BCAT2 forma un microambiente tumorale non infiammato e induce resistenza all'immunoterapia anti-PD-1/PD-L1 regolando negativamente le chemochine proinfiammatorie e l'immunità antitumorale

Per migliorare il tasso di risposta della monoterapia del blocco del checkpoint immunitario (ICB), è necessario trovare un bersaglio emergente nella terapia di combinazione. Attraverso l'analisi degli indicatori correlati al microambiente tumorale (TME), è stato convalidato che BCAT2 forma una TME non infiammata nel cancro della vescica. I risultati della multiomica indicano che BCAT2 ha un effetto inibitorio sul reclutamento dei linfociti citotossici limitando le attività delle vie correlate alle citochine/chemochine proinfiammatorie e della via chemiotassi delle cellule T. I test immunologici rivelano che la secrezione di chemochine correlate alle cellule T CD8+ mantiene una forte correlazione negativa con BCAT2, generando una tendenza decrescente delle cellule CD8+T attorno alle cellule tumorali BCAT2+ da lontano a vicino. Il cotrattamento del deficit di BCAT2 e dell'anticorpo anti-PD-1 ha un effetto sinergico in vivo, implicando il potenziale di BCAT2 nella terapia di combinazione. Inoltre, il valore di BCAT2 nel predire l’efficacia dell’immunoterapia è convalidato in più coorti di immunoterapia. Insieme, come molecola chiave nella TME, BCAT2 è un bersaglio emergente in combinazione con ICB e un biomarcatore per guidare la terapia di precisione.

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1. Introduzione

Nonostante il trattamento chirurgico radicale, quasi la metà dei pazienti con cancro della vescica muscolo-invasivo presenta metastasi.[3] Pertanto, la terapia sistemica svolge un ruolo importante nel cancro della vescica avanzato. Il microambiente tumorale (TME) è un sistema complicato e ha un profondo impatto sull'efficacia dell'immunoterapia.[6] L'aminotransferasi a catena ramificata 2 (BCAT2) è un enzima fondamentale nel processo del metabolismo degli aminoacidi solforati.[8] Li et al. hanno scoperto che BCAT2 era essenziale per lo sviluppo del cancro del pancreas mediando il catabolismo degli aminoacidi a catena ramificata (BCAA).[9] Lee et al. hanno dimostrato che il deficit di BCAT2 ha inibito la crescita tumorale dell'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) regolando il metabolismo dei lipidi.[10] For exploring molecular mechanisms, we further performed single-cell RNA sequencing (siRNA seq) and bulk-RNA seq, revealing that BCAT2 plays a repressive part in the recruitment of CTLs into TME, by inhibiting activities of cytokine/chemokine-associated signal pathways and Vie del segnale della chemiotassi delle cellule T. In vitro, test multiimmunologici hanno dimostrato che la secrezione di chemochine correlate a CTL ha correlazioni negative stabili con l'espressione di BCAT2. In vivo, è stato rivelato un effetto cooperativo nella terapia combinata della perdita di BCAT2 e dell'ICB. Ancora più importante, il suo ruolo nella previsione dell’effetto curativo dell’immunoterapia è stato convalidato nella coorte di immunoterapia Xiangya BLCA.

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2. Risultati

2.1. BCAT2 è correlato negativamente con l'immunità antitumorale della TME nel BLCA

Nella maggior parte dei tipi di cancro, l'espressione di BCAT2 è maggiore nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti normali (Figura S1A, Informazioni di supporto) e il suo modello di espressione in BLCA è stato convalidato nella coorte Xiangya BLCA (Figura S1B, Informazioni di supporto). Inoltre, BCAT2 è ampiamente espresso in varie linee cellulari tumorali (Figura S1C, Informazioni di supporto). Inoltre, i risultati di un’analisi pan-tumorale completa su sistema chemochinico, MHC, immunostimolatori e TIIC hanno indicato che BCAT2 ha effetti immunosoppressivi significativi in ​​un paio di tipi di cancro, tra cui il cancro della vescica (BLCA), il cancro al seno (BRCA), le cellule papillari renali del rene carcinoma (KIRP), adenocarcinoma pancreatico (PAAD), sarcoma (SARC) e carcinoma della tiroide (THCA) (Figura S2A, B, Informazioni di supporto). Inoltre, sono state trovate anche correlazioni negative tra BCAT2 e checkpoint immunitari inibitori comuni (PD- 1, PD-L1, CTLA-4 e LAG-3) (Figura S2C–F, Informazioni di supporto ). Attraverso un’analisi completa del cancro, abbiamo scoperto che BCAT2 ha l’effetto immunosoppressivo più profondo nel BLCA. Quindi, abbiamo esplorato ulteriormente il suo ruolo immunologico nel BLCA. Sulla base del valore di espressione mediano di BCAT2, abbiamo diviso gli individui nel gruppo ad alto BCAT2 e nel gruppo a basso BCAT2 nella coorte TCGA-BLCA. Ovviamente, una serie di chemochine, recettori delle chemochine, molecole correlate al MHC e immunostimolatori erano downespressi nel gruppo ad alto BCAT2 e sovraespressi nel gruppo a basso BCAT2 (Figura 1A). Un risultato simile è stato riscontrato nel ciclo immunitario del cancro, che copre molteplici passaggi essenziali nel reclutamento e nell’infiltrazione delle cellule immunitarie (Figura 1B). Inoltre, abbiamo dimostrato robuste connessioni negative tra i livelli di infiltrazione delle cellule immunitarie (cellule T CD8+, cellule T CD4+, cellule Nature Killer (NK) e cellule dendritiche (DC)) e BCAT2 in diversi algoritmi (Figura 1C). Allo stesso modo, è stata riscontrata una minore espressione dei geni effettori delle cellule immunitarie (cellule T CD8+, cellule NK, macrofagi, cellule T helper 1 (Th1) e cellule DC) nel gruppo con BCAT2 alto rispetto a quello con BCAT2 basso gruppo (Figura 1D). Ancora più importante, quando si è correlato BCAT2 con il punteggio TIS (Figura S3, Informazioni di supporto) e i checkpoint immunitari inibitori (Figura 1E), sono state rivelate evidenti relazioni negative tra di loro. Pertanto, abbiamo ipotizzato che BCAT2 possa regolare negativamente la risposta immunitaria alla TME e influenzare profondamente l’efficacia dell’immunoterapia. Inoltre, i risultati di cui sopra sono stati ben convalidati in nove coorti BLCA indipendenti (GSE31684, GSE32894, GSE48075, GSE48276, GSE69795, GSE83586, GSE86411, GSE87304 e GSE128702) (Figure S4–S12, Informazioni di supporto). Infine, abbiamo verificato nuovamente l'associazione tra BCAT2 e TME nella coorte Xiangya BLCA. Coerentemente, l'espressione di BCAT2 ha relazioni negative con l'attività del ciclo immunitario del cancro, i livelli di infiltrazione dei TIIC, il punteggio TIS e i livelli di espressione dei checkpoint immunitari (Figura 2A-C). Collettivamente, abbiamo rivelato che un'elevata espressione di BCAT2 forma una TME non infiammata in BLCA e una bassa espressione di BCAT2 forma una TME infiammata in BLCA.

2.2. Esplorazione del meccanismo di BCAT2 nel modellare la TME mediante Bulk RNA-seq e siRNA-seq

Nella coorte TCGA-BLCA, i DEG tra i gruppi BCAT2 alto/basso, i gruppi con punteggio immunitario alto/basso e i gruppi con punteggio stromale alto/basso sono stati identificati e intersecati (Figura S13A, Informazioni di supporto). È interessante notare che i DEG correlati al positivo BCAT2 non avevano intersezione con i DEG correlati al punteggio immunitario e stromale (Figura 2D). Nel frattempo, lo stesso fenomeno si è verificato negli EG correlati al negativo tra di loro (Figura S13B, Informazioni di supporto). Questi risultati hanno indicato che BCAT2 probabilmente regola negativamente i percorsi immunitari correlati al sistema immunitario. Per coincidenza, i risultati delle analisi GO e KEGG hanno rivelato che i DEG correlati a BCAT2- erano arricchiti in modo più significativo nei percorsi di migrazione dei leucociti, attivazione delle cellule T e interazione citochina-recettore delle citochine (Figura 2E, F). Pertanto, abbiamo ipotizzato che BCAT2 formi una TME non infiammatoria nella BLCA inibendo le attività dei percorsi correlati alle citochine/chemochine. Tuttavia, la caratteristica del sequenziamento massivo della NA ne determina la limitazione, il cui livello di espressione del gene è calcolato dal valore medio di tutte le cellule del tessuto. Per superare la limitazione, il siRNA è stato eseguito su tre campioni BLCA. Più di 19 000 cellule sono state analizzate e classificate in sei categorie: cellule epiteliali, cellule fibroblastiche, cellule T/NK, cellule endoteliali, cellule B e cellule mieloidi (Figura 3A), fare riferimento a biomarcatori riconosciuti (EPCAM, LYZ, CD3D, COL1A1, CD79A, CD19, PECAM1 e VWF).[11] Sorprendentemente, BCAT2 era espresso principalmente nelle cellule epiteliali (EPCAM+), piuttosto che nelle cellule endoteliali e nelle cellule immunitarie. Sulla base dell’accumulo di CNV, le cellule epiteliali EPCAM+ sono state considerate cellule uroteliali maligne. Per convalidare il modello di espressione di BCAT2, nello studio sono state incluse due coorti di siRNA esterne. Nella coorte di scRNA GSE135337, più di 36,000 cellule sono state elaborate e divise in cinque cluster. Il sottotipo cellulare espresso principalmente di BCAT2 era ancora una cellula uroteliale maligna della vescica (Figura 3B). Un modello di espressione simile è riapparso nella coorte di siRNA GSE145137 (Figura 3C). Pertanto, il modello di espressione maggioritaria sulle cellule maligne ha dedotto che BCAT2 agisce come una parte immunoregolatrice nella TME principalmente attraverso caratteristiche variabili delle cellule tumorali. In base al livello di espressione di BCAT2, le cellule uroteliali maligne sono state divise in un gruppo ad alto BCAT2 e un gruppo a basso BCAT2. L'analisi GSEA dei termini GO nelle coorti di siRNA GSE135337 e GSE145137 ha rivelato che un gruppo di percorsi correlati a citochine/chemochine erano significativamente sottoregolati nel gruppo con BCAT2 elevato, tra cui la produzione di chemochine, la secrezione di chemochine, la regolazione della via di segnalazione mediata dalle chemochine, la risposta alle chemochine, legame del recettore delle chemochine, attività delle citochine, legame delle citochine e legame del recettore delle citochine (Figura 3D–G; Figura S14B, Informazioni di supporto). Nel frattempo, la chemiotassi dei leucociti, la chemiotassi dei linfociti, la chemiotassi delle cellule T e i loro percorsi regolatori avevano correlazioni significativamente negative con BCAT2 (Figura 3E-I; Figura S14A, Informazioni di supporto). L'analisi GSEA dei termini KEGG ha indicato che i percorsi di interazione del recettore citochina-citochina e l'elaborazione e presentazione dell'antigene erano ovviamente sottoregolati nel gruppo con BCAT2 elevato (Figura 3F). Insieme, un'elevata espressione di BCAT2 reprime le attività delle citochine proinfiammatorie e dei percorsi correlati alle chemochine, portando a un ridotto livello di infiltrazione di TIIC, che in definitiva modella una TME non infiammata.

Figura 1. BCAT2 è correlato negativamente con l'immunità antitumorale nella TME di BLCA. A) Modello di espressione di chemochine, recettori per chemochine, molecole MHC e immunostimolatori nei gruppi BCAT2 alti e bassi. B) Attività del ciclo immunitario del cancro nei gruppi BCAT2 alti e bassi. Sette colori rappresentano sette fasi del ciclo. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0,001. C) Correlazioni tra BCAT2 e diversi tipi di cellule immunitarie (cellule CD8+T, cellule CD4+T, cellule DC e cellule NK) in sei algoritmi indipendenti. D) Modelli di espressione di più sottotipi di cellule immunitarie (cellule T CD8+, cellule NK, macrofagi, cellule Th1 e cellule DC) correlati ai geni effettori nei gruppi BCAT2 alti e bassi. E) Correlazioni tra i geni effettori correlati a BCAT2 e ICB. Il numero nel cerchio indica il coefficiente di correlazione.

Figura 2. Convalida della funzione di BCAT2 da parte della coorte Xiangya BLCA. A) Correlazioni tra BCAT2/ciclo immunitario contro il cancro (a sinistra) e BCAT2/TIIC (a destra). Le linee continue e tratteggiate indicano relazioni positive e negative, lo spessore delle linee indica il coefficiente di correlazione, le linee con colori diversi rappresentano il valore p delle correlazioni. B) Correlazioni tra BCAT2 e geni effettori correlati a ICB. C) Correlazioni tra i geni effettori correlati al punteggio BCAT2 e TIS. Il numero nel cerchio rappresenta il coefficiente di correlazione. D) Intersezione di geni correlati a BCAT2, punteggio immunitario e punteggio stromale. E,F) Le 20 principali vie di segnalazione dell'arricchimento delle analisi GO e KEGG nei geni correlati a BCAT2-.

Figura 3. Esplorazione del meccanismo di BCAT2 nel modellare la TME mediante bulk RNA-seq e scRNA-seq. A, B) grafici tSNE del pattern di espressione di una singola cellula di BCAT2 nella coorte Xiangya siRNA e nella coorte GSE135337. C) Grafico del violino del modello di espressione a singola cellula di BCAT2 nella coorte GSE145137. D, E) L'analisi GSEA del termine GO indica attività di percorsi correlati a citochine/chemochine e percorsi correlati alla chemiotassi delle cellule immunitarie tra diversi gruppi BCAT2 nella coorte GSE135337. F) L'analisi GSEA del termine KEGG indica le attività di presentazione dell'antigene e l'interazione delle citochine e della via dei recettori delle citochine tra diversi gruppi BCAT2 nella coorte GSE145137. G-I) L'analisi GSEA del termine GO indica attività di percorsi correlati a citochine/chemochine, percorsi correlati alla chemiotassi delle cellule immunitarie e percorsi correlati alla migrazione delle cellule immunitarie tra diversi gruppi BCAT2 nella coorte GSE145137. J, K) Analisi GO e KEGG dei DEG tra le linee cellulari BCAT2 OE e BCAT2 KD.

2.3. BCAT2 varia i modelli di espressione delle chemochine correlate alle cellule T CD8+ e inibisce la capacità citotossica dei CTL

Per convalidare i percorsi di arricchimento sopra menzionati, le linee cellulari di cancro alla vescica umano (T24)/murino (MB49) con sovraespressione di BCAT2 (BCAT2 OE) e knockdown di BCAT2 (BCAT2 KD) sono state costruite con successo (Figura S15A–D, Informazioni di supporto) e sono state testate con sequenziamento dell'RNA ad alto rendimento. Atteso, l'analisi GO delle linee cellulari T24 ha rivelato che i DEG erano significativamente arricchiti nei percorsi di segnalazione mediata dalle chemochine, risposta alle chemochine, migrazione dei leucociti e migrazione dei leucociti (Figura 3J). L'analisi del percorso KEGG delle linee cellulari T24 ha mostrato che la via di segnalazione delle chemochine, la via di interazione del recettore citochina-citochina e la via del cancro della vescica erano significativamente arricchite (Figura 3K). Allo stesso modo, diversi percorsi critici correlati alle citochine/chemochine sono stati trovati nelle analisi GO e KEGG delle linee cellulari MB49 (Figura S16A, B, Informazioni di supporto). È evidente che varie citochine e chemochine svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della TME. Pertanto, è necessario selezionare le citochine/chemochine che sono specificatamente regolate da BCAT2. Pertanto, sono stati applicati test immunologici multipli ProcartaPlex per identificare la variazione della secrezione di citochine/chemochine nelle linee cellulari di cancro della vescica umana e di topo. Sorprendentemente, i livelli di secrezione di CCL3, CCL4, CCL5 e CXCL10 sono sovraregolati nelle linee cellulari BCAT2-KD umane e murine e sottoregolati nelle linee cellulari BCAT2-OE umane e murine (Figura 4A, B; Figura S16C , D, Informazioni di supporto). In studi precedenti, CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 e CXCL10 erano considerate chemochine cruciali per il reclutamento delle cellule T CD8+ nella TME.[12] Di conseguenza, per un'analisi più completa delle chemochine correlate alle cellule T CD8+, tutte sono state incluse per un'ulteriore convalida. Sorprendentemente, i livelli di espressione dell'RNA di CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 e CXCL10 erano significativamente sottoregolati nelle cellule BCAT2 OE e significativamente sovraregolati nelle cellule BCAT2 KD (Figura 4C). Allo stesso modo, i risultati dell'ELISA hanno mostrato che i livelli di proteine ​​secrete avevano anche correlazioni negative con l'espressione di BCAT2 (Figura 4D). Questi risultati hanno indicato che la sovraespressione di BCAT2 inibisce il trascrittoma e i livelli proteici delle chemochine correlate alle cellule T CD8+, tra cui CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 e CXCL10. Ancora più importante, il test di chemiotassi ha rivelato che la linea cellulare OE BCAT2 ha inibito significativamente la capacità di chemiotassi delle cellule T CD8+ (Figura 4E, a sinistra). Al contrario, i surnatanti cellulari della linea cellulare BCAT2 KD erano in grado di attrarre più cellule T CD8+ rispetto al controllo negativo (Figura 4E, a destra). Questi risultati hanno indicato che BCAT2 può influenzare la capacità chemiotattica delle cellule T CD8+ regolando i livelli di mRNA e proteine ​​delle chemochine correlate. Inoltre, è stato utilizzato un test di uccisione delle cellule tumorali mediato dalle cellule T per esplorare la variazione di citotossicità delle cellule T dopo il contatto diretto con le cellule tumorali che esprimono un diverso livello di BCAT2. Come mostrato nella Figura 4F e nella Figura S17A, B (Informazioni di supporto), la sovraespressione di BCAT2 sulle cellule tumorali ha soppresso direttamente la funzione citotossica delle cellule T e il knockdown di BCAT2 sulle cellule tumorali ha invertito significativamente la tendenza. L'analisi con citometria a flusso delle cellule T raccolte ha rilevato che le proporzioni di cellule T CD8+TNF-𝛼+ e cellule T CD8+IFN-𝛾+ presentavano differenze significative nei diversi sistemi di cocoltura, il che significava un enorme cambiamento nella l'attività delle cellule T CD8+ (Figura 4G; Figura S17C, D, Informazioni di supporto). Collettivamente, BCAT2 è in grado di inibire la capacità di reclutamento delle cellule T CD8+ regolando i livelli di chemochine correlate e sopprimendo le attività dei CTL tramite contatto diretto. Inoltre, l'esito del test di uccisione delle cellule tumorali mediata dalle cellule T (senza gruppo di cellule T) può dedurre che BCAT2 svolge un ruolo oncogenico nel cancro della vescica. Pertanto, per convalidare questa ipotesi sono stati utilizzati il ​​test delle colonie di piastre e il test di migrazione/invasione dei transwell. Come anticipato, la sovraespressione di BCAT2 ha migliorato significativamente la capacità di proliferazione, migrazione e invasione delle cellule tumorali e l'abbattimento di BCAT2 ha soppresso marcatamente questi comportamenti (Figura S18A–F, Informazioni di supporto).

2.4. Convalida della relazione spaziale esclusiva tra la cellula tumorale BCAT2+ e la cellula CD8+T mediante TMA della coorte Xiangya BLCA

In base ai risultati degli esperimenti di massa RNA-seq, scRNA-seq e in vitro, abbiamo dimostrato che BCAT2 svolge un ruolo immunosoppressivo nel BLCA sopprimendo il reclutamento e la citotossicità delle cellule T CD8+. Tuttavia, l'interazione delle cellule tumorali BCAT2+ e delle cellule T CD8+ è ancora sconosciuta a livello dei tessuti umani. Nella coorte Xiangya BLCA, immagini rappresentative e un punteggio complessivo di IHC hanno rivelato una correlazione negativa tra BCAT2 e CD8 (R=−0.38, p=0.0 038) (Figura 5A, B). La colorazione IF multicolore delle cellule tumorali BCAT2+ (BCAT2+CK19+) e delle cellule T BCAT2+CD8+ è stata condotta in TMA e analizzata in modo semiautomatico utilizzando il Piattaforma di quantificazione panoramica TissueFAXS. Come mostrato nella Figura 5C, l'ambito di espressione di BCAT2 e CK19 era ampiamente sovrapposto. Al contrario, l'ambito di espressione di BCAT2 e CD8 era distinto e separato. Le proporzioni dettagliate di coespressione delle cellule BCAT2+CK19+ e delle cellule BCAT2+CD8+T erano 87,29% e 5,09% (Figura 5D, E), il che era coerente con il valore modello di espressione di BCAT2 in scRNA-seq. Nella TMA complessiva, c'era ancora una differenza significativa nella proporzione di coespressione tra di loro (Figura S19A, Informazioni di supporto). Ancora più importante, nell'analisi multidimensionale del gradiente di distanza (0–25, 25–50, 50–100 e 100–150 μm) intorno alle cellule tumorali BCAT2+, la conta delle cellule T CD8+ è stata gradualmente aumentata da vicino a lontano (Figura 5F; Figura S19B, Informazioni di supporto). Insieme, abbiamo dimostrato che a livello dei tessuti umani, BCAT2 è espresso principalmente anche nelle cellule tumorali e che la cellula tumorale BCAT2+ ha una relazione spaziale esclusiva con la cellula T CD8+.

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2.5. La perdita di BCAT2 migliora l'efficacia della terapia anti-PD-1

Con un impatto decisamente negativo sulla TME e una stretta correlazione negativa con il blocco del checkpoint inibitorio, suscita grande interesse esplorare l'effetto sinergico della perdita di BCAT2 e del trattamento anti-PD- 1. Prima dell’immunoterapia, BCAT2 KD ha costruito un modello di cancro della vescica sottocutaneo e ha controllato le linee cellulari murine. Quindi, la terapia anti-PD-1 e la terapia di controllo sono state applicate ai topi portatori di tumore (Figura 6A). Coerentemente con il suo ruolo oncogenico e il meccanismo di regolazione delle chemochine in vitro, il deficit di BCAT2 ha inibito la crescita del tumore e prolungato il tempo di sopravvivenza in vivo, sovraregolando le chemochine correlate a CD8+T (Figura 6B–E; Figura S20A, Informazioni di supporto). Per quanto riguarda l'efficacia dell'immunoterapia, sebbene la monoterapia anti-PD-1 possa ridurre in parte il carico tumorale, il trattamento concomitante di BCAT2 KD e anticorpo monoclonale anti-PD-1 (mab) ha indicato un migliore effetto di soppressione del tumore e ha ottenuto maggiori risultati beneficio in termini di sopravvivenza. Nel giorno previsto, i tumori sono stati raccolti e preparati per ulteriori analisi. Una parte di essi è stata digerita in sospensione unicellulare e condotta analisi di citometria a flusso. Con una popolazione simile di leucociti e cellule T (Figura S20B–E, Informazioni di supporto) nel tumore, è stata mostrata una percentuale maggiore di cellule T CD8+ nel gruppo con deficit di BCAT2 rispetto al gruppo di controllo negativo. Allo stesso modo, il gruppo in terapia di combinazione ha avuto un'infiltrazione più massiccia di CTL rispetto al gruppo in monoterapia (Figura 6F-H). Ancora più importante, anche gli indicatori di citotossicità (GZMB, IFN-𝛾, TNF-𝛼 e perforina) dei CTL sono stati rafforzati nei tumori murini con perdita di BCAT2 e trattamento combinato rispetto al controllo corrispondente (Figura 6G, I–L). Le altre parti dei tumori sono state trasformate in sezioni congelate e implementata la colorazione IF. Come previsto, la densità delle cellule T CD8+ nella regione di interesse (ROI) ha mostrato la stessa tendenza con l'analisi della citometria a flusso (Figura 6M, N). Questi risultati hanno indicato che il deficit di BCAT2 sulle cellule tumorali può modellare una TME infiammata e avere una grande efficacia con il trattamento dell’immunoterapia. Per capire il ruolo delle cellule T CD8+ nell'effetto sinergico del cotrattamento, è stato applicato mab CD8𝛼 per antagonizzarle in topi immunocompetenti (Figura S21A, Informazioni di supporto) e convalidato il suo effetto di deplezione mediante citometria a flusso e IF (Figura S21B, C, Informazioni di supporto). Ovviamente, dopo la deplezione, il carico tumorale e il tempo di sopravvivenza erano significativamente invertiti (Figura S21D–G, Informazioni di supporto). Questi risultati hanno indicato che le cellule T CD8+ svolgono un ruolo indispensabile nell'effetto sinergico della terapia di combinazione.

Figura 4. BCAT2 varia i modelli di espressione delle chemochine correlate alle cellule T CD8+ e inibisce la capacità citotossica dei CTL. A,B) Le mappe di calore dei test immunologici multipli ProcartaPlex mostrano la variazione della secrezione di citochine e chemochine comuni nei gruppi BCAT2 OE, BCAT2 KD e di controllo negativo (n=3 per gruppo). C,D) Gli istogrammi mostrano livelli di espressione di mRNA normalizzati e concentrazioni di secrezione proteica di CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 e CXCL10 in BCAT2 OE (a sinistra), BCAT2 KD (a destra) e nei gruppi di controllo negativo (n {{ 15}} per gruppo). *p < 0.{{20}}5; **p < 0.01; ***p < 0,001. E) Il test di chemiotassi indica una diversa capacità di chemiotassi dei CTL nei gruppi BCAT2 OE, BCAT2 KD e nei gruppi di controllo negativo (n=3 per gruppo). *p<0,05; **p<0,01. F) Il test di uccisione delle cellule tumorali mediata dalle cellule T indica diverse capacità di uccisione delle cellule T cocoltivate con BCAT2 OE, BCAT2 KD e linee cellulari di controllo negativo (n=3 per gruppo). G) L'analisi della citometria a flusso indica diverse attività delle cellule T CD8+ in diversi gruppi di cocoltura (n=3 per gruppo).

Figura 5. Convalida delle relazioni spaziali esclusive delle cellule tumorali BCAT2+ e delle cellule T CD8+ mediante TMA della coorte Xiangya BLCA. A) Immagine IHC di BCAT2 e CD8 nei tipi di TME infiammati e non infiammati. Barra della scala: 50 μm. B) Correlazione tra BCAT2 e CD8 sulla base dei punteggi IHC degli stessi nel TMA complessivo. C) Immagine IF multicolore di BCAT2, CK19, CD8 e indice di combinazione nei tipi di TME infiammati e non infiammati. cellula BCAT2+ (rosa), cellula CK19+ (ciano), cellula CD8+T (arancione) e nucleo della cellula (blu). Barra della scala: 50 μm. D,E) Tassi di coespressione dettagliati delle cellule BCAT2+CK19+ e BCAT2+CD8+ nel campione tipico. F) Analisi del gradiente di distanza (0–25, 25–50, 50–100 e 100–150 μm) di cellule CD8+T attorno alle cellule BCAT2+CK19+ nel tipico campione.

Figura 6. La perdita di BCAT2 aumenta l'efficacia della terapia anti-PD-1. A) Diagramma di flusso del piano di trattamento. B) Tumori raccolti di diversi regimi terapeutici (n=5 per gruppo). C–E) Quantificazione del volume del tumore, del peso corporeo e del tempo di sopravvivenza in diversi regimi terapeutici (n=5 per gruppo). ns: nessun significato; *P< 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. F) Contour plots indicate the proportion of CD8+T cells; G) proportions of GZMB+CD8+T cells, IFN-𝛾+CD8+T cells, TNF- 𝛼+CD8+T cells, and Perforin+CD8+T cells in different therapy regimens. H) Quantified scatter plots exhibit proportion of CD8+T cells; I–L) proportions of GZMB+ CD8+T cells, IFN-𝛾+ CD8+T cells, TNF-𝛼+ CD8+T cells, and Perforin+ CD8+T cells in different therapy regimens (n = 5 per group). ns: no significance; *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001. M, N) IF image and quantified histogram show densities of CD8+T cells in different therapy regimens (n = 3 per group). Scale bar: 20 μm. CD8+T cell (green) and cell nucleus (blue). ns: no significance, *p<0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.

Inoltre, oltre alle cellule tumorali, una piccola percentuale di BCAT2 è espressa anche nelle cellule T CD8+. Pertanto, abbiamo ulteriormente esplorato se il diverso livello di espressione di BCAT2 sulle cellule T CD8+ possa influenzare le loro attività. Dopo aver colorato la sospensione di cellule singole della milza murina con BCAT2 e anticorpi fluorescenti correlati alle cellule T, abbiamo confrontato le proporzioni di cellule CD8+ TNF-𝛼+T e CD8+ IFN-𝛾+T tra BCAT Gruppi 2+CD8+ e BCAT2−CD8+. È interessante notare che abbiamo scoperto che le proporzioni erano simili tra i due gruppi, rivelando che l'attività della cellula T CD8+ è indipendente dal suo livello di espressione di BCAT2 (Figura S22A–C, Informazioni di supporto).

2.6. BCAT2 prevede la risposta all'immunoterapia in diverse coorti di immunoterapia nel mondo reale

I risultati di cui sopra hanno dimostrato un ruolo immunosoppressivo di BCAT2 nella TME e l'effetto sinergico della combinazione della perdita di BCAT2 con la terapia anti-PD-1. Tuttavia, il suo potenziale predittivo sull’efficacia dell’immunoterapia non è chiaro. Pertanto, nella coorte TCGA-BLCA, i punteggi di arricchimento dei percorsi correlati all’immunoterapia sono stati confrontati tra i gruppi con BCAT2 alto e basso. Come mostrato nella Figura S23A (Informazioni di supporto), il gruppo con basso BCAT2 aveva geni più attivi nei percorsi correlati all'immunoterapia, il che può dedurre che una bassa espressione di BCAT2 rappresenta uno stato più sensibile all'immunoterapia. Per ulteriore convalida, 58 pazienti con cancro della vescica muscolo-invasivo (MIBC) che hanno accettato la terapia neoadiuvante anti-PD-1 nel nostro ospedale sono stati inclusi nella coorte di immunoterapia Xiangya BLCA. Immagini rappresentative IHC, IF e CT dei soggetti rispondenti e non rispondenti implicavano che il livello di espressione di BCAT2 ha una stretta relazione con l'efficacia dell'immunoterapia: un individuo con un basso livello di espressione di BCAT2 ha maggiori probabilità di rispondere all'immunoterapia rispetto a un individuo con un livello di espressione basso di BCAT2. alto livello di espressione BCAT2 (Figura 7A–C). Inoltre, il punteggio IHC della coorte di immunoterapia Xiangya BLCA e la matrice di espressione dell'mRNA della coorte IMvigor210 hanno indicato una solida correlazione negativa tra BCAT2 e PD-L1 (R=−{{3{{32} }}}.4, p=0.002; R=−0,41, p < 0,001) (Figura S23B, C, Informazioni di supporto). Pertanto, abbiamo confrontato direttamente l'efficacia dell'immunoterapia tra i gruppi con BCAT2 alto e basso nella coorte di immunoterapia Xiangya BLCA e abbiamo scoperto che il gruppo con BCAT2 basso aveva una percentuale di rispondenti significativamente più elevata rispetto al gruppo con BCAT2 alto (p=0.001) (Figura 7D). Inoltre, abbiamo valutato i valori di previsione di BCAT2, PD-L1 e dell'indice di combinazione (BCAT2+PD-L1) sulla risposta patologica all'immunoterapia e abbiamo riscontrato l'ottima prestazione dell'indice di combinazione (BCAT2+PD- L1) sull'accuratezza della previsione (Figura 7E). In modo interessante, sotto l'aspetto dell'esito della sopravvivenza, il gruppo con BCAT2 basso ha avuto una sopravvivenza libera da malattia (DFS) più lunga rispetto al gruppo con BCAT2 alto (p=0.032) (Figura 7F), dimostrando il valore prognostico di BCAT2 in Immunoterapia BLCA. In ambito clinico, gli individui con TME del deserto hanno maggiori probabilità di avere un’efficacia immunoterapica limitata rispetto agli individui con TME infiammata, evidenziando ulteriormente l’importanza degli indicatori di previsione. Di conseguenza, abbiamo selezionato tutti gli individui affetti da TME del deserto nella coorte IMvigor210 e condotto la valutazione completa. In un confronto diretto del livello di espressione di BCAT2 tra diversi gruppi di risposta, il gruppo CR (risponditore) aveva un livello di espressione di BCAT2 significativamente più basso rispetto ai gruppi SD e PD (non risponditore) (Figura 7G). Ancora più importante, anche l'indice di combinazione (BCAT2+PD-L1) ha avuto prestazioni eccezionali in termini di accuratezza della previsione (Figura 7H). Sebbene non vi sia stata alcuna differenza significativa nella sopravvivenza globale (OS) tra i gruppi con BCAT2 alto e basso nella coorte IMvigor210 di tipo desertico, la tendenza della prognosi era ancora simile all'esito della coorte di immunoterapia Xiangya BLCA (Figura 7I). Oltre al PD-L1, l’instabilità dei microsatelliti (MSI) è l’altro predittore essenziale dell’efficacia dell’immunoterapia. Lo stato di riparazione del disadattamento (MMR): MMR competente (pMMR) e MMR carente (dMMR) mantengono un'elevata conformità con l'MSI a bassa frequenza (MSI-L) e l'MSI ad alta frequenza (MSI-H).[13] Pertanto, abbiamo condotto una valutazione completa di tutti gli individui nella coorte di immunoterapia Xiangya BLCA sulla base dei risultati della colorazione di quattro geni marcatori MMR (MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). L'esito ha rivelato una percentuale significativamente più elevata di dMMR (MSI-H) nel gruppo con BCAT2 basso rispetto al gruppo con BCAT2 alto (p=0.02) (Figura S23D, E, Informazioni di supporto). Inoltre, abbiamo valutato i valori predittivi di MMR, BCAT2 e indice di combinazione (MMR+BCAT2) sull'efficacia dell'immunoterapia e abbiamo scoperto che l'indice di combinazione (MMR+BCAT2) aveva una prestazione idonea sull'accuratezza della previsione (Figura S23F, Informazioni di supporto). Insieme, questi risultati hanno dimostrato che BCAT2 è qualificato per agire come predittore complementare dell’efficacia dell’immunoterapia BLCA. Infine, è stato esplorato il valore predittivo di BCAT2 in risposta all’immunoterapia in vari tipi di cancro. Abbiamo scoperto che gli individui con un'elevata espressione di BCAT2 hanno mostrato un tasso di risposta significativamente più basso (p=0,04) nella coorte GSE35640 (melanoma) (Figura 7J). Sebbene non siano state riscontrate differenze significative nel tasso di risposta tra i gruppi con BCAT2 alto e basso nella coorte GSE173839 (cancro al seno), GSE135222 (NSCLC) e Gide 2019 (melanoma), i pazienti con bassa espressione di BCAT2 avevano ancora maggiori probabilità di avere una risposta positiva all'immunoterapia (Figura 7K-M).

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2.7. Il valore di BCAT2 nella previsione del sottotipo molecolare e nella guida della terapia di precisione

Data la grande eterogeneità esistente nella classificazione istologica tradizionale, prove crescenti hanno dimostrato che il sottotipo molecolare è in grado di fornire una classificazione più accurata sulla base del profilo trascrittomico in BLCA.[14] Inoltre, con caratteristiche immunologiche simili nello stesso sottotipo, la classificazione molecolare ha un grande potenziale per predire la TME e guidare la terapia di precisione in clinica.[15] Attraverso un'analisi completa dei diversi sistemi di sottotipi molecolari nella coorte TCGA-BLCA, abbiamo scoperto che gli individui con bassa espressione di BCAT2 sono più probabilmente classificati in un sottotipo basale, accompagnato da percorsi attivati ​​di differenziazione basale, differenziazione EMT, differenziazione immunitaria, risposta all'interferone, e così via. Gli individui con elevata espressione di BCAT2 sono principalmente classificati in sottotipi luminali, accompagnati da percorsi attivi di differenziazione luminale, differenziazione uroteliale e Ta (Figura S24A, Informazioni di supporto). Secondo il consenso del sottotipo molecolare, il sottotipo basale ha un livello di infiltrazione maggiore di linfociti effettori e una via di segnalazione dell'IFN-𝛾 più attiva rispetto al sottotipo luminale,[16] il che implica una migliore efficacia dell'immunoterapia. Quindi, l'AUC è stata utilizzata per valutare l'accuratezza della previsione. Sorprendentemente, ad eccezione del sistema del sottotipo Baylor (AUC=0.76), la maggior parte dell'AUC era oltre 0.90 in altri sistemi (Figura S24B, Informazioni di supporto), il che significa una solida accuratezza della previsione di BCAT2 in il sottotipo molecolare. Per esplorare ulteriormente il suo ruolo nel predire l’efficacia di altre terapie, abbiamo confrontato l’attività della terapia target del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e i percorsi correlati alla radioterapia tra i gruppi con BCAT2 alto e basso. Con attività ovviamente sovraregolate, i pazienti nel gruppo con BCAT2 basso hanno maggiori probabilità di avere una risposta positiva alla terapia target EGFR e alla radioterapia (Figura S24C, Informazioni di supporto). Per migliorare l'affidabilità della previsione sul sottotipo molecolare e sulla sensibilità al trattamento, otto coorti BLCA (coorte Xiangya BLCA, GSE31684, GSE69795, GSE48075, GSE128702, GSE83586, GSE52329 ed E-MTAB-1803) e una coorte di immunoterapia BLCA (IMvigor210) sono state ha richiesto la convalida esterna. Oltre all’eccellente accuratezza della previsione, in queste coorti sono stati riscontrati risultati simili (figure S25-S27, informazioni di supporto). La malattia iperprogressiva (HPD) è uno stato estremamente insensibile all’immunoterapia. Per esplorare l'influenza del BCAT2 sull'HPD, sono stati raccolti biomarcatori associati all'HPD da studi precedenti[17] e il CNV dei biomarcatori è stato confrontato tra i gruppi con BCAT2 basso e alto. Ad eccezione dell'EGFR, i tassi di amplificazione della CNV di altri biomarcatori associati all'HPD positivi (simbolo rosso) erano più alti nel gruppo con BCAT2 elevato, in particolare MDM2 (p=0,0116). I tassi di eliminazione della CNV dei biomarcatori associati all'HPD negativi (simbolo verde) erano inferiori nel gruppo con BCAT2 elevato (Figura S24D, Informazioni di supporto). Il risultato ha indicato che i pazienti con elevata espressione di BCAT2 hanno un potenziale rischio di HPD durante l’immunoterapia. La chemioterapia neoadiuvante (NAC) è una terapia cruciale nel BLCA. I marcatori che prevedono la risposta alla NAC nei BLCA sono stati raccolti da una revisione di Buttigliero et al.[18] e i loro tassi di mutazione sono stati confrontati tra i due gruppi. Sulla base dei tassi di mutazione complessivi più elevati dei biomarcatori e della mutazione più frequente di RB1 nel gruppo con basso BCAT2, abbiamo ipotizzato che gli individui con bassa espressione di BCAT2 abbiano una migliore efficacia della NAC in ambito clinico (Figura S24E, Informazioni di supporto). Pertanto, il database Drugbank è stato utilizzato per confrontare l'efficacia di diversi regimi chemioterapici comuni tra due gruppi e ha scoperto che gli individui con bassa espressione di BCAT2 hanno maggiori probabilità di rispondere alla chemioterapia. Inoltre, il gruppo con basso BCAT2 ha mostrato anche una migliore efficacia nei regimi comuni di immunoterapia e terapia con ERBB. Inaspettatamente, i pazienti con un'elevata espressione di BCAT2 probabilmente ottengono migliori effetti curativi nella terapia antiangiogenica (Figura S24F, Informazioni di supporto). Collettivamente, gli individui con bassa espressione di BCAT2 appartengono a un sottotipo molecolare infiammato, sottotipo basale, il che significa una risposta più positiva all'immunoterapia, alla chemioterapia, alla radioterapia, alla terapia target EGFR e alla terapia ERBB. Sfortunatamente, i pazienti con un’elevata espressione di BCAT2 hanno una scarsa risposta a questi trattamenti. Tuttavia, la terapia antiangiogenica può rappresentare per loro uno spiraglio di luce.

Figura 7. BCAT2 predice la risposta all’immunoterapia in diverse coorti di immunoterapia nel mondo reale. A) Immagine IHC di BCAT2 e PD-L1 tra pazienti rispondenti e non rispondenti nella coorte di immunoterapia Xiangya BLCA. Barra della scala: 50 μm. B) Immagine IF multicolore di BCAT2 e PD-L1 tra rispondenti e non rispondenti nella coorte di immunoterapia Xiangya BLCA. Barra della scala: 50 μm. cellula BCAT2+(verde), cellula PD-L1+(gialla) e nucleo cellulare (blu). C) Immagine CT della differenza nell'efficacia dell'immunoterapia tra individui con livelli di espressione alti e bassi di BCAT2. La freccia rossa indica l'area del tumore. D) Differenza complessiva nel tasso di risposta tra i gruppi con BCAT2 alto e basso nella coorte di immunoterapia Xiangya BLCA. E) Accuratezza della previsione di BCAT2, PD-L1 e indice di combinazione (BCAT2+PD-L1) sulla risposta all'immunoterapia nella coorte di immunoterapia Xiangya BLCA. F) Differenza nella sopravvivenza libera da malattia (DFS) tra i gruppi con BCAT2 alto e basso nella coorte di immunoterapia Xiangya BLCA. G) Differenze nel livello di espressione di BCAT2 tra i gruppi CR, PR, SD e PD nel tipo desertico della coorte IMvigor210. *p<0,05; ns: nessun significato. H) Accuratezza della previsione di BCAT2, PD-L1 e indice di combinazione (BCAT2+PD-L1) sulla risposta all'immunoterapia in una coorte IMvigor210 di tipo desertico. I) Differenza nella sopravvivenza globale (OS) tra i gruppi con BCAT2 alto e basso in una coorte IMvigor210 di tipo desertico. J-M) Differenze nella risposta all'immunoterapia tra i gruppi BCAT2 alti e bassi nelle coorti GSE35640, GSE173839, GSE135222 e Gide2019.

3. Discussione

Essendo un enzima chiave nel processo di catabolismo dei BCAA, la ricerca precedente si era concentrata principalmente sul ruolo correlato al metabolismo del BCAT2 nelle malattie come l’obesità, il diabete e l’aritmia. Ma et al. hanno dimostrato che l'eliminazione di BCAT2 nel tessuto adiposo può accelerare l'imbrunimento adiposo e la termogenesi, il che porta a una riduzione del tasso di obesità nei topi.[19] Attraverso il rilevamento di campioni di sangue di oltre 2000 individui, Gerszten et al. hanno rappresentato un profilo metabolita correlato al diabete e hanno scoperto che i BCAA trasformati con BCAT2- svolgono un ruolo cruciale nello sviluppo della malattia.[20] Portero et al. ha rivelato che le mutazioni senza senso di BCAT2p.Q300*/p.Q300* determinano livelli elevati di BCAA e inducono aritmie nei topi.[21] Recentemente, un paio di studi hanno scoperto che il BCAT2 ha una stretta relazione con il cancro. Lei et al. ha rivelato che la degradazione mediata dall'acetilazione di BCAT2 può ritardare lo sviluppo dell'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) riducendo il livello del metabolismo dei BCAA.[22] Wang et al. considerato che il livello di trascrizione contenuto di BCAT2 porta ad una diminuzione del livello di glutammato intracellulare, che stimola la ferroptosi delle cellule dell'epatoma.[23] Tuttavia, tutta la ricerca esistente ha enfatizzato l'influenza del catabolismo dei BCAA mediato da BCAT2-sul processo biologico del cancro piuttosto che esplorare un meccanismo completamente nuovo. In questo studio, abbiamo rivelato per la prima volta il ruolo immunosoppressivo di BCAT2 nella TME. L’applicazione dell’immunoterapia ridefinisce il trattamento del cancro, con una straordinaria qualità di vita e un tempo di sopravvivenza prolungato. Tuttavia, a causa dell’eterogeneità del sistema immunitario ecologico del tumore, solo una parte dei soggetti ottiene un’efficacia soddisfacente. La TME è un sistema complicato, composto da cellule tumorali, cellule immunitarie, cellule stromali e capillari.[24] In base al livello di infiltrazione dei CTL, la TME può essere classificata in generale in tipi infiammati e non infiammati.[25] Prove crescenti indicano che la TME infiammatoria svolge un ruolo positivo nel suscitare risposte immunitarie antitumorali efficaci durante la terapia.[26] Pertanto, abbiamo analizzato in modo completo più indicatori correlati alla TME e scoperto che un'elevata espressione di BCAT2 forma una TME non infiammata, con ciclo immunitario del cancro impedito, modello di espressione repressivo del profilo delle chemochine, molecole MHC e livello di infiltrazione insufficiente di TIIC. Inoltre, BCAT2 è correlato negativamente al TIS e ai geni effettori dell'ICB, il che implica che gli individui con un'elevata espressione di BCAT2 hanno maggiori probabilità di non rispondere all'immunoterapia. Per convalidare la nostra ipotesi, abbiamo confrontato il tasso di risposta tra i gruppi con BCAT2 alto e basso nella coorte di immunoterapia Xiangya BLCA e in altre coorti di immunoterapia. Sorprendentemente, sono emerse differenze significative in più coorti, il che indica che BCAT2 è anche in grado di svolgere un ruolo predittivo dell'efficacia dell'immunoterapia, soprattutto nel BLCA. Inoltre, scRNA-seq è stato utilizzato per esplorare il meccanismo di regolazione di BCAT2 nella TME e ha indicato che l'attività delle vie di segnalazione correlate a citochine/chemochine, la via di segnalazione della chemiotassi delle cellule T e la via di segnalazione della migrazione delle cellule T hanno correlazioni negative significative con BCAT2. Essendo una rete di regolazione critica, le citochine e le chemochine sono indispensabili per il traffico di varie cellule immunitarie nella TME. Il sistema delle chemochine ha quattro superfamiglie: C, CC, CXC e CX3C, con notevole ridondanza nell'accoppiamento di ligandi e recettori.[27] Le citochine possono essere suddivise nelle sottofamiglie Th1, Th2 e Th17 in base alla loro funzione biologica.[28] Attraverso la secrezione di diversi livelli, la lotta tra cellule tumorali e cellule immunitarie è sufficiente per riprogrammare le caratteristiche della TME.[29] Tuttavia, tra la maggior parte delle citochine e delle chemochine, è necessario escludere il cluster più prezioso. Utilizzando un pannello di test immunologici per citochine e chemochine, abbiamo rivelato che le chemochine, tra cui CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 e CXCL10, sono fortemente correlate negativamente con l'espressione di BCAT2 nelle cellule di cancro della vescica umana e murina. È noto che CXCL9 e CXCL10 sono responsabili del reclutamento delle cellule T CD8+ nella TME.[30] Per accertare la funzione di CCL3, CCL4 e CCL5, abbiamo consultato ricerche precedenti. Harlin et al. ha utilizzato array di proteine ​​e qPCR per rivelare che la sovraregolazione di CCL3, CCL4 e CCL5 è in grado di promuovere la migrazione delle cellule T CD8+ nel melanoma.[31] Noman et al. hanno scoperto che una maggiore secrezione di CCL5 aiuta a stabilire una TME proinfiammatoria trasportando CTL nel tessuto tumorale del colon-retto.[32] Attraverso l'IHC e l'RNA-seq del profilo delle chemochine in più coorti, Romero et al. hanno dimostrato che CCL4 e CCL5 hanno una forte associazione con il livello di infiltrazione delle cellule T CD8+ nel cancro del pancreas.[33] Pertanto, abbiamo considerato che le chemochine correlate alle cellule T CD8+ sono le principali chemochine regolate da BCAT2 nel cancro della vescica. Sebbene abbiamo dimostrato le robuste correlazioni negative tra BCAT2 e le chemochine correlate alle cellule T CD8+, il meccanismo di regolazione sottostante tra loro deve ancora essere ulteriormente esplorato. Lo studio di Peterson et al. ha dimostrato che l'attivazione della via di segnalazione della MAP chinasi (MAPK) può indurre la produzione di CX3CL1.[34] Xu et al. ha rivelato che la via di segnalazione JAK-STAT regolava la secrezione di chemochine correlate a Th1-, causando una diminuzione del livello di infiltrazione di TIL.[35] Recentemente, Peng et al. hanno scoperto che la demetilasi JMJD3 può inibire l'espressione delle chemochine correlate alle cellule T CD4+ e ridurre il livello di infiltrazione delle cellule T citotossiche nella TME, rappresentando un ruolo cruciale della modifica epigenetica nella regolazione dell'espressione delle chemochine.[36] Mayo et al. ha anche rivelato che un inibitore epigenetico, l'istone deacetilasi 1, ha una grande capacità di sopprimere l'espressione di CXCL8 attraverso l'attivazione della via di segnalazione del fattore nucleare 𝜅B (NF-𝜅B).[37] Inoltre, come simboli del metabolismo delle cellule tumorali, la glicolisi aerobica e le specie reattive dell'ossigeno (ROS), indicano grandi prestazioni nell'indurre l'espressione di CXCL8 e CXCL14 aumentando le attività delle vie di segnalazione di NF-𝜅B e della proteina 1 attivata dall'attivatore del fattore di trascrizione (AP{{93 }}).[38] È interessante notare che, nel nostro studio, le vie di segnalazione di NF-𝜅B, STAT e MAPK erano significativamente arricchite tra le linee cellulari BCAT2 alte e basse (Figura 3K; Figura S16A, B, Informazioni di supporto). Pertanto, combinando gli studi di cui sopra, esploreremo ulteriormente la molecola chiave nel meccanismo di regolazione delle chemochine correlate a BCAT2 e CD8+T. Il tasso di risposta obiettiva limitato della monoterapia con ICB spinge all’avvento di una strategia terapeutica di combinazione. Per convertire la TME non immunologica in TME immunologica, Wolchok et al. ha applicato il trattamento concomitante di nivolumab (terapia anti-PD-1) e ipilimumab (terapia anti-CTLA-4) in pazienti con melanoma e ha riscontrato un effetto curativo incoraggiante, attribuito al priming, all'attivazione e all'uccisione sincroni potenziati dei CTL .[39] Più che combinarsi con un altro tipo di ICB, la chemioterapia più l’immunoterapia rappresentano un’opzione terapeutica alternativa. Come regime di trattamento di prima linea per il carcinoma uroteliale avanzato, un paio di studi hanno scoperto che la chemioterapia a base di cisplatino è in grado di modellare una TME proinfiammatoria aumentando il livello di espressione della classe MHC I sulle cellule dendritiche e danneggiando MDSC e Treg.[40] Casualmente, Homma et al. ha rivelato che un altro farmaco chemioterapico comune per il cancro della vescica, la gemcitabina, può migliorare la quantità di infiltrazione delle cellule T CD8+e compromettere le cellule immunitarie immunosoppressive nella TME.[41] Nel nostro esperimento preclinico sugli animali, il trattamento combinato della perdita di BCAT2 e del mab anti-PD-1 ha mostrato un'efficacia antitumorale più distinta rispetto alla monoterapia con mab anti-PD-1 nei topi immunocompetenti, che fornisce un trattamento innovativo strategia per i pazienti resistenti all’ICB. Nel frattempo, attraverso l'analisi della citometria a flusso e l'IF, abbiamo dimostrato che l'abbattimento di BCAT2 non solo recluta più popolazione di CTL nella TME, ma migliora anche l'attività di uccisione dei CTL. Allo stesso modo, Peng et al. hanno scoperto che la sovraespressione di LGALS2 diminuisce la quantità di CTL infiltranti così come i biomarcatori citotossici nei topi portatori di cancro al seno.[42] Yang et al. ha dimostrato che CXCL13 è in grado di aumentare la risposta all'immunoterapia in modelli murini di cancro ovarico aumentando il livello di infiltrazione delle cellule T CD8+ e il livello di secrezione di GZMB, IFN-𝛾 e IL-2.[43] Accompagnando una risposta antitumorale più forte, la terapia di combinazione sconvolge ulteriormente il ciclo di feedback immunitario esistente, che probabilmente porta a gravi effetti collaterali. Secondo il modello di espressione di BCAT2 a livello di siRNA, specificamente espresso nelle cellule tumorali piuttosto che nelle cellule immunitarie e nelle cellule endoteliali, possiamo preliminarmente dedurre che la perdita di BCAT2 o l'inibitore di BCAT2 hanno meno probabilità di provocare terribili effetti avversi. Tuttavia, il dosaggio ottimale e il tempo di intervallo dell'inibitore BCAT2 e del mab anti-PD-1 nella terapia di combinazione devono ancora essere esplorati.

Per guidare la terapia di precisione negli individui, abbiamo correlato BCAT2 al sottotipo molecolare di BLCA e ai biomarcatori critici di varie terapie. Sulla base di previsioni credibili in più coorti, abbiamo scoperto che l’immunoterapia, la chemioterapia, la radioterapia e la terapia con target EFGR sono adatte per i pazienti con bassa espressione di BCAT2. La terapia antiangiogenica è raccomandata per i pazienti con elevata espressione di BCAT2. Diversamente dal complicato processo di rilevamento dei sottotipi molecolari, BCAT2 è un predittore portatile per la terapia di precisione. Inevitabilmente, ci sono alcune limitazioni nei nostri studi. Innanzitutto, le dimensioni del campione e il tempo di follow-up della coorte Xiangya BLCA e della coorte immunoterapica Xiangya BLCA erano limitati. Dobbiamo ampliare ulteriormente la dimensione del campione e continuare il follow-up standardizzato. In secondo luogo, come coorte del mondo reale, la coorte di immunoterapia Xiangya BLCA conteneva diverse opzioni chirurgiche che probabilmente causavano un potenziale bias. Amplieremo ulteriormente la nostra coorte e condurremo un'analisi dei sottogruppi basata sulla stessa opzione chirurgica. In terzo luogo, l’effetto cooperativo della terapia di combinazione in vivo deve essere ulteriormente convalidato utilizzando l’applicazione sistemica dell’inibitore BCAT2. In sintesi, come ruolo immunosoppressivo nella TME del BLCA, BCAT2 è un bersaglio emergente nella terapia combinata di ICB e un biomarcatore accurato della terapia di precisione.

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4. Sezione Sperimentale

cohort: As illustrated in a previous study,[44] 56 eligible BLCA patients accepted surgical treatment (TURBT (transurethral resection of bladder tumor) or radical cystectomy) in Xiangya Hospital. All the samples were conducted through high throughput RNA sequencing (RNA-seq) to acquire transcriptome information. Then, data on RNA-seq, clinicopathologic features, and follow-up information of these patients were utilized to construct the Xiangya BLCA cohort (Table S1, Supporting Information). Xiangya BLCA immunotherapy cohort: 58 MIBC patients were included in the Xiangya BLCA immunotherapy cohort. All the samples were obtained by diagnostic TURBT before the implementation of neoadjuvant anti-PD-1 therapy. After at least two cycles standard neoadjuvant immunotherapy (NAI), TURBT, or radical cystectomy (RC) were conducted based on treatment response and patients' willingness. 17 individuals with complete response (CR) and 16 individuals with partial response (PR) were classified into responders, 17 individuals with stable disease (SD), and 8 individuals with progressive disease (PD) were classified into nonresponders. The detailed clinicopathological characteristics are listed in Table S2 (Supporting Information). Xiangya scRNA cohort: Three samples of muscle-invasive bladder cancer were implemented scRNA-seq, constituting the Xiangya scRNA cohort. Detailed preparation of single-cell suspension, data transformation, and cell quality control have been elaborated in previous articles.[45] In simple terms, three tumor samples were loaded on a Chromium Single Cell Controller instrument (10×Genomics, USA) to produce single-cell gel beads in suspension. Seurat R package was applied to transform the count matrix into Seurat format. Four standards were set up for excluding low-quality cells in the matrix: unique molecular identifier (UMI) amount < 1000, gene quantity < 200, log10GenesPerUMI < 0.70, and mitochondrial-originated UMI counts > 20%. After integrating the samples based on the top 3000 variable traits, principal component analysis (PCA) and the Findclusters algorithm were employed to identify main cell clusters. Based on the level of copy number variation (CNV) in epithelial cells, malignant bladder carcinoma cells were selected from clusters. The study plan was approved by the ethics committee of Xiangya Hospital, Central South University (Item number: 2021101175). All the specific men were collected complying with informed consent rights. The Cancer Genome Atlas (TCGA) Database: RNA expression matrix, survival outcome, and CNV of 33 types of carcinomas were acquired from the UCSC Xena database. Log2 transformation was employed to normalize RNA-seq data and the GISTIC algorithm was applied to process CNV data. Gene Expression Omnibus (GEO) Database: Transcriptome data of 1740 samples from nine BLCA cohorts: GSE31684 (93 samples), GSE48075 (142 samples), GSE69795(61 samples), GSE32894 (308 samples), GSE48276 (116 samples), GSE83586 (307 samples), GSE86411 (132 samples), GSE52329 (20 samples), GSE87304 (305 samples), and GSE128702 (256 samples) were obtained from GEO database. RNA-seq data of three immunotherapy cohorts: GSE35640 (14 samples, melanoma, and MAGE-A3 therapy), GSE173839 (105 samples, breast cancer, and anti-PD-L1 therapy), and GSE135222 (27 samples, nonsmall cell lung carcinoma (NSCLC), and anti-PD-1/PD-L1 therapy) were downloaded from GEO database. Single-cell transcriptomic characterization of two BLCA scRNA cohorts: GSE135337 (8 samples) and GSE145137 (3 samples) was obtained from the GEO database. Data processing was similar to the Xiangya siRNA cohort. Other Databases: RNA expression matrix and clinicopathologic characteristics of immunotherapy cohorts: IMvigor210 (348 samples, bladder cancer, and anti-PD-1 therapy) and Gide2019 (58 samples, melanoma, anti-PD-1, or anti-CTLA-4 therapy) were collected from http://researchpub.gene.com/IMvigor210CoreBiologies and TIDE database (http://tide. dfci.harvard.edu/). Data of RNA-seq and clinical characteristics of a BLCA cohort—E-MTAB-1803 (85 samples)—was downloaded from ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/). BCAT2 expression levels in various types of cancer cell lines were downloaded from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database. Specific clinicopathologic and follow-up information from public databases were listed in our previous studies.[44,46] Assessment of Immunological Identity of TME in BLCA: As depicted in our previous study,[44] a comprehensive evaluation of the immunological trait of TME in BLCA was summarized. The tracking tumor immunophenotype (TIP) website (http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/) was used to assess the activities of cancer immunity cycles, which reflected the effectiveness of antitumor immunity. It is separated into seven concrete steps: release and presentation of tumor antigen (steps 1 and 2), startup and activation of effector T cells (step 3), trafficking and assisting diverse immune cells into TME (steps 4 and 5), recognition and killing cancer cells (steps 6 and 7).[47] Six independent algorithms (TIMER, CIBERSORT, CIBERSORT-ABS, MCP-COUNTER, TISIDB, and XCELL) were employed to calculate the infiltration levels of tumor-infiltrating immune cells (TIICs).[48] Furthermore, effector genes of immune cells, ligands and receptors of chemokines, major histocompatibility complex (MHC) molecules, and immunostimulators were collected for evaluating immunological characteristics of TME multi-dimensionally. T cell-inflamed score (TIS) and markers of ICB were utilized to assess the host sensitivity state to immunotherapy.[49] Enrichment Pathways Analysis: Limma R package with empirical Bayesian function was employed to screen differentially expressed genes (DEGs) between high and low expression of BCAT2 in the RNA expression matrix.[50] Screening thresholds were |log (fold change) (log FC) |>1,5 e il valore p corretto < 0.05. Le analisi Gene Ontology (GO) e Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) sono state condotte sui DEG identificati dal pacchetto ClusterProfiler R.[51] Il pacchetto Seurat R con l'algoritmo Findmarker è stato applicato per calcolare il livello di espressione di BCAT2 sulle cellule epiteliali in scRNA-seq. Sulla base della classificazione dell'espressione genica varia in base al valore di fold change (FC), è stata implementata l'analisi di arricchimento del set di geni (GSEA) per giudicare le correlazioni positive e negative. Identificazione dei DEG immuno-correlati: il pacchetto ESTIMATE R è stato impiegato per calcolare i punteggi immunitari e stromali nella coorte TCGA-BLCA. In base al valore mediano di due punteggi e al livello di espressione di BCAT2, è stato applicato il pacchetto Limma R per identificare DEG positivi/negativi correlati al sistema immunitario e correlati allo stroma. Il pacchetto R del diagramma di Venn è stato utilizzato per prendere l'intersezione di vari gruppi e accertarsi dei DEG comuni. Classificazione degli individui utilizzando sottotipi molecolari di BLCA: sette sottotipi molecolari di BLCA (UNC, Baylor, TCGA, MDA, Lund, CIT e Consensus) sono stati ampiamente applicati in ambito clinico per valutare le caratteristiche della TME e l'efficacia di varie terapie.[52] In considerazione della complessa interazione dei vari sottotipi, li abbiamo divisi collettivamente in due categorie principali: sottotipi basali e luminali.[16] I pacchetti R di sottotipizzazione Consensus MIBC e BLCA sono stati impiegati per classificare gli individui in sottotipi specifici. Dopo la normalizzazione, l'area sotto la curva ROC (AUC) è stata utilizzata per valutare l'affidabilità di BCAT2 nel predire la classificazione. Valutazione della terapia di precisione dei pazienti: come illustrato nel nostro studio precedente,[53] una serie di firme genetiche critiche, che possono prevedere l'efficacia della chemioterapia, della radioterapia, della terapia mirata e dell'immunoterapia, sono state raccolte da diversi studi e database.[16, 54] L'algoritmo ssGSEA è stato utilizzato per calcolare i punteggi di arricchimento delle firme genetiche.[55] Linee cellulari: cellule di cancro della vescica umana (T24) e cellule di cancro della vescica murina (MB49) sono state acquistate rispettivamente da Procell Life Science & Technology (Wuhan, Cina) e Meisen CTCC (Jinhua, Cina). Sono stati mantenuti in terreno DMEM (BasalMedia, Cina) con 10% di siero bovino fetale (FBS) (BI, Israele), 1% di penicillina e streptomicina (NCM Biotech, Cina) e coltivati ​​in un'incubatrice a 37 grado di temperatura contenente il 5% di CO2. Costruzione e RNA-seq di cellule di trasfezione stabili: il vettore lentivirale plenti-BCAT2-flag-puromicina (GV341) è stato progettato e costruito da GeneChem (Shanghai, Cina) per la sovraespressione stabile di BCAT2-(BCAT2 OE) linea cellulare e il suo controllo negativo (vettore oe). Inoltre, l'RNA BCAT2- short hairpin (shRNA) è stato clonato nel vettore lentivirale GV112- da GeneChem (Shanghai, Cina) per una linea cellulare stabile BCAT2-knock down (BCAT2 KD) . Le sequenze target di shRNA erano elencate nella Tabella S3 (Informazioni di supporto). Quindi, i lentivirus ricombinanti BCAT2 sono stati trasfettati in cellule oggettive secondo le istruzioni del produttore. 2 ug mL−1 di puromicina (Amersco, USA) sono stati impiegati per filtrare le cellule di trasfezione stabili per tre giorni. Per convalidare l'efficacia della trasfezione sono stati applicati Western blot e PCR quantitativa a trascrizione inversa (qRT-PCR). Alla fine, è stata scelta una cellula di trasfezione stabile con la migliore efficacia per RNA-seq e ulteriori esperimenti. Tre campioni duplicati di ciascuna linea cellulare sono stati inviati alla piattaforma BGI RNA-seq (Shenzhen, Cina). I criteri per la selezione dei DEG e l'analisi dei percorsi di arricchimento erano gli stessi illustrati in 2.3 (analisi dei percorsi di arricchimento). Saggi immunologici multipli ProcartaPlex per la rilevazione del livello di secrezione di chemochine e citochine delle linee cellulari tumorali: pannello di dosaggio immunologico ProcartaPlex umano (Cat: EPX340-12167-901) e pannello di dosaggio immunologico ProcartaPlex per topi (Cat: EPX{{50}}) sono stati acquistati da ThermoFisher Scientific (Massachusetts, USA) per rilevare i livelli di espressione proteica di oltre 30 chemochine e citochine cruciali nelle cellule tumorali trasfette stabili. In breve, i surnatanti delle colture cellulari sono stati raccolti da una piastra a pozzetti 24- e centrifugati per rimuovere cellule e detriti cellulari. Quindi, i surnatanti chiarificanti sono stati incubati con perline nel pannello seguendo le istruzioni del produttore. La piattaforma di rilevamento Luminex (ThermoFisher Scientific, USA) è stata utilizzata per eseguire analisi quantitative su ciascun campione. Gli indicatori non rilevati sono stati esclusi dall’analisi. qRT-PCR: L'RNA totale è stato isolato dalle cellule con Cell Total RNA Isolation Kit e Animal Total RNA Isolation Kit (Foregene, Cina) secondo il protocollo del produttore. Il cDNA è stato sintetizzato utilizzando il sistema UeIris II RTPCR per la sintesi del cDNA del primo filamento (US Everbright, Cina). qRTPCR è stato eseguito utilizzando SYBR Green qPCR Master Mix (US Everbright, Cina) su CFX Connect System (Bio-Rad, USA). GAPDH è stato utilizzato come controllo standard interno. I primer sono stati progettati e sintetizzati da Sangon Biotech (Shanghai, Cina) e le sequenze dettagliate dei primer sono state elencate nella Tabella S4 (Informazioni di supporto). ELISA: le concentrazioni di CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 (MIG) e CXCL10 (IP10) nei surnatanti di colture cellulari di cancro della vescica umana sono state determinate mediante kit ELISA umani seguendo il protocollo del produttore (Proteintech, USA). Per misurare i valori di densità ottica (OD) è stato utilizzato un lettore di micropiastre biotecnologico (ThermoFisher Scientific, USA). In considerazione dell'enorme diversità dei livelli di secrezione tra le diverse citochine e chemochine, abbiamo condotto la standardizzazione dei dati (trasformazione log 2) prima dell'analisi. Western Blot: tampone RIPA (NCM biotech, Cina) addizionato con un cocktail di inibitori della proteasi all'1% (NCM biotech, Cina) è stato utilizzato per lisare le cellule. Per determinare le concentrazioni proteiche è stato utilizzato il kit BCA Protein Assay (NCM biotech, Cina). Dopo essere state trasferite su membrane in PVDF, le proteine ​​cellulari sono state incubate successivamente con anticorpi primari e specifici anticorpi secondari coniugati con HRP. I segnali sono stati catturati dal sistema di imaging XRS (Bio-Rad, USA). Gli anticorpi primari includono un anticorpo anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA) e un anticorpo anti-GAPDH (Cat: ab8245, Abcam, USA). Gli anticorpi secondari includono IgG anti-coniglio di capra HRP (Cat: 7074, Cell Signaling Technology, USA) e IgG anti-topo di capra HRP (Cat: 7076, Cell Signaling Technology, USA). Saggio di uccisione delle cellule tumorali mediate dai linfociti T e test di cocoltura: i campioni di sangue sono stati raccolti da 10 donatori sani nel nostro ospedale. Secondo le istruzioni del produttore, è stata utilizzata la centrifugazione su gradiente per estrarre le cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) mediante Lymphoprep (Cat: 07851, StemCell Technologies, USA). Inoltre, per eliminare i globuli rossi mescolati con PBMC è stato utilizzato il Red Blood Cell Lysis Buffer (Solarbio, Cina). Per attivare le cellule T, le PBMC sono state coltivate in terreno DMEM (Gibco, USA), integrando IL umana ricombinante- 2 (10 ng mL−1, Cat: 202-1L-050, R&D , USA) e attivatore di cellule T CD3/CD28/CD2 umane ImmunoCult (25 μL mL−1, Cat: 10970; STEMCELL Technologies, USA) per 1 settimana. Con un rapporto di 1:5, le cellule tumorali della vescica umana (BCAT2-OE, BCAT2-KD e i relativi controlli negativi) sono state coltivate in cocoltura con cellule T attivate in terreno DMEM con anticorpo anti-CD3 (100 ng mL−1, Thermo Scientific, USA) e IL-2 (10 ng mL−1) da un donatore in una piastra a pozzetti 12- per 72 ore. Quindi, le cellule T sono state raccolte per l'analisi di citometria a flusso. La strategia dettagliata dell'analisi del flusso è mostrata nella Figura S28 (Informazioni di supporto). Le restanti cellule tumorali sono state colorate con cristalvioletto e il valore OD misurato a 570 nm mediante un lettore di micropiastre. Gli anticorpi per l'analisi in citometria a flusso includono Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, USA), CD45 antiumano APC/Cy7 (Cat: 368516, Biolegend, USA), Anticorpo CD3 antiumano Pacific Blue (Cat: 300329, Biolegend, USA), anticorpo CD4 antiumano PerCP/Cy5.5 (Cat: 317427, Biolegend, USA), anticorpo CD8a antiumano FITC (Cat: 301006, Biolegend, USA), anticorpo TNF-umano PE/Dazzle 594 𝛼 Anticorpo (Cat: 502946, Biolegend, USA) e Brilliant Violet 711 anti-umano IFN- 𝛾 Anticorpo (Cat: 502540, Biolegend, USA). Saggio di chemiotassi: il test di chemiotassi è stato implementato in una piastra transwell 24-con diametro del nucleo di 3 μm (Corning, USA). Per estrarre le cellule CD8+T dalle PBMC è stato utilizzato un kit di isolamento delle cellule CD8+T umane (Cat: 480012, Biolegend, USA). 1 × 105 cellule isolate in un volume di 200 μL sono state aggiunte nella camera superiore e 600 μL di surnatanti di diverse linee cellulari di trasfezione stabili sono stati aggiunti nella camera inferiore. Dopo l'incubazione per 6 ore a 37 gradi, le cellule migrarono nella camera inferiore e furono raccolte e contate mediante citometria a flusso. Saggi di proliferazione, migrazione e invasione cellulare: per valutare la capacità di proliferazione cellulare è stato utilizzato un test di formazione di colonie su piastra. BCAT2-OE, BCAT2-KD e cellule tumorali della vescica umana di controllo negativo sono state coltivate in piastre 6-per pozzetto. Dopo l'incubazione in atmosfera umidificata a 37 gradi per 2 settimane, le colonie sono state fissate e colorate rispettivamente con paraformaldeide e cristalvioletto. Sono state impiegate camere transwell con inserti di membrana in policarbonato con pori da 8,0 μm (Corning, USA) per valutare la capacità di migrazione e invasione cellulare in vitro. 1 × 105 cellule trasfettate stabili sono state sospese in un mezzo privo di siero e seminate nella camera superiore con o senza Matrigel (Corning, USA), per il test di invasione e migrazione separatamente. Dopo aver incubato per 24 ore (saggio di migrazione) e 48 ore (saggio di invasione), le cellule aderenti alla superficie inferiore della membrana sono state fissate e colorate. Le cellule rimaste nella camera superiore sono state rimosse mediante tamponi. Cinque campi casuali sono stati selezionati al microscopio per calcolare il numero di cellule. Immunofluorescenza (IF) e immunoistochimica (IHC): l'IF multicolore sui TMA della coorte Xiangya BLCA e della coorte immunoterapica Xiangya BLCA è stato implementato mediante kit di colorazione immunoistochimica fluorescente multipla (Absin, Cina). In breve, dopo la deparaffinazione, la reidratazione e il rinnovamento dell'antigene, la TMA è stata incubata con anticorpi primari e anticorpi secondari che inducono il legame di diverse luciferine mediante amplificazione del segnale della tiramide (TSA). Dopo aver eliminato gli anticorpi non legati con tampone citrato, il processo di incubazione è stato ripetuto due volte. DAPI è stato utilizzato per contrastare la colorazione dei nuclei cellulari e le immagini sono state scansionate dalla piattaforma Pannoramic MIDI (3DHISTECH, Ungheria). Gli anticorpi primari sulla TMA della coorte Xiangya BLCA includono anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA), anti-citocheratina 19 (CK19) (Cat: ab52625, Abcam, USA), anti-CD8 (Cat: ab237709, Abcam, USA ) e DAPI (Invitrogen, USA). Gli anticorpi secondari e il fluorocromo sul TMA della coorte Xiangya BLCA includono HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG, Absin 520 TSA Plus, Absin 570 TSA Plus, Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). Gli anticorpi primari sulla TMA della coorte di immunoterapia Xiangya BLCA includono anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, USA) e DAPI (Invitrogen, USA). Gli anticorpi secondari e il fluorocromo sul TMA della coorte di immunoterapia Xiangya BLCA includono HRP Goat Anti-Rabbit/Mouse IgG, Absin 520 TSA Plus e Absin 650 TSA Plus (abs50012, Absin). L'IF su tessuti tumorali murini è stato incubato con l'anticorpo primario - anti-CD8 (Cat: 372902, BioLegend, USA) - e l'anticorpo secondario - coniugato colorante anti-topo Alexa Fluor 488 (Invitrogen, USA) in sequenza. DAPI è stato applicato al nucleo cellulare visualizzato. Cinque campi casuali sono stati selezionati al microscopio per calcolare il numero di cellule con colorazione positiva. L'IHC sui TMA della coorte Xiangya BLCA e della coorte immunoterapica Xiangya BLCA è stato condotto mediante il kit SP-9000 (ZSGB-BIO, Cina). Dopo il recupero e il blocco dell'antigene, gli anticorpi primari e gli anticorpi secondari sono stati incubati a turno con i tessuti tumorali. Quindi, la diamminobenzidina (DAB) è stata applicata agli antigeni bersaglio coloranti. Il segnale marrone è stato considerato una colorazione positiva. Punteggio dell'intensità della colorazione (assente=0, debole=1, moderato=2 e forte=3) moltiplicando il punteggio della percentuale positiva (nessuna colorazione=0, colorazione delle cellule meno del 25%=1, 25%–50% di cellule colorate=2, 50%–75% di cellule colorate=3 e cellule colorate più del 75%=4) era punteggio IHC finale dei campioni. I punteggi di BCAT2/CD8/PD-L1 inferiori a sei punti sono stati classificati come bassa espressione, i punteggi maggiori o uguali a sei punti sono stati classificati come alta espressione. Per giudicare lo stato di un individuo rispetto all'MMR, tutti i campioni della coorte di immunoterapia Xiangya BLCA sono stati valutati sulla base dei risultati della colorazione di quattro geni marcatori dell'MMR (MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2). Come illustrato negli studi precedenti,[56] quando tutti e quattro i geni marcatori risultavano colorati positivamente, l'individuo veniva contrassegnato come MMR. Quando uno qualsiasi dei quattro geni marcatori presentava una colorazione negativa, l'individuo veniva contrassegnato come dMMR. Due patologi indipendenti sono stati invitati a condurre la valutazione. Gli anticorpi includono: anti-BCAT2 (Cat: ab95976, Abcam, USA), anti-CD8 (Cat: ab4055, Abcam, USA), anti-PD-L1 (Cat: ab213524, Abcam, USA), anti-MLH1 (Cat: A4858, Abcolonal, Cina), anti-MSH2 (Cat: A22177, Abcolonal, Cina), anti-MSH6 (Cat: A16381, Abcolonal, Cina), anti-PMS2 (Cat: A4577, Abcolonal, Cina) e HRP Goat Anti -IgG di coniglio/topo (ZSGB-BIO, Cina). Analisi panoramiche TissueFAXS dell'interazione spaziale nella TME: per valutare l'interazione spaziale delle cellule maligne BCAT2+ e delle cellule T effettrici, la piattaforma panoramica TissueFAXS (Tissue Gnostics, Austria) è stata utilizzata per scansionare e analizzare in modo semiautomatico le cellule obiettivo colorate mediante IF multicolore su TMA della coorte Xiangya BLCA. Il TMA era costituito da biopsie di 1,5 mm provenienti da campioni di tessuti tumorali inclusi in paraffina. Nel dettaglio, le cellule BCAT2+, le cellule maligne e le cellule CD8+T sono state colorate con specifici anticorpi primari e anticorpi secondari. DAPI (Invitrogen, USA) è stato utilizzato per colorare il nucleo cellulare. Passaggi dettagliati sono stati descritti nello studio di Makarevic et al.[57] In breve, in base all'intensità di fluorescenza di diversi indicatori e alle proprietà fisiche delle cellule, le cellule positive sono state contrassegnate e quantificate. Ancora più importante, le distribuzioni spaziali delle cellule CD8+T attorno alle cellule BCAT2+CK19+ sono state rappresentate da grafici a dispersione sulla base della distanza spaziale (0–25, 25–50, 50– 100 e 100–150 μm). Due patologi esperti sono stati invitati a verificare l'esito decisionale della piattaforma panoramica TissueFAXS. Esperimenti sugli animali: topi C57BL/6 femmine (6-7 settimane) sono stati ottenuti dal Department of Laboratory Animal, Central South University. Tutte le operazioni sui topi sono state controllate e approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'ospedale Xiangya, Central South University (numero articolo: 2021101175). Soprattutto, per studiare il ruolo di BCAT2 sulla crescita del tumore in vivo, le cellule BCAT2 KD MB49 (5 × 105) e le sue cellule di controllo in un volume medio di 100 μL sono state iniettate per via sottocutanea nel fianco destro dei topi. Inoltre, dopo aver costruito con successo un modello di tumore sottocutaneo (volume del tumore fino a 100 mm3), 100 ug di anti-topo InVivomAb PD-1 (Cat: BE0146, Bioxcell, USA) e controllo isotipico IgG2a (Cat: BE0089, Bioxcell, USA) sono stati iniettati per via intraperitoneale in ciascun topo, per valutare l'effetto sinergico della perdita di BCAT2 e della terapia anti-PD-1. La terapia anti-PD-1 è stata implementata sui topi ogni 3 giorni ed è durata fino a cinque cicli. Inoltre, per valutare se l'effetto cooperativo del cotrattamento dipendesse dalle cellule T CD8+. La terapia combinata di accompagnamento, 100 ug InVivoPlus anti-topo CD8𝛼 (Cat: BP0117, Bioxcell, USA) e il controllo dell'isotipo IgG2b (Cat: BP0090, Bioxcell, USA) sono stati impiegati per ridurre le cellule T CD8+ nei topi. Il peso corporeo dei topi è stato registrato ogni tre giorni. Alla data prevista, i tumori sono stati raccolti, misurati e preparati per l'analisi di citometria a flusso, la colorazione IF e la qRT-PCR. Per esplorare l'interazione tra il livello di espressione di BCAT2 sulle cellule T CD8+ e l'attività delle cellule T CD8+, sono state analizzate le milze di topi femmine C57BL/6 (6-7 settimane) senza tumore dissociato e preparato per la sospensione unicellulare per ulteriori analisi. Analisi di citometria a flusso: i tumori murini sono stati macinati e digeriti in sospensione unicellulare mediante collagenasi IV (Cat: C5138, Sigma, USA), ialuronidasi (Cat: H3506, Sigma, USA) e DNasi I (Cat: DN25, Sigma, USA ). Sono stati utilizzati filtri cellulari da 70 μm (BIOFIL, Cina) per filtrare le impurità ed è stato impiegato un contatore di cellule (Countstar, Cina) per ottenere (3–5) × 106 cellule in ciascun campione. Dopo aver identificato le cellule vive utilizzando Zombie Aqua Fixable Viability Kit (Cat: 423101, Biolegend, USA) e bloccando il recettore Fc con anticorpo anti-topo CD16/32 (Cat: 156603, Biolegend, USA), gli antigeni della membrana cellulare sono stati colorati con APC-Cy7 anti-topo CD45 (Cat: 103116, Biolegend, USA), anti-topo BV421 CD3 (Cat: 100341, Biolegend, USA), anti-topo BV605 CD8a (Cat: 100744, Biolegend, USA) e anti-topo PerCPCy5.5 CD4 (Cat: 100540, Biolegend, USA). Quindi, è stato utilizzato il set di tamponi di colorazione Foxp3/Transcription Factor (Cat: 2400632, Invitrogen, USA) per fissare e permeabilizzare la membrana cellulare e nucleare. Gli antigeni correlati all'effetto citotossico sono stati colorati con Granzyme B antiumano/topo PE (Cat: 372208, Biolegend, USA), anti-topo TNF-𝛼 PE-Cy7 (Cat: 506324, Biolegend, USA), anti-Dazzle 594 PE- mouse IFN-𝛾 (Cat: 505846, Biolegend, USA), anti-topo Perforin APC (Cat: 154304, Biolegend, USA). La strategia di gating dell'analisi della citometria a flusso è mostrata nella Figura S29 (Informazioni di supporto). L'anticorpo BCAT2 umano/topo (Cat: A7426, Abclonal, Cina) è stato incubato con il kit di etichettatura degli anticorpi flessibile 488 (Cat: KFA001, Proteintech, USA) per sintetizzare l'anticorpo fluorescente BCAT2 personalizzato per l'analisi della citometria a flusso. Quindi, l'anticorpo BCAT2 e gli anticorpi correlati alle cellule T sono stati miscelati e aggiunti in sospensione monocellulare di milza murina per esplorare l'interazione tra il livello di espressione di BCAT2 sulle cellule T CD8+ e l'attività di CD{{357} }cellula T. La strategia di gating dell'analisi della citometria a flusso è mostrata nella Figura S30 (Informazioni di supporto). I campioni colorati sono stati rilevati sulla citometria a flusso Cytek DxpAthena (Cytek Biosciences, USA) e i dati sono stati analizzati dal software Flowjo versione (BD Biosciences, USA). Analisi statistica: i dati sono stati presentati come media ± DS. Il test t con o senza correzione Welch è stato utilizzato per confrontare le variabili continue tra due gruppi. Per confrontare variabili continue tra più gruppi è stata utilizzata l'analisi ANOVA unidirezionale con o senza test di Brown-Forsythe e Welch. Per confrontare le variabili dicotomiche è stato applicato il test chi quadrato o il test esatto di Fisher. Per stimare l’intensità della correlazione tra le diverse variabili è stato utilizzato il test dei coefficienti di correlazione di Pearson o Spearman. La curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier è stata utilizzata per mostrare analisi prognostiche di variabili dicotomiche e il test dei ranghi logaritmici è stato utilizzato per giudicare le differenze statistiche. P bilaterale < 0,05 è stato definito come soglia di significatività. Per elaborare i dati nello studio sono stati applicati il ​​software R (versione 4.0) e GraphPad Prism8.

Riferimento

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