFC sia a 2 (M=3.45, SD=1.72) che a 6 hpc (M=3.87, SD=1.98) era significativamente più alto rispetto a 24 hpc (M=2.32, SD=1.31) (p=0.0145 e p=0 .0005, rispettivamente) (Figura 2D). Anche se l'espressione media LogFC a 6 hpc era superiore a quella a 2 hpc, non era statisticamente diversa (p=0.5413). Pertanto, considerando il numero di DEG e il gene LogFC complessivo nei tre punti temporali testati, possiamo concludere che il cambiamento trascrizionale più significativo si è verificato a 2 e 6 ore dopo la sfida con OMV. Per esaminare la validità dei risultati dell'RNA-seq, l'espressione di 17 geni sovraregolati è stata determinata utilizzando la PCR quantitativa (qPCR) con primer specifici. Quattordici dei geni testati mostravano lo stesso schema dell'analisi RNA-seq ed erano significativamente sovraregolati rispetto al mock. Tre dei geni testati avevano un'espressione relativa più elevata ma non erano significativamente diversi dalla simulazione con questo metodo (Figura Supp. S1).

FIGURA 2 Geni di Arabidopsis espressi in modo differenziale in risposta alla sfida con OMV. (A) Un numero totale di geni differenzialmente espressi (DEG) (up o down-regolati, LogFC > 1 o ← 1, valore p e FDR < 0.05) a 2, 6 e 24 ore dopo la sfida. (B) Sovrapposizione tra DEG in diversi punti temporali (sinistra, regolata verso l'alto; destra, regolata verso il basso). (C) I geni up-regolati trovati in tutti e tre i punti temporali sono stati tracciati su un grafico di espressione LogFC, mostrando l'espressione genica nel tempo. (D) Media LogFC di tutti i DEG in diversi momenti. Lettere diverse indicano una differenza statistica a p <0,05 mediante il test HSD di Tukey-Kramer

3.2 L'Arabidopsis risponde agli OMV con uno spostamento trascrizionale verso l'attivazione del sistema immunitario

Per identificare i percorsi dell'Arabidopsis significativamente influenzati dalla sfida dell'OMV, abbiamo utilizzato lo strumento web AgriGO (Du et al., 2010; Tian et al., 2017). Abbiamo identificato 333 e 55 termini di ontologia genetica (GO) significativamente (FDR <0,05) rispettivamente, in tutti i punti temporali combinati in risposta alla sfida dell'OMV. Quasi il 25% dei GO sovraregolati erano correlati alla risposta della pianta allo stimolo (Figura 3A). All'interno della categoria "risposta allo stimolo", i termini GO più dominanti erano associati alla risposta allo stress, allo stimolo biotico, alle sostanze chimiche e allo stimolo endogeno (Figura 3B; Tabella Supp. S2). Lo strumento AgriGO ha inoltre identificato 103 funzioni molecolari significativamente sovraregolate, tra cui "attività della transferasi", attività della chinasi", "attività del fattore di trascrizione", "legame di ioni e ioni metallici", "legame di carboidrati", "legame di proteine", "attività catalitica" , "legame dell'adenil nucleotide", "attività del recettore transmembrana" e ulteriori funzioni di legame (Tabella Supp. S2). La posizione cellulare dei termini significativi era in diversi compartimenti della cellula tra cui il nucleo, il vacuolo e il sistema endomembrana, ma era soprattutto associata alla periferia cellulare e comprendeva "membrana plasmatica", "regione extracellulare", "parete cellulare" e "membrana plasmatica". ontologie 'apoplastiche' (Tabella Supp. S2). I GO significativamente sottoregolati, d'altra parte, includevano i termini "processo metabolico e catabolico delle tossine", "risposta all'acqua e alla privazione dell'acqua", "trasporto e localizzazione dei lipidi" e altri (Tabella Supp. S2). I GO relativi alla risposta allo stimolo biotico non erano arricchiti nei geni sottoregolati. Le funzioni molecolari significativamente sottoregolate includevano molti termini redox come "attività ossidoreduttasi", "legame dell'eme", "legame degli ioni ferro", "legame lipidico", "legame dell'ossigeno" e altre funzioni correlate all'ossigeno (Tabella Supp. S2) . I termini sottoregolati erano localizzati anche nella regione extracellulare. Per determinare a quali termini GO appartengono i DEG con l'espressione più alta, abbiamo filtrato l'elenco originale dei DEG selezionando i geni che avevano un LogFC superiore a 4 o inferiore a -4 (corrispondente a una differenza di 16-volte) . Abbiamo identificato 117 geni che soddisfacevano questi criteri, di cui 115 erano sovraregolati e 2 sottoregolati in tutti i punti temporali combinati. A causa del numero limitato di geni sottoregolati con un LogFC inferiore a -4, non sono stati identificati GO significativamente repressi. D'altra parte, sono stati identificati 72 GO significativamente sovraregolati, di cui i più significativi sono legati alla "risposta allo stimolo biotico esterno", alla "risposta ad altri organismi", alla "risposta cellulare ai livelli di ossigeno", alla "risposta di difesa" , "risposta allo stress" e più GO correlati al sistema immunitario (Figura 3C).

FIGURA 3 Termini dell'ontologia genetica dell'Arabidopsis (GO) arricchiti in risposta alla sfida Xcc OMV. Rappresentazioni con grafico a torta della distribuzione delle categorie in termini GO di processo biologico (A) e risposta allo stimolo (B) sovraregolati. (C) Elenco dei geni Arabidopsis con un LogFC > 4 in risposta alla sfida OMV. I geni sono stati filtrati dal set di dati completo di DEG e utilizzati per identificare termini GO arricchiti utilizzando lo strumento web AgriGo. Limite FDR < 0.05

3.2 La sfida OMV ha portato alla sovraregolazione dei recettori immunitari

Il rilevamento dei MAMP e la risposta delle piante ai MAMP sono in gran parte mediati da PRR legati alla membrana che mediano la percezione dei patogeni e l’efficiente mitigazione dell’infezione. I PRR sono comunemente classificati in due gruppi: recettori chinasi (RK) e proteine ​​simili ai recettori (RLP) (Boutrot & Zipfel, 2017). Per identificare i PRR espressi in modo differenziale in risposta agli OMV, abbiamo confrontato il nostro set DEG con elenchi precedentemente stabiliti di Arabidopsis RK (Kemmerling et al., 2011; Mott et al., 2016) e RLP (Wang et al., 2008). Abbiamo identificato nel nostro set di dati 33 e 10 RK e RLP up-regolati, rispettivamente, in tutti i punti temporali combinati (Tabella 1). Nessun RK o RLP è stato trovato nel nostro elenco di 175 geni sottoregolati. Kemmerling et al. (2011) hanno definito un elenco di 49 RK, la cui espressione era indotta in modo significativo da MAMP come flg22 e NLP (necrosi e proteina simile al peptide inducente l'etilene 1-) o dal trattamento dei patogeni. Abbiamo confrontato questo elenco con gli RLK sovraregolati del nostro esperimento e abbiamo scoperto che il 45% degli RK definiti da Kemmerling et al. (2011) sono stati indotti anche in risposta agli OMV. Tra questi, degni di nota sono FRK1, SOBIR1, SERK4, RLK/IKU2, PSKR1, HAESA, EFR, BIR e IOS1 (Tabella 1). Nel gruppo RK, FRK1 aveva l'espressione più alta sia a 2 che a 6 hpc con un LogFC di 7,11 e 5,2, rispettivamente, mentre il LogFC medio di tutti gli RK era di 2,11 e 2,13 rispettivamente a 2 e 6 hpc. Mentre gli RK e gli RLP legati alla membrana mediano principalmente il rilevamento extracellulare dei microbi invasori, i recettori LRR (ripetiti ricchi di leucina con sito di legame nucleotidico) (NLR) sono recettori immunitari intracellulari. Abbiamo trovato 7 diversi geni NLR sovraregolati in risposta alla sfida OMV a 2 e 6 hpc, nessuno è stato trovato a 24 hpc (l'elenco NLR è stato estratto da TAIR, 102 geni) (Tabella 1).

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3.3 Gli OMV inducono l'espressione di più fattori di trascrizione WRKY

È stato scoperto che i fattori di trascrizione WRKY (TF) svolgono un ruolo nelle risposte immunitarie delle piante, partecipando sia alle risposte di immunità innescata da MAMP (MTI) che a quelle di immunità innescata da effettori (ETI) (Birkenbihl et al., 2018; Rushton et al., 2010 ). La sfida OMV ha portato alla sovraregolazione di 20 diversi TF WRKY (elenco estratto da TAIR, 70 geni) solo a 2 e 6 HPC (Tabella 1). I TF WRKY erano assenti dal nostro set di geni sottoregolati. Un'altra famiglia di TF influenzata dalla sfida OMV sono le proteine ​​contenenti il ​​dominio MYB (Tsuda & Somssich, 2015), note per essere coinvolte in molteplici processi inclusi stress biotici e abiotici (Ambawat et al., 2013). Complessivamente, 9 diversi TF MYB (elenco estratto da TAIR, 211 geni) sono stati espressi in modo differenziale in risposta alla sfida OMV, 5 sovraregolati e 4 sottoregolati (Tabella 1). Ulteriori classi di TF espressi in modo differenziale rilevati sono elencate nella Tabella 1.

3.4 Confronto della risposta trascrizionale dell'Arabidopsis all'OMV con la risposta ai MAMP purificati

Per conoscere le differenze nella risposta dell'Arabidopsis all'elicitore purificato rispetto a una struttura grezza e molecolarmente complessa - OMV, abbiamo confrontato i nostri dati RNA-seq con i dati trascrittomici esistenti della risposta dell'Arabidopsis ai MAMP noti tra cui flg22, (Denoux et al., 2008) elf26 (Zipfel et al., 2006), PGN (Willmann et al., 2011), OG (Davidsson et al., 2017) e LPS (Livaja et al., 2008). I GO arricchiti sono stati estratti dai set di dati sopra menzionati come descritto sopra (Tabella Supp. S3) e confrontati con i GO arricchiti in seguito alla sfida OMV. In generale, i termini GO di Arabidopsis indotti dagli OMV erano simili a quelli indotti da MAMP singoli, proteici e non proteici, condividendo rispettivamente il 56, 51 e 47% dei GO indotti da OMV con i GO indotti da flg22, elf26 e PGN. D'altra parte, è stata osservata una minore sovrapposizione nei GO indotti con LPS e OG, condividendo rispettivamente il 24 e il 33% con i GO indotti da OMV (Figura 4A). In particolare, il gene 1 (PR1) correlato alla patogenesi (At2g14610), un segno distintivo delle risposte immunitarie indotte da LPS (Silipo et al., 2005, 2008), era assente dall'elenco dei geni indotti da OMV in tutti i punti temporali testati. Si è scoperto che quarantuno GO erano indotti da OMV e non da nessuno degli altri MAMP testati qui (Figura 4B). Questo elenco includeva GO relativi ad "apoptosi", "risposta al farmaco", "trasporto di farmaci e "trasporto multi-farmaco" e "attività della lipasi" (Tabella Supp. S3, indicata con asterischi e carattere in grassetto).

3,5 Gli OMV inducono resistenza dell'Arabidopsis alle infezioni batteriche

Qui e in precedenza (Bahar et al., 2016), abbiamo fornito prove che dimostrano che il sistema immunitario dell'Arabidopsis è indotto dalla sfida dell'OMV. Per esaminare se questa induzione immunitaria mediata da OMV si traduce in una risposta immunitaria efficace, abbiamo utilizzato un test di crescita batterica planta (Zipfel et al., 2004) in cui le piante di Arabidopsis vengono pretrattate con OMV seguite da inoculazione batterica. Una diminuzione significativa di oltre 10-volte in Pseudomonas syringae pv. è stata osservata una foglia di pomodoro DC3000 (Pst) CFU/g sia nelle piante pretrattate con OMV che con flg22- rispetto al pretrattamento simulato, due giorni dopo l'inoculazione (Figura 5A). La crescita in vitro di Pst non è stata influenzata negativamente dall'aggiunta di OMV al terreno, suggerendo che la ridotta crescita di Pst in planta è correlata all'effetto priming di OMV e non è un effetto diretto degli OMV sui batteri (Figura Supp. S2). Per verificare se la resistenza a Pst indotta da OMV è mediata da FLS2, EFR o BAK1 abbiamo ripetuto questo esperimento con Col-0, bak- mutante, e la linea del doppio mutante cade efr. Con entrambe le linee mutanti, il pretrattamento con OMV ha comportato una riduzione significativa delle foglie Pst CFU/g rispetto alle piante trattate in modo simulato (Figura 5B-C). Come previsto, le linee fls efr e bak-mutanti trattate con flg22 avevano titoli Pst simili a quelli delle piante non trattate poiché è noto che non rispondono a flg22. Per confrontare la riduzione relativa del titolo del patogeno in Col-0 rispetto alle linee mutanti del recettore immunitario che cadono sempre e bak nelle piante innescate, abbiamo calcolato la differenza nel titolo Pst nelle piante trattate con OMV e simulate in tre esperimenti indipendenti (Supp Figura S3). La riduzione media del titolo Pst nelle piante posteriori pretrattate con OMV è stata inferiore a quella osservata nelle piante Col-0 (0,89 contro 1,14 Log CFU/gr riduzione fogliare per bak e Col-0, rispettivamente, uno- modo ANOVA; F2,4=4.3781, p=0.0523). Non abbiamo riscontrato una riduzione simile con la linea mutante fls efr (riduzione di 1,26 vs. 1,32 Log CFU per fls efr e Col-0, rispettivamente, ANOVA unidirezionale: F1,4=0.0352, p=0.5698) (Figura 5D-E).

TABELLA 1 RK/RLP indotti da OMV e fattori di trascrizione immuno-correlati nelle piantine di Arabidopsis

TABELLA 1 (continua)

TABELLA 1 (continua)

4. DISCUSSIONE

Le vescicole della membrana esterna batterica (OMV) sono nanostrutture complesse originate dalla membrana esterna batterica e sono composte da centinaia di proteine ​​e altri componenti della parete cellulare. È stato precedentemente dimostrato che le piante di Arabidopsis rispondono alla sfida dell'OMV attivando risposte immunitarie tipiche come il burst dei ROS, l'espressione genica del marcatore immunitario e l'alcalinizzazione media (Bahar et al., 2016). In questo studio, abbiamo esaminato la più ampia risposta trascrizionale dell'Arabidopsis agli OMV batterici e il suo effetto sulla successiva infezione. La conclusione generale delle analisi dei dati RNA-seq eseguite in questo studio è che il sistema immunitario dell'Arabidopsis viene attivato in seguito all'esposizione agli OMV di Xanthomonas campestris pv.campestris (Xcc). Questa conclusione è supportata da analisi distinte e complementari. Innanzitutto, l'arricchimento dell'ontologia genetica (GO) nelle piante esposte agli OMV Xcc mostra chiaramente che gli OMV sono percepiti da Arabidopsis come fattori di stress. La posizione cellulare della risposta della pianta era associata principalmente alla periferia cellulare, suggerendo la percezione cellulare esterna del materiale stimolante, gli OMV. Ciò fornisce ulteriore supporto all’idea che gli OMV e i loro costituenti siano rilevati da recettori extracellulari, simili a molti MAMP conosciuti. In secondo luogo, abbiamo notato che un’ampia gamma di RK e RLP sono sovraregolati in risposta alla sfida dell’OMV. È noto che molti di questi recettori mediano la percezione dei patogeni o è stato precedentemente dimostrato che si associano alla risposta immunitaria delle piante. FLG22-indotto dalla chinasi simile al recettore 1 (FRK1) è stato il recettore più altamente indotto. Ciò è interessante poiché non siamo riusciti a rilevare la flagellina nella nostra analisi proteomica Xcc OMV (dati non mostrati). È noto che FRK1 è indotto anche da altri elicitori immunitari, ma è interessante il motivo per cui la sua espressione è molto più elevata rispetto al resto delle RK qui sovraregolate. L'espressione del recettore del fattore di allungamento (EFR), d'altra parte, era significativamente sovraregolata solo al punto temporale di 2 ore e aveva un LogFC di 1,12, anche se EF-Tu si trova negli OMV Xcc (Bahar et al., 2016 ). Abbiamo anche trovato alcuni geni NLR sovraregolati in risposta alla sfida OMV, metà dei quali sono annotati come proteine ​​di resistenza alle malattie, ma la loro funzione nell'immunità delle piante non è stata descritta. Sebbene non ipotizziamo che gli NLR siano direttamente coinvolti nella percezione dell'OMV, potrebbero essere indotti a valle del rilevamento RK/RLP delle molecole OMV, come è stato osservato anche in risposta a MAMP purificati come flg22, elf18 e LPS (Denoux et al., 2008). ; Livaja et al., 2008; Zipfel et al., 2006). In terzo luogo, molti fattori di trascrizione immuno-correlati, WRKY, MYB e altri, sono stati significativamente sovraregolati dagli OMV (Bjornson et al., 2021). Nel nostro studio, il principale cambiamento trascrizionale in risposta all'OMV si è verificato nei primi due punti temporali (2 e 6 hpc). Ciò è stato illustrato sia da un numero significativamente maggiore di geni espressi differenzialmente (DEG) che da un Log foldchange (LogFC) significativamente più elevato a 2 e 6 hpc. Tuttavia, su un totale di 121° trovati a 24 hpc, quasi la metà (52) non sono stati trovati a 2 o 6 hpc. Ciò suggerisce che la metà dei DEG a 24 hpc sono geni regolati tardi, la cui espressione è stata up o down-regolata dopo 6 hpc. In effetti, sono stati precedentemente identificati geni di Arabidopsis con diverse dinamiche di espressione a seguito di sfide con gli elicitori (Bjornson et al., 2021).

FIGURA 4 Confronto dei termini di ontologia genetica arricchita (GO) in risposta a OMV e a singoli MAMP purificati. I set di dati di espressione di Arabidopsis in risposta alla sfida MAMP (elf26, flg22, OGs, PGN e LPS; vedere la sezione Materiali e metodi per i riferimenti) sono stati utilizzati per estrarre GO arricchiti utilizzando lo strumento web AgriGo. I set GO arricchiti di ciascun MAMP sono stati confrontati con l'elenco GO arricchito in risposta agli OMV utilizzando Venny (A e Tabella Supp. S3). I termini GO arricchiti solo nei set di dati OMV sono mostrati in (B) ordinati in base al loro valore FDR.

Nel nostro studio, il principale cambiamento trascrizionale in risposta all'OMV si è verificato nei primi due punti temporali (2 e 6 hpc). Ciò è stato illustrato sia da un numero significativamente maggiore di geni differenzialmente espressi (DEG) che da un Log fold change (LogFC) significativamente più elevato a 2 e 6 hpc. Tuttavia, su un totale di 121° trovati a 24 hpc, quasi la metà (52) non sono stati trovati a 2 o 6 hpc. Ciò suggerisce che la metà dei DEG a 24 hpc sono geni regolati tardi, la cui espressione è stata up o down-regolata dopo 6 hpc. In effetti, i geni dell'Arabidopsis con diverse dinamiche di espressione in seguito alle sfide degli elicitori sono stati precedentemente identificati (Bjornson et al., 2021). Il modello di espressione genica rapido e per lo più transitorio che abbiamo visto qui è in accordo con altri studi che hanno testato la risposta temporale di Arabidopsis ai MAMP. Ad esempio, Denoux et al. (2008) e Bjornson et al. (2021) hanno dimostrato che il cambiamento trascrizionale nell'Arabidopsis in risposta a vari MAMP avviene entro pochi minuti o ore e, nella maggior parte dei casi, i DEG tornano ai livelli base circa 24 ore dopo il challenge con la pianta. A differenza delle interazioni tra una pianta e un agente patogeno, dove l'interazione è dinamica e continua quando viene sfidata con un campione non vivente, come un MAMP purificato o con OMV, ci si può aspettare che la risposta della pianta, almeno a livello trascrizionale, sarebbe transitorio e non prolungato nel corso dei giorni. La ricerca intensiva negli ultimi tre decenni ha rivelato molteplici recettori immunitari delle piante responsabili del riconoscimento dei microbi. Molti di questi recettori hanno la capacità di rilevare singole caratteristiche microbiche e vengono studiati in dettaglio per comprendere meglio la percezione dei patogeni, la segnalazione del sistema immunitario e la risposta delle piante modello e coltivate. Tuttavia, le piante sono esposte simultaneamente a molteplici caratteristiche microbiche provenienti da diverse fonti, che aggiungono complessità alla percezione e alla risposta immunitaria. Eravamo interessati ad esaminare le differenze nella risposta trascrizionale dell'Arabidopsis ai singoli MAMP purificati rispetto agli OMV, che rappresentano una struttura microbica più naturale e complessa ma un grado di complessità rimosso dal microbo stesso. Gli OMV trasportano fattori di virulenza, enzimi degradativi, tossine e altre biomolecole che potrebbero avere un ruolo funzionale per la crescita batterica nella pianta, e quindi è stato interessante testare se la sfida con OMV induce GO unici che non sono indotti da MAMP sintetici.

FIGURA 5 Il pretrattamento delle foglie di Arabidopsis con OMV induce resistenza alla successiva infezione batterica. Le piante Col-0 (A) sono state pretrattate con OMV, acqua (finta) o flg22 come controlli e 24 ore dopo inoculate con una sospensione da 105 CFU/ml di Pst DC3000 utilizzando l'infiltrazione con siringa senza ago . Il titolo cellulare Pst DC3000 nelle foglie inoculate è stato determinato 48 ore dopo l'inoculazione mediante piastre di diluizione seriale. Le piante di Arabidopsis Col-0 e fls efr (B) o bak (C) sono state testate in un esperimento simile come descritto in (A). È stata confrontata la riduzione media di Log Pst DC3000 CFU/gr in seguito al pretrattamento con OMV (rispetto alle piante non trattate) in Col-0 e cadute efr (D), e Col-0 e ritorno (E). Ciascuna barra rappresenta la riduzione media di Log Pst DC3000 CFU/gr da tre esperimenti indipendenti (i dati degli esperimenti indipendenti sono presentati nella Supp. Fig. S3). Le differenze non erano statisticamente significative (test t di Student a due code. I valori p sono indicati sopra le barre del grafico). Gli esperimenti A, B e C sono stati condotti almeno tre volte con risultati simili (3 piante/repliche per trattamento in ciascun esperimento). Gli asterischi (**) indicano una differenza significativa rispetto al mock (test di Dunnet p < 0,001)

Per i nostri confronti trascrittomici, abbiamo raccolto dati da studi con condizioni sperimentali simili, cioè nelle piante e in punti temporali simili. Una significativa sovrapposizione nell'arricchimento di GO è stata osservata nella risposta dell'Arabidopsis a OMV e a flg22, elf26 e PGN. Ciò non è inaspettato poiché è noto che molti dei percorsi di difesa attivati ​​​​al rilevamento dei patogeni sono simili, indipendentemente dall'elicitore specifico o dalla sua fonte (Bjornson et al., 2021; Zipfel et al., 2006). Tuttavia, alcuni GO unici sono risultati sovraregolati dagli OMV e non dagli altri MAMP che abbiamo esaminato. Tra questi ci sono GO relativi alla degradazione della parete cellulare come "attività lipasi" e "attività idrolasi che agisce sui legami glicosilici", che potrebbero indicare che il sistema di difesa della pianta prende di mira la degradazione dell'OMV. È interessante notare che anche tre GO legate al trasporto di droga sono risultate sovraregolate in modo univoco dalla sfida dell’OMV. Ciò potrebbe indicare che le piante si trovano ad affrontare composti tossici che vengono rilasciati nelle loro cellule, forse attraverso il rilascio mediato da OMV. A differenza della risposta di Arabidopsis ai peptidi immuno-elicitanti e al PGN, abbiamo osservato una sovrapposizione relativamente piccola tra la risposta di Arabidopsis agli OG OMV e LPS. Questa piccola sovrapposizione, soprattutto con gli LPS, è alquanto sorprendente, considerando che nelle cellule dei mammiferi, gli LPS sono ben riconosciuti come potenti contributori alla risposta immunitaria dell'ospite indotta dagli OMV (Ellis et al., 2010). Inoltre, il fatto che non siamo riusciti a trovare una sovraregolazione del marchio immunitario PR1 dell'LPS (Silipo et al., 2005), potrebbe suggerire che l'LPS non è uno dei principali elicitori dell'interazione immunitaria della pianta con gli OMV batterici. Questo però resta da esaminare più approfonditamente. È stato dimostrato che gli OMV contribuiscono alla colonizzazione batterica sia dei mammiferi che delle piante ospiti e in alcuni casi alla virulenza batterica. D'altra parte, gli OMV attivano quindi il sistema immunitario dell'ospite, agendo come un'arma a doppio taglio, promuovendo la sopravvivenza e la virulenza batterica da un lato e alimentando il sistema di sorveglianza dell'ospite e attivando l'immunità dell'ospite dall'altro (McMillan & Kuehn, 2021 ). I nostri test di priming hanno mostrato che la sfida con OMV ha portato a una significativa inibizione di Pseudomonas syringae pv. crescita del pomodoro DC3000 (Pst) nella pianta, simile all'effetto priming osservato con i MAMP sintetici (Jung et al., 2009). Pertanto, in questo caso, la pre-somministrazione di OMV al tessuto inoculato non ha promosso la colonizzazione batterica ma piuttosto ha innescato le piante per indurre un’efficace risposta immunitaria che ha inibito la crescita dei patogeni. Questo risultato è in linea con i nostri dati trascrizionali e con il nostro studio precedente, supportando l’idea che gli OMV inducono una risposta immunitaria robusta ed efficace nell’Arabidopsis. Due studi recenti hanno anche dimostrato che il pretrattamento di Arabidopsis con OMV di una specie patogena o commensale di Pseudomonas, ha soppresso la successiva infezione da Pst (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021). Questi risultati indicano cumulativamente che nelle condizioni testate, l’infiltrazione di OMV non facilita l’infezione da agenti patogeni. In uno studio precedente, abbiamo dimostrato che più mutanti del recettore immunitario mantengono la reattività del WT agli OMV Xcc. Questi mutanti includevano PRR noti, che riconoscevano MAMP proteici (FLS2, EFR, RLPReMAX) o non proteici (LYM1/LYM3) (Bahar et al., 2016). È interessante notare che Janda et al. (2021) hanno riferito che quando la linea mutante del recettore FLS2 di Arabidopsis (influenza) è stata sfidata con OMV da Pst, l'espressione di FRK1 era invariata ed era simile alle piante trattate in modo simulato, suggerendo che FLS2 media la risposta agli OMV di Pst. È possibile che la flagellina sia più abbondante nelle preparazioni di OMV Pst rispetto agli OMV Xcc 33913, e quindi la rimozione del recettore della flagellina ha avuto un effetto più pronunciato sulla risposta della pianta al Pst rispetto agli OMV Xcc.

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È stato dimostrato che diversi test immunitari sulle piante possono produrre risultati diversi, portando a conclusioni presumibilmente contraddittorie. Ad esempio, abbiamo dimostrato che in un test di burst di ROS su disco fogliare, la risposta di Arabidopsis agli OMV dipendeva dal recettore EFR, tuttavia, in un test di espressione genica del marcatore immunitario con piantine di Arabidopsis, ogni linea mutante era altrettanto reattiva agli OMV quanto il PESO. McMillan et al. (2021) hanno dimostrato che diversi trattamenti fisici applicati agli OMV hanno abolito alcune attività come l'inibizione della crescita delle piantine. Tuttavia, non ha alterato altri risultati immunitari come il priming delle piante. Pertanto, è importante combinare una varietà di test per testare diversi risultati immunitari per ottenere una visione quanto più ampia possibile della risposta immunitaria della pianta a un dato elicitore. Per esaminare ulteriormente il coinvolgimento di alcuni dei PRR e co-recettori noti, abbiamo testato le linee fall ever e bak mutanti utilizzando il saggio di priming delle piante. I nostri risultati mostrano che le cadute della linea doppia mutante di Arabidopsis sono state innescate in modo simile da Xcc OMV così come le piante WT, supportando l'idea che MAMP diversi dalla flagellina e EF-Tu sono presenti anche negli OMV Xcc 33913. Sulla base dei test di espressione genica dei marcatori immunitari, abbiamo precedentemente suggerito che il co-recettore BAK1 è coinvolto nella percezione e/o risposta dell'OMV (Bahar et al., 2016). In questo studio, abbiamo rivisitato questo suggerimento utilizzando il test di priming. Qui, la linea mutante bak è stata innescata dal pretrattamento OMV, ma in misura leggermente inferiore rispetto alle piante WT Col-0. Anche se questo margine non era statisticamente significativo, era maggiore di quello osservato con la linea double fls ever mutante. Questo risultato è anche in linea con un recente studio che ha dimostrato che la linea mutante bak rispondeva agli OMV come piante WT negli esperimenti di priming immunitario (Tran et al., 2021). Nel complesso, ciò potrebbe suggerire che mentre BAK1 è coinvolto nella percezione dell'OMV, altre vie di percezione e segnalazione immunitaria sono innescate da OMV, portando a un'efficace risposta immunitaria e alla soppressione della crescita dei patogeni. Il coinvolgimento dei co-recettori BAK1 e SOBIR1 in risposta agli OMV (Bahar et al., 2016) ci ha portato a supporre che più recettori immunitari, probabilmente PRR, siano coinvolti nella percezione degli OMV. Tuttavia, uno studio recente ha suggerito che l'attivazione immunitaria delle piante da parte degli OMV può essere indipendente dal MAMP e derivare da cambiamenti fisico-chimici nella membrana plasmatica della pianta indotti dall'integrazione degli OMV (Tran et al., 2021). Questa è un’ipotesi intrigante che resta da approfondire. È interessante notare che McMillan et al. (2021) hanno riferito che gli OMV trattati con proteinasi K hanno mantenuto la loro capacità di priming immunitario, indicando che questa attività potrebbe essere indipendente dal carico proteico dell'OMV. Sebbene questo risultato possa supportare l'ipotesi di attivazione immunitaria indipendente da MAMP di Tran et al. (2021), altri MAMP non proteici presenti negli OMV come LPS e PGN possono attivare MTI (Bahar et al., 2016; McMillan et al., 2021). Inoltre, gli OMV trattati con proteinasi K hanno mantenuto la loro capacità di indurre l'inibizione della crescita delle piantine, indicando che l'inibizione della crescita dipende dal carico proteico degli OMV (McMillan et al., 2021). Nel complesso, questi risultati sottolineano ulteriormente la complessità della risposta delle piante agli OMV e l'importanza di utilizzare una varietà di risultati per testare il coinvolgimento di un particolare elicitore in percorsi specifici.

Nel corso del 2021, quattro studi indipendenti incluso questo (che probabilmente hanno avuto luogo contemporaneamente), hanno riferito che gli OMV batterici modulano il sistema immunitario delle piante e inducono una risposta efficace contro l'infezione da agenti patogeni (Janda et al., 2021; McMillan et al., 2021; Tran et al., 2021). Questi entusiasmanti risultati posizionano gli OMV come un nuovo e importante attore nelle interazioni pianta-microbo, dove c’è ancora molto da imparare. In questo studio, forniamo una visione più ampia della risposta trascrizionale di Arabidopsis a Xcc OMV. Saranno necessari approcci di ricerca complementari per comprendere ulteriormente i componenti e i meccanismi coinvolti nella percezione degli OMV da parte delle piante.

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