Effetti benefici della frazione di glicoside feniletanoide totale isolata da Cistanche Deserticola sulla microstruttura ossea in ratti ovariectomizzati

Lingling Yang, Shuqin Ding, Bo Zhang, Jingjing Liu, Yanhong Dong, Qiwen Tang, Pingping Yang e Xueqin Ma

1 Dipartimento di Analisi Farmaceutiche, Scuola di Farmacia, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, Cina

2 Scuola di Medicina Clinica, Ningxia Medical University, 692 Shenli Street, Yinchuan 750004, Cina

3 Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministero dell'Istruzione, Ningxia Medical University, 1160 Shenli Street, Yinchuan 750004, Cina

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Astratto

Il presente studio è stato progettato per stimare l'attività antiosteoporotica della frazione di glicoside feniletanoide totale isolata daCistanchedesertico(CDP) su ratti indotta da ovariectomia (OVX) nonché i relativi meccanismi. Dopo 3 mesi di somministrazione orale, la ridotta densità minerale ossea, Ca e P sierico nei ratti OVX sono stati recuperati e la microarchitettura ossea trabecolare deteriorata è stata in parte migliorata dall'intervento di Cistanche deserticola (60, 120 e 240 mg/kg), le attività dei marker di riassorbimento osseo sono stati sottoregolati e il bioattivo dell'indice di formazione ossea è stato sovraregolato; nel frattempo, il contenuto di MDA è stato ridotto e il GSH è stato aumentato dal trattamento con CDP. Dal punto di vista compositivo, sono stati identificati 8 composti glicosidici feniletanoidiCistanchedesertico(CDP), con il contenuto totale quantificato come 50,3 percento utilizzando il metodo HPLC. Meccanicamente,Cistanchedesertico(CDP) ha diminuito i livelli di TRAF6, RANKL e RANK, sopprimendo così l'attivazione indotta da RANKL/RANK/TRAF6- delle vie di segnalazione a valle di NF-κB e PI3K/AKT e, infine, prevenendo le attività delle principali proteine ​​osteoclastogeniche di NFAT2 e c -Fos. Tutti i dati di cui sopra implicavano che CDP mostrasse effetti benefici sulla microstruttura ossea nei ratti ovariectomizzati e questi effetti potrebbero essere correlati alle vie di segnalazione NF-κB e PI3K/AKT che sono state attivate dal legame di RANKL, RANK e TRAF6.

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1. Introduzione

L'osteoporosi postmenopausale, in cui soffre 1 donna su 3 di età superiore ai 50 anni, sta diventando il principale rischio per la salute che affligge oltre 200 milioni di donne in tutto il mondo [1]. In menopausa, il forte calo del livello di estrogeni porta solitamente ad un eccessivo riassorbimento osseo causato da un'aumentata osteoclastogenesi; quindi, l'equilibrio tra la formazione ossea indotta dagli osteoblasti e il riassorbimento osseo indotto dagli osteoclasti è stato interrotto e il riassorbimento osseo accelerato alla fine ha causato l'osteoporosi e persino la frattura dell'anca o della colonna vertebrale [2]. Si credeva che la differenziazione dell'osteoclasta fosse innescata quando l'attivatore del recettore del fattore nucleare kappa B (RANK) era legato a RANKL, il ligando di RANK. Tuttavia, la combinazione di RANK e RANKL non può essere attivata a meno che non sia stato aggiunto il fattore 6 associato al recettore del fattore di necrosi tumorale proteico (TRAF6) [3], seguito dalla stimolazione delle vie di segnalazione a valle tra cui PI3K/AKT e NF-κB. Infine, le espressioni del fattore nucleare delle cellule T attivate c2 (NFAT2) e c-Fos sono state regolate [4] per modulare la differenziazione degli osteoclasti e il riassorbimento osseo. Pertanto, i fattori e i regolatori che sono direttamente o indirettamente correlati all'attivazione e alla differenziazione degli osteoclasti sono stati ritenuti bersagli cruciali per prevenire la perdita ossea.

Esistono infatti alcuni farmaci per la terapia ormonale sostitutiva clinica e sintetica come l'estradiolo valerato che sono efficaci nel trattamento dell'osteoporosi postmenopausale. Sfortunatamente, alcuni di questi hanno aumentato il rischio di tumori gravi, inclusi i tumori della mammella e dell'endometrio [5], che ne hanno limitato le applicazioni cliniche. Pertanto, è necessario selezionare altre alternative con efficacia e effetti collaterali minimi. Le medicine tradizionali cinesi (MTC), così come i composti e le frazioni bioattive isolate [6-9], si sono dimostrati efficaci su vari disturbi, inclusa l'osteoporosi postmenopausale. Tra questi componenti e frazioni bioattive, i composti del glicoside feniletanoide (PhG) con potenziale efficacia sono stati ritenuti agenti promettenti per il trattamento dell'osteoporosi [10-12]. Le strutture dei PhG sono costituite da acido cinnamico aglicone, un gruppo idrossilfeniletilico che è combinato con -glucopiranosio, apiosio, galattosio, ramnosio o xilosio tramite un legame glicosidico. Esistono ampiamente nelle specie medicinali del genereCistanche[13]. CistanchedeserticoYC Ma è una MTC ufficiale che è registrata nella farmacopea cinese e, oltre ad essere un'importante MTC [14], la C deserticola è anche un'erba tonica antietà con pochi effetti collaterali che è stata sviluppata in liquore medicinale e liquido nutritivo approvato dallo State Food e la somministrazione di farmaci. Sulla base del record della farmacopea cinese, C. deserticola era stata tradizionalmente utilizzata dai nativi per gestire problemi di carenza di essenza renale come debolezza muscolare e debolezza lombare, e i composti del glicoside feniletanoide tra cui echinacoside e acteoside sono i principali costituenti bioattivi di questa erba. Secondo la teoria MTC del "rene-governo-osso", il sistema osseo è governato dall'essenza del rene [15], e problemi legati alle ossa come l'osteoporosi possono essere recuperati da erbe o composti che possiedono l'attività di nutrire l'essenza del rene. Pertanto, abbiamo ipotizzato che la frazione di glicoside feniletanoide totale isolata da C. deserticola, almeno in parte, fosse benefica nel trattamento dell'osteoporosi. L'attuale esperimento è stato quindi ideato per convalidare la nostra ipotesi utilizzando un modello di ratto ovariectomizzato (OVX); oltre ai marcatori di riassorbimento osseo e di formazione che devono essere stimati, sono stati impiegati anche l'indice di antiossidante e le vie di segnalazione PI3K/AKT e NF-κB indotte da RANKL/RANK/TRAF6- per studiare i principali meccanismi della bioattività antiosteoporotica .

2. Materiali e Metodo

2.1. Materiali vegetali e preparazione.

Un totale di 30 kg di steli diCistanchedeserticoY.C. Ma sono state raccolte dalla contea di Yongning nel settembre del 2015 con le coordinate 106.026597 e 38.262816, provincia di Ningxia, Cina. L'erba è stata identificata dal Dr. Lin Dong (Dipartimento di Farmacognosia, Ningxia Medical University) e da un campione corrispondente (#201509{{40}}1) è stato conservato presso il Dipartimento di Analisi Farmaceutiche. In primo luogo, sono stati estratti 30,0 kg di C. deserticola in polvere utilizzando il metodo a riflusso con il 70% di etanolo come solvente; il rapporto tra materiale e solvente è stato fissato a 1: 10 e il tempo di riflusso è stato di 2 h per 3 volte. Quindi, tutti i filtrati sono stati combinati e condensati a pressione ridotta a 60 gradi C. In secondo luogo, per la separazione preliminare sono state utilizzate colonne di resina macroporosa AB-8 e diversi rapporti di etanolo in acqua (0 percento, 20 percento, Per l'eluizione sono stati impiegati il ​​30 percento, il 40 percento, il 50 percento e il 60 percento, ogni 60 L). In terzo luogo, gli eluenti al 40 percento e al 50 percento sono stati combinati e ulteriormente purificati utilizzando colonne di resina macroporosa AB-8 ripetute con gli eluenti di 0 percento, 20 percento, 30 percento, 40 percento e 50 percento di etanolo in acqua, e ogni eluente era 12 L. Infine, la frazione del 40 percento è stata raccolta e condensata a pressione ridotta per ottenere 150 g di frazione di glicoside feniletanoide sedimento giallo pallido di C. deserticola (CDP, la resa era dello 0,5 percento). Per gli esperimenti in vivo, è stato impiegato lo 0,5% di solvente CMC-Na per dissolvere il CDP; la somministrazione orale agli animali è stata fissata a 1 ml/100 g di peso corporeo; per l'analisi Western blot in vitro, il CDP è stato sciolto con DMSO e quindi diluito con DMEM per ottenere le concentrazioni finali di 0,1 mg/mL, 0,01 mg/mL e 0,001 mg/mL.

2.2. Sostanze chimiche e solventi.

L'estradiolo valerato (EV) proveniva da Delpharm Lille SAS, Francia; fosfatasi alcalina (ALP), gla-proteina ossea (BGP), fosfatasi acida tartrato-resistente (TRAP) e deossipiridinolina (DPD) kit ELISA reticolati di Xinyu Biological Engineering Co. Ltd., Shanghai, Cina, 201605; kit di reagenti per malondialdeide (MDA, 20181221), superossido dismutasi (SOD, 20121218) e glutatione (GSH, 20181221) dell'Institute of Nanjing Jiancheng Biological Engineering, Nanjing, Cina; kit ELISA crosslink per il paratormone intatto (l-PTH, NEWASHE7UZ), calcitonina (2L9ISN7AIU) e recettore alfa correlato agli estrogeni (ERR , Y3AY8QEWB3) di Elabscience Biotechnology Co. Ltd., Wuhan, Cina; kit di reagenti ELISA per catepsina K di BioVision, America, 1l300141; anticorpi primari di RANKL (GR3193842-5), RANK (AA02113656), TRAF6 (2), c-Fos (AG12059411), NFAT2 (AO11015648), NF-κB p65 (AH04138226), PI3 chinasi p85 alfa (AC09021266) , AKT 1 (AF05173234), -actina (17AV0411) e anticorpi secondari di IgG anti coniglio di capra coniugata con perossidasi di rafano da ZSGB-BIO, Cina, 136080; kit per il dosaggio della proteina BCA totale e il kit commerciale per il rilevamento della formazione di oste oclasti e del siero bovino fetale e del mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) di HyClone, Logan, UT, USA; membrana di polivinilidene fluoruro (PVDF) di Millipore Life Sciences, Billerica, MA, USA; penicillina e streptomicina da Gibco, Rockville, MD, USA. Tutti gli altri agenti chimici utilizzati erano di grado AR.

2.3. Quantificazione HPLC di Cistanche Deserticola P.

È stato utilizzato uno strumento HPLC Agilent 1220 per identificare e quantificare la composizione della CDP. Le condizioni cromatografiche erano le seguenti: colonna C18 (TSK-GEL, 4 6 I d × 250 mm, 5 μm); l'eluizione a gradiente conteneva i solventi A (acetonitrile) e B (acqua contenente lo 0,5 percento di acido acetico) (0-10 min: 17-20 percento A; 10-30 min: 20-25 percento A; e 30-40 min: 25-30 percentuale A); la lunghezza d'onda di rilevamento era di 333 nm; temperatura ambiente; flusso la velocità era 1,0 mL/min; il volume di iniezione del campione era di 5 μL. Sono stati identificati otto composti PhG, vale a dire, cistanoside F, echinacoside, 6′-acetylacteoside, cistanoside C, cistanoside A, acteoside, 2′-acetylacteoside e isoacteoside; utilizzando le corrispondenti sostanze di riferimento e un metodo standard esterno, i contenuti dei suddetti 8 PhG sono stati quantificati mediante analisi HPLC (Figura 1).

2.4. Protocollo sperimentale sugli animali.

Un totale di 60 ratti Sprague-Dawley adulti di sesso femminile di 3 mesi sono stati scelti dal centro di test sugli animali della Ningxia Medical University, con un peso corporeo iniziale medio di circa 234 ± 25 g. I ratti sono stati alloggiati in un ambiente privo di patogeni specifici standard per acclimatarsi per 1 settimana. Quindi, tutti i ratti sono stati anestetizzati (cloralio idrato, 100 mg/kg, ip) o ovariectomizzati fittizi (SHAM), oppure due ovaie sono state entrambe rimosse e poi divise casualmente in 5 sottogruppi: trattate per via orale con veicolo (0,5% CMC- Na) è stato impostato come gruppo modello (OVX), estradiolo valerato (1 mg/kg/giorno) come gruppo positivo (EV) e 60, 120 e 240 mg/kg/giorno di CDP come basso (CDPL), gruppi di dosaggio moderati (CDPM) e alti (CDPH), rispettivamente. Tutti i ratti sono stati somministrati per via orale giornalmente e sono durati 3 mesi con il dosaggio aggiustato ogni 2 settimane che dipendeva dalla variazione del peso corporeo totale. L'ultimo giorno dell'esperimento sugli animali, 24-è stata ottenuta l'urina dell'ora utilizzando le gabbie metaboliche; il siero è stato raccolto dall'arteria femorale di ratti anestetizzati; il femore destro, la tibia e tutti gli organi sono stati sezionati e conservati a -80 grado C per ulteriori analisi. Gli esperimenti sugli animali che abbiamo condotto sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Ningxia Medical University.

2.5. Determinazione della densità minerale ossea e analisi micro-TC.

In primo luogo, è stata utilizzata una macchina per assorbimetria a raggi X a doppia energia (Lunar, USA) per stimare la densità minerale ossea totale del femore destro di ciascun ratto; in secondo luogo, lo stesso femore è stato utilizzato per stimare l'immagine 3D della microarchitettura dell'osso trabecolare impiegando un apparato scanner micro-CT (GE, America). La risoluzione isotropica è stata impostata su 14 μm per ottenere un'immagine 3D ideale; la regione di interesse (ROI) è stata scelta impostando le stesse coordinate nella piastra di crescita del femore di ciascun campione; e i parametri morfometrici dell'osso inclusi separazione trabecolare (Tb. Sp), numero trabecolare (Tb. N), spessore trabecolare (Tb. Th), contenuto minerale osseo (BMC), densità minerale tissutale (TMD) e contenuto minerale tissutale (TMC ) sono stati ottenuti analizzando il ROI.

2.6. Analisi biochimica del siero e delle urine.

Le attività della catepsina sierica K, TRAP, SOD e GSH, nonché il contenuto di PTH sierico, calcitonina, ERR , MDA, BGP e DPD urinario, sono state determinate utilizzando i kit di reagenti corrispondenti secondo le istruzioni del produttore e il il livello di fosfatasi alcalina (ALP) e il contenuto di calcio (Ca) e fosforo (P) nel siero e nelle urine sono stati stimati utilizzando una macchina automatica (Ciba-Corning 550 Diagnostics Corp., Oberlin, OH, USA).

2.7. Analisi Western Blot.

Gli osteoclasti sono stati indotti utilizzando cellule RAW 264.7 aggiunte con fattore stimolante le colonie di macrofagi (MCSF) e RANKL. In breve, 1 × 107 cellule RAW 264,7 sono state coltivate in una 6-piastra a pozzetti in presenza di 30 ng/mL di MCSF e 25 ng/mL di RANKL. Dopo 6 giorni di induzione, le cellule osteoclastiche maturate sono state identificate utilizzando il metodo colorato con TRAP con il kit corrispondente, quindi trattate con CDP (0.1, 0.01 e 0,001 mg/mL , rispettivamente) per 24 h; quindi, le cellule sono state lisate con un tampone di lisi contenente 0,5 mmol di fenilmetilsulfonilfluoruro, proteasi e inibitori della fosfatasi. Il lisato è stato quindi separato utilizzando SDS-PAGE al 10% e trasferito su una membrana PVDF, che è stata sondata con AKT1, NF-κB-p65, RANKL, PI3K-p85, RANK, NFAT2, TRAF6, c-Fos e -actina (1: 400) dopo aver bloccato con il 5% di latte scremato per 2 h. Le stesse membrane sono state strappate e sondate nuovamente con i 9 anticorpi corrispondenti sopra, rispettivamente, quindi sono state rilevate dal software Image Lab alla fine. Gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte.

2.8. Analisi statistica.

Tutti i dati ottenuti da esperimenti in vivo e in vitro, descritti come media ± SD, sono stati analizzati utilizzando l'ANOVA unidirezionale seguito dal test di Dunnett (SPSS 22.{2}} software, SPSS, USA); p < 0="" 05="" era="" statisticamente="">

Risultati

3.1. Composizione Chimica di Cistanche Deserticola P.

Utilizzando il metodo HPLC, ottoglicoside feniletanoidecomposti sono stati trovati in questa frazione, come mostra la Figura 1. Utilizzando riferimenti standard e un metodo standard esterno, i composti e il loro contenuto sono stati identificati e quantificati come segue: (1) acteoside F (3,6 percento), (2) echinacoside (8,8 percento), (3) cistanoside A (5. { {9}} percento), (4) acteoside (13,3 percento), (5) isoacteoside (3,3 percento), (6) acteoside C (3,6 percento), (7) 2′-acetilatteoside (9,9 percento) e (8) ) 6′-acetilacteoside (3,2 per cento). Il contenuto totale di questi otto componenti è stato quantificato nel 50,7%.

3.2. Effetti di Cistanche Deserticola P sulla densità minerale ossea e sulla microarchitettura di Trabecula.

La densità minerale ossea totale dei ratti in diversi sottogruppi è mostrata nella Figura 2. Una tendenza decrescente nel contenuto di densità minerale ossea è stata osservata nei ratti del gruppo modello OVX, che è diminuita di quasi il 12.0 per cento dopo 12 settimane dell'operazione rispetto ai ratti del gruppo SHAM (p < 0="" 001).="" tutti="" i="" ratti="" trattati="" con="" cdp="" hanno="" mostrato="" un="" aumento="" significativo="" della="" densità="" minerale="" ossea="" rispettivamente="" dell'11,2%,="" 12,{9}}%="" e="" 10,7%="" (p="">< 0="" 01),="" rispetto="" ai="" ratti="" del="" modello="" ovx="" gruppo.="" inoltre,="" coerentemente="" con="" i="" dati="" della="" densità="" minerale="" ossea="" totale,="" la="" ricostruzione="" con="" micro-tc="" e="" la="" determinazione="" istomorfometrica="" del="" femore="" hanno="" mostrato="" che="" i="" ratti="" nel="" gruppo="" ovx="" mostravano="" un="" evidente="" deterioramento="" dell'architettura="" trabecolare="" evidenziato="" anche="" dal="" numero="" e="" dall'area="" delle="" trabecole="" notevolmente="" diminuiti="" come="" marcatamente="" aumentata="" tb.="" sp="" rispetto="" ai="" ratti="" del="" gruppo="" sham.="" il="" trattamento="" con="" cdp="" ha="" impedito="" il="" deterioramento="" indotto="" da="" ovx="" nell'architettura="" trabecolare;="" come="" mostra="" la="" figura="" 3,="" bmc,="" tmc="" e="" tb.="" i="" valori="" di="" n="" sono="" stati="" significativamente="" aumentati="" e="" l'area="" di="" tb.="" sp="" è="" stata="" notevolmente="" ridotta,="" mentre="" i="" valori="" di="" tmd="" e="" tb.="" sembrava="" che="" non="" fossero="" significativamente="" influenzati="" dall'operazione="" ovx="" e="" dal="" nostro="" intervento="">

3.3. Effetti di Cistanche Deserticola P sui parametri biochimici delle urine e del siero.

Come mostra la Figura 4, sono state rilevate tendenze di diminuzione significative del livello urinario di P e del contenuto sierico di calcitonina nei ratti del gruppo modello OVX, che era quasi il 30% e il 60% in meno rispetto ai ratti SHAM (p < 0="" 001="" ),="" rispettivamente,="" mentre="" tra="" i="" gruppi="" ovx="" e="" sham="" non="" sono="" state="" osservate="" tendenze="" evidenti="" di="" aumento="" o="" diminuzione="" dei="" livelli="" urinari="" di="" ca="" e="" ca="" sierico,="" nonché="" di="" p="" e="" pth="" sierico.="" il="" trattamento="" con="" cdp="" ha="" impedito="" significativamente="" la="" perdita="" del="" siero="" p="" e="" ca="" nei="" ratti="" ovx,="" evidenziato="" dai="" livelli="" sierici="" di="" p="" e="" ca="" notevolmente="" sovraregolati="" (p=""><{4}}) rispetto="" ai="" ratti="" del="" gruppo="" modello="" ovx.="" inoltre,="" sono="" state="" osservate="" tendenze="" aumentate="" ma="" non="" statisticamente="" significative="" della="" calcitonina="" nei="" gruppi="" di="" cdp="" a="" basso="" e="" ad="" alto="" dosaggio="" rispetto="" al="" gruppo="" modello="">

3.4. Effetti di Cistanche Deserticola P sulla formazione ossea e sui marcatori di riassorbimento osseo.

Gli effetti benefici della CDP sull'indice di formazione ossea, così come le influenze di inibizione sui marker di riassorbimento osseo, sono stati descritti nella Figura 5. Per quanto riguarda i marker di formazione ossea, i livelli di BGP sierico non sono stati quasi influenzati dalla chirurgia ovariectomizzata evidenziata da non- cambiamenti significativi osservati in tutti i gruppi trattati, mentre miglioramenti statisticamente significativi dell'ALP sierica sono stati ottenuti sia con dosaggi bassi (60 mg/kg) che moderati (120 mg/kg) dei gruppi di intervento CDP quando rispetto ai ratti del gruppo SHAM (p < 0="" 01).="" per="" quanto="" riguarda="" l'indice="" di="" riassorbimento="" osseo,="" i="" livelli="" sierici="" di="" catepsina="" k="" e="" dpd,="" nonché="" di="" trap="" nei="" ratti="" del="" gruppo="" modello="" ovx,="" sono="" stati="" significativamente="" migliorati="" di="" circa="" il="" 75,0="" percento,="" 41,4="" percento="" e="" 21,0="" percento,="" rispettivamente,="" rispetto="" ai="" ratti="" sham="" ,="" e="" quando="" trattati="" con="" cdp,="" in="" particolare="" il="" basso="" dosaggio="" di="" 60="" mg/kg,="" le="" proprietà="" della="" catepsina="" k="" e="" dpd="" nonché="" trap="" nel="" gruppo="" modello="" ovx="" sono="" state="" notevolmente="" inibite="" rispettivamente="" del="" 67,3="" percento,="" 41,4="" percento="" e="" 25,9="" percento,="" poiché="" rispetto="" ai="" ratti="" nel="" gruppo="" modello="">

3.5. Effetti di Cistanche Deserticola P sulla vagina e sull'utero e sul peso corporeo.

Differenze non significative nei pesi corporei iniziali dei ratti sono state osservate prima del trattamento in sei gruppi (Figura 6). Tuttavia, l'operazione ovariectomizzata ha portato a un aumento significativo del peso corporeo finale dei ratti nel gruppo modello OVX che è quasi del 36,0 percento, mentre il peso umido dell'utero e della vagina è stato drasticamente diminuito di quasi il 9{{4 }}.0 percento e 60,0 percento, rispettivamente, rispetto ai ratti SHAM (p < 0="" 001).="" sebbene="" il="" contenuto="" di="" err="" non="" abbia="" mostrato="" differenze="" significative="" tra="" i="" gruppi="" ovx="" e="" sham,="" tutti="" i="" gruppi="" di="" trattamento,="" inclusi="" cdp="" ed="" ev,="" hanno="" aumentato="" significativamente="" il="" livello="" di="" err.="" inoltre,="" quando="" trattato="" con="" ev,="" quanto="" sopra="" ha="" guadagnato="" peso="" corporeo="" intero,="" così="" come="" la="" perdita="" di="" peso="" vaginale="" e="" uterino="" dei="" ratti="" ovx,="" sono="" stati="" parzialmente="" invertiti="" (p=""><{8}}) ​​ma="" non="" sono="" stati="" influenzati="" dall'intervento="">

3.6. Effetti di Cistanche DeserticolaP sui livelli sierici di MDA, SOD e GSH.

Non vi era alcuna differenza statisticamente significativa nelle proprietà di SOD e GSH sierici tra i gruppi modello SHAM e OVX; come descritto nella Figura 7, è possibile osservare una tendenza all'aumento del GSH tra i due gruppi precedenti. Inoltre, il livello di MDA sierico è stato nettamente sovraregolato di quasi il 50 percento nei ratti del gruppo modello OVX rispetto ai ratti SHAM. L'attività di SOD non è stata influenzata dal trattamento con CDP, mentre la proprietà di GSH è stata significativamente migliorata dall'intervento di CDP e CDP ha notevolmente ridotto il livello di MDA del 33,9% e del 42,4% rispettivamente alle dosi di 60 e 240 mg/kg ( p < 0="">

3.7. Effetti di Cistanche deserticola P sui livelli di espressione proteica.

I nostri dati, mostrati nella Figura 8, hanno suggerito che il trattamento con CDP ha ridotto significativamente i livelli proteici di TRAF6, RANK e RANKL rispetto al controllo. Le vie del segnale a valle, incluso NF-κB, sono state soppresse e PI3K/AKT è stato stimolato dall'intervento CDP, evidenziato dall'espressione della downregulation di NF-κB-p65, mentre PI3K-p85 e AKT1 sono stati sovraregolati. Di conseguenza, l'espressione di NFAT2 è stata significativamente ridotta e c-Fos è stato aumentato dopo il trattamento con CDP a una concentrazione di 0.001-0.1 mg/mL. Un meccanismo suggerito è descritto nella Figura 9, in cui CDP ha sottoregolato i livelli di RANKL e RANK, portando alla riduzione delle quantità di legame di questo ligando con il suo recettore e la connessione di RANKL con RANK è stata ulteriormente ridotta dalla downregulation di TRAF6, seguita dalla soppressione delle vie a valle inclusa la via NF-κB mentre è stata stimolata la via del segnale PI3K/AKT, che alla fine ha portato alla diminuzione dell'espressione di NFAT2 e all'aumento del livello di c-Fos.

4. Discussione

I glicosidi feniletanoidi sono componenti solubili in acqua presenti in natura che esistono ampiamente nel regno delle piante medicinali [11]. Finora, i composti dei glicosidi feniletanoidi avevano attratto sempre più ricercatori a causa del loro ruolo evidente nella gestione di vari disturbi e anomalie umane [13]. Numero di frazioni e composti bioattivi antiosteoporotici, inclusi polifenoli e glicosidi feniletanoidi, sono stati identificati e isolati da dozzine di erbe medicinali naturali [5, 10, 12, 16, 17]. C. deserticola è ben noto come "ginseng del deserto" che implicava il profilo di sicurezza di questo MTC commestibile [18, 19]. Come erba tonica generale e alimento salutare naturale che è stato a lungo utilizzato nei paesi asiatici, la C. deserticola ha mostrato una funzione benefica per il miglioramento della forza dei reni. È stato scoperto che la MTC, tradizionalmente usata per rinvigorire e mantenere l'essenza renale, era solitamente usata per trattare l'osteoporosi, sia i dati pubblicati in vitro che in vivo avevano dimostrato l'attività antiosteoporotica di C. deserticola [20-23] e i costituenti del glicoside feniletanoide inclusi l'echinacoside e l'acteoside sono i principali componenti bioattivi presenti in questa pianta medicinale commestibile; tutto ciò suggeriva che non solo l'echinacoside e l'acteoside stessi, ma anche altri componenti del glicoside feniletanoide contenuti in C. deserticola fossero considerati responsabili delle proprietà antiosteoporotiche di questa erba. Nel nostro presente studio, una resina macroporosa di sicurezza favorevole è stata utilizzata per isolare e arricchire la frazione glicosidica feniletanoide da C. deserticola e, utilizzando il metodo HPLC, otto componenti principali del glicoside feniletanoide, vale a dire, acteoside F, echinacoside, cistanoside A, acteoside, isoacteoside, acteoside C, 2′-acetylacteoside e 6′-acetylacteoside, sono stati trovati nella frazione di glicoside feniletanoide isolata e il contenuto era 3,6 percento, 8,8 percento, 5,0 percento, 13,3 percento, 3,3 percento, 3,6 percento, 9,9 percento, e 3,2 per cento, rispettivamente. È stato dimostrato che l'echinacoside, uno dei principali composti di attività registrati in C. deserticola [14], possiede attività antiosteoporotica; tuttavia, il dosaggio di 270 mg/kg era così alto che ne limitava l'ulteriore applicazione clinica [24]. Negli esperimenti in corso, la frazione di glicoside feniletanoide totale con un dosaggio inferiore di 60-240 mg/kg di peso corporeo/- giorno è stata utilizzata su ratti OVX e il contenuto dei costituenti identificati era quasi il 50% puro in questa frazione utilizzando il metodo HPLC.

Era risaputo che OVX può causare osteoporosi e si credeva che un ratto OVX fosse un modello classico e adatto per simulare l'osteoporosi postmenopausale umana. Allo stesso tempo, è stata osservata una significativa diminuzione della densità minerale ossea, della microarchitettura dell'osso trabecolare, del peso umido dell'utero e della vagina e del livello di estrogeni, nonché l'evidente miglioramento del riassorbimento osseo e del peso corporeo dopo l'intervento chirurgico di ovariectomia, di cui era in parte a causa della perdita di estrogeni [25]. I nostri dati, finora, hanno chiaramente dimostrato che l'OVX ha effettivamente indotto l'osteoporosi postmenopausale ed è sempre accompagnato dal forte calo della qualità ossea, della microarchitettura ossea e del peso umido dell'utero e della vagina. Poiché l'EV è un agente sostitutivo ormonale generale che è stato utilizzato nella pratica clinica, è stato utilizzato come controllo positivo nel nostro esperimento in vivo e il peso corporeo guadagnato e l'atrofia del peso dell'utero, nonché la densità minerale ossea deteriorata e la microarchitettura dell'osso trabecolare , sono stati presumibilmente invertiti dalla supplementazione di EV. Diversamente dal controllo positivo, la diminuzione del peso vaginale e uterino, così come il peso corporeo totale acquisito dei ratti nel gruppo modello OVX, non sono stati influenzati dal trattamento CDP, il che implicava che la CDP potesse migliorare la formazione ossea senza indurre gli effetti collaterali sul corpo e sui tessuti organici uterini. Sebbene i livelli di ERR fossero significativamente sovraregolati dal trattamento con CDP, è stato proprio come un effetto fitoestrogeno che non sono stati osservati effetti collaterali sui tessuti organici dell'utero e della vagina. Inoltre, il trattamento della CDP ha rafforzato significativamente la qualità dell'osso nei ratti OVX che erano stati deteriorati dall'intervento di ovariectomia.

Inoltre, i livelli di P e Ca nelle urine e nel siero dei ratti OVX sono stati utilizzati anche per riflettere l'effetto antiosteoporotico e le concentrazioni di Ca e P inorganico erano solitamente dipendenti dai livelli di calcitonina e PTH [26]. Nel presente studio, sebbene non siano state ottenute tendenze significative di diminuzione o aumento del livello di escrezione urinaria di Ca, P sierico, Ca e PTH sierico nei ratti del gruppo modello OVX, i livelli urinari significativi di P e calcitonina (p < {="" {1}})="" sono="" stati="" osservati.="" coerentemente="" con="" i="" dati="" pubblicati="" secondo="" cui="" la="" carenza="" di="" estrogeni="" causata="" dalla="" chirurgia="" dell'ovariectomia="" portava="" sempre="" a="" una="" diminuzione="" del="" livello="" di="" calcitonina="" nel="" sangue,="" questa="" diminuzione="" della="" calcitonina="" sierica="" alla="" fine="" portava="" a="" un="" aumento="" del="" livello="" di="" pth,="" dove="" si="" credeva="" che="" il="" ca="" fosse="" il="" principale="" regolatore="" della="" secrezione="" di="" pth.="" poiché="" la="" concentrazione="" di="" pth="" non="" ha="" mostrato="" differenze="" significative="" tra="" i="" gruppi="" ovx="" e="" sham="" nel="" presente="" studio,="" anche="" il="" livello="" di="" ca="" nel="" siero="" e="" nelle="" urine="" non="" ha="" mostrato="" cambiamenti="" evidenti="" tra="" i="" due="" gruppi="" di="" cui="" sopra.="" tuttavia,="" è="" stata="" ottenuta="" una="" tendenza="" significativamente="" diminuita="" sul="" livello="" di="" calcitonina="" tra="" i="" gruppi="" ovx="" e="" sham="" e,="" di="" conseguenza,="" il="" contenuto="" di="" p="" nelle="" urine="" di="" ovx="" è="" stato="" notevolmente="" ridotto.="" ritenevamo="" che="" i="" dati="" di="" cui="" sopra="" potessero="" spiegare="" il="" fenomeno="" contraddittorio="" del="" perché="" l'escrezione="" urinaria="" del="" livello="" di="" ca="" nei="" ratti="" ovx="" non="" mostrava="" cambiamenti="" evidenti="" rispetto="" ai="" ratti="" sham,="" e="" questo="" fenomeno="" potrebbe="" anche="" essere="" correlato="" all'aumento="" del="" tasso="" di="" turnover="" osseo="" [27]="" .="" dopo="" il="" trattamento="" con="" cdp,="" i="" livelli="" di="" p="" e="" ca="" nel="" siero="" erano="" notevolmente="" sovraregolati="" e="" il="" contenuto="" di="" p="" nelle="" urine="" era="" sottoregolato="" nei="" ratti="" ovx,="" il="" che="" rifletteva="" che="" la="" cdp="" poteva="" non="" solo="" prevenire="" l'escrezione="" di="" elementi="" minerali="" ossei="" ma="" anche="" aumentare="" il="" contenuto="" sierico="" di="" quelli="" elementi,="" sopprimendo="" così="" indirettamente="" la="" perdita="">

Inoltre, sono stati impiegati anche i marcatori di formazione ossea e di riassorbimento, nonché gli enzimi antiossidanti tra cui SOD e GSH, per spiegare i meccanismi antiosteoporotici alla base della CDP. Simile ai dati pubblicati, il livello di ALP nei ratti del gruppo modello OVX ha mostrato una tendenza all'aumento non statisticamente significativa che indica un tasso accelerato di turnover osseo nell'osteoporosi postmenopausale [10]. Tuttavia, dopo il trattamento con CDP (60, 120 e 240 mg/kg/giorno), le proprietà dell'ALP sono state significativamente migliorate. Era ben noto che l'OVX causava un forte calo dei livelli di estrogeni che di solito porta a un superamento del riassorbimento osseo e dello stress ossidativo [28], evidenziato dai livelli di TRAP, catepsina K e DPD nonché MDA notevolmente sovraregolati nei ratti del Gruppo di modelli OVX. Tuttavia, tali peggioramenti sono stati in parte migliorati dall'intervento di CDP. Inoltre, il trattamento con OVX ratto con CDP (60 e 240 mg/kg) ha dimostrato un aumento significativo dell'attività del GSH (p < 0="" 05).="" i="" risultati="" di="" cui="" sopra="" implicavano="" che="" il="" cdp="" mostrava="" un="" effetto="" terapeutico="" sull'osteoporosi="" indotta="" da="" ovx="" e="" questi="" effetti="" erano="" sia="" migliorando="" la="" formazione="" ossea="" che="" sopprimendo="" il="" riassorbimento="" osseo,="" nonché="" migliorando="" il="" sistema="" antiossidante="">

L'attivazione di RANK da parte del suo ligando RANKL ha stimolato le espressioni di NFAT2 e c-Fos tramite la segnalazione PI3K/AKT e NF-κB [29]. NF-κB si è dimostrato essenziale per l'osteoclastogenesi poiché l'interruzione di NF-κB potrebbe portare a una differenziazione degli osteoclasti alterata con un fenotipo osteoporotico e NF-κB sovraregolato c-Fos ed espressioni NFAT2 downregolate durante l'osteoclastogenesi indotta da RANKL/RANK/TRAF. Per stimare l'influenza benefica del CDP sull'osteoclastogenesi mediata da NFAT2 e c-Fos, sono stati analizzati i livelli di espressione di RANKL e RANK. Prevedibilmente, CDP ha inibito significativamente NFAT2 e stimolato i livelli di c-Fos sottoregolando le espressioni di RANKL e RANK. Nel frattempo, lo stesso RANK mancava della proprietà intrinseca della chinasi a meno che non fosse unito da TRAF6 per attivare la segnalazione a valle [3]. CDP ha anche sottoregolato l'espressione di TRAF6, il che ha portato a una significativa riduzione delle quantità vincolanti di RANKL e RANK. Un ipotetico meccanismo antiosteoporotico di CDP sui ratti OVX copriva le vie di segnalazione di cui sopra e i regolatori sono stati descritti nella Figura 9. Concisamente, CDP ha diminuito i livelli di TRAF6, RANKL e RANK, sopprimendo così le vie di segnalazione a valle tra cui PI3K/AKT e NF-κB che sono attivati ​​da RANKL/RANK e, infine, riducono le espressioni e le attività delle proteine ​​osteoclastogeniche chiave NFAT2 e c-Fos. Pertanto, molteplici indizi di dati implicavano l'effetto benefico della CDP sul metabolismo osseo dei ratti OVX principalmente attraverso le vie PI3K/AKT e NF-κB mediate da RANKL/RANK/TRAF6-.

5. conclusione

In sintesi, i glicosidi feniletanoidi totali, isolati da C. deserticola, hanno mostrato effetti benefici significativi sull'osteoporosi postmenopausale dei ratti OVX e il potenziale terapeutico nella soppressione della perdita ossea era principalmente attraverso la stimolazione della formazione ossea e l'inibizione del riassorbimento osseo, nonché il miglioramento dell'antiossidante osseo sistema; i meccanismi possono essere correlati all'attivazione di NF-κB indotta da RANKL/RANK/TRAF6- e all'inattivazione di PI3K/AKT, nonché alla stimolazione di c-Fos e alla soppressione di NFAT2 e, infine, la differenziazione degli osteoclasti è stata inibita.

Abbreviazioni

AKT: proteina chinasi B

ALP: fosfatasi alcalina

BGP: proteina GLA delle ossa

BMC: contenuto minerale osseo

CDP: frazione glicosidica feniletanoide di C. deserticola

CK: Cathepsina K

CT: calcitonina

DPD: Deossipiridinolina

ERR: recettore alfa correlato agli estrogeni

EV: estradiolo valerato

GSH: Glutatione l-PTH: paratormone intatto

MCSF: fattore stimolante le colonie di macrofagi

MDA: malondialdeide

NFAT2: Fattore nucleare dei linfociti T attivati ​​c2

NF-κB: fattore nucleare-kappa B

OPG: Osteoprotegerina

OVX: ovariectomizzato

PhGs: glicosidi feniletanoidi

PI3K: Fosfoinositide 3-chinasi

RANK: attivatore del recettore del fattore nucleare-kappa B

RANKL: attivatore del recettore del fattore nucleare-kappa

ROI del ligando B: regione di interesse

SOD: superossido dismutasi

Tb. N: Numero trabecolare

Tb.Sp: Separazione trabecolare

Tb.Th: Spessore trabecolare

MTC: Medicina tradizionale cinese

TMC: contenuto di minerali nei tessuti

TMD: densità minerale dei tessuti

TNF: fattore di necrosi tumorale

TRAF6: Fattore 6 associato al recettore del fattore di necrosi tumorale

TRAPPOLA: Fosfatasi acida tartrato-resistente.

Disponibilità dei dati

I dati utilizzati per supportare i risultati di questo studio sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta.

Conflitto di interessi

Gli autori non avevano alcun conflitto di interessi.

Contributi degli autori

XM ha progettato e supervisionato gli esperimenti; SD e LY hanno eseguito la maggior parte degli esperimenti e hanno redatto il manoscritto; BZ e JL hanno eseguito l'analisi Western blot e hanno partecipato a esperimenti sugli animali; YD ha analizzato i dati; QT e PY hanno rivisto il manoscritto. Tutti gli autori hanno esaminato il manoscritto. Lingling Yang e Shuqin Ding hanno contribuito in egual modo al manoscritto.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla Science Technology Foundation of Higher Education of Ningxia (NGY2017090), dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81560684), dal Key Research and Development Program of Ningxia (2018BHF2001), dalla Ningxia Key Research e Programma di invenzione della cooperazione scientifica e tecnologica dell'Oriente e dell'Occidente (n. 2017BY084 e 2017BY079) e la West Light Foundation dell'Accademia cinese delle scienze-Young Scientists of West 2017.

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