Potenziamento dell'attività antitumorale del tassolo di Aspergillus Favus "endofita di jojoba" tramite coniugazione con nanoparticelle d'oro mediate dall'irradiazione

Cistanche di erbe cinesi alternative di Taxol

Parole chiave:Aspergillus favus · Jojoba · Funghi endofiti · Nanoparticelle d'oro · Taxol · -Irradiazione · Ottimizzazione nutrizionale

introduzione

Taxol è uno dei prodotti ad ampio spettro più commercializzatifarmaci antitumorali[1]. L'attività di Taxol deriva dalla sua specificità unica per il legame con l'eterodimero delle subunità cellulari della tubulina, promuovendo la polimerizzazione della tubulina, interrompendo così la divisione mitotica delle cellule tumorali [2]. Il taxolo ha mostrato una forte attività contro il seno, il polmone, la testa e il collo, i tumori uterini e le forme avanzate del sarcoma di Kaposi [3]. Il tassolo è stato inizialmente prodotto dalla corteccia degli alberi di tasso Taxus brevifolia "famiglia Taxaceae" [4, 5]; tuttavia, la resa inferiore di Taxol è quella<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as asma,infiammazione, Ecancro[32]. Pertanto, l'obiettivo principale di questo lavoro era esplorare un nuovo isolato fungino dalla pianta di jojoba con stabilità metabolica unica per la produzione di Taxol, per valutare i diversi approcci per massimizzare la loro resa di Taxol, nonché per migliorare l'attività antiproliferativa dei composti Taxol estratti tramite coniugazione con nanoparticelle d'oro, mediata dall'irradiazione gamma.

Materiale e metodi

Isolamento e coltura dei funghi endofiti

Diverse parti di jojoba (Simmondsia chinensis) come foglie, cortecce, ramoscelli e gemme sono state raccolte dalla Facoltà di Agraria dell'Università del Cairo e utilizzate come fonte di funghi endofiti. Le parti della pianta sono state raccolte e lavate sotto acqua corrente, sterilizzate in superficie con etanolo al 70% per 1 minuto e poi risciacquate con acqua sterile [28]. Le parti di piante sterilizzate in superficie sono state tagliate in piccoli pezzi in condizioni sterili e poste su piastre di terreno PDA (potated dextrose agar), Czapek's-Dox e terreno di agar estratto di malto [33-36], e le piastre sono state incubate a 30 gradi per 10 giorni. L'efficacia della sterilizzazione superficiale delle parti della pianta è stata valutata centrifugando l'acqua di risciacquo, quindi 500 ul di acqua sterile sono stati aggiunti al precipitato e piastrati in terreno PDA [37]. Gli isolati fungini endofitici purificati sono stati inoculati su slant PDA per 7 giorni e conservati a 4 gradi

Screening, estrazione e quantificazione del tassolo dai funghi endofiti

I funghi endofiti recuperati che abitano la jojoba sono stati sottoposti a screening per la produzione di taxolo crescendo su brodo di destrosio di patate (PDB) [38]. Un plug di ciascuno degli isolati fungini di 7 giorni è stato inoculato in 100 ml di PDB/250 ml di compiti Erlenmeyer, incubati per 15 giorni a 30±1 gradi, in condizioni di agitazione (120 giri al minuto). Dopo l'incubazione, le colture sono state filtrate e il filtrato è stato modificato con bicarbonato di sodio allo 0,2% per precipitare gli acidi grassi. Il taxolo è stato estratto con diclorometano, la fase organica è stata raccolta ed evaporata a secchezza, ei residui sono stati ridisciolti in metanolo [17, 39]. Il tassolo è stato separato e identificato mediante TLC utilizzando lastre di gel di silice pre-rivestite Merck da 1 mm (20 × 20 cm) (TLC Silica gel 60 F254, Darmstadt, Germania), rilevate mediante illuminazione UV a 254 nm [39]. I punti putativi di Taxol sono stati raschiati dalle piastre di gel di silice TLC e sciolti in metanolo, vorticati vigorosamente per 10 minuti e centrifugati a 1000 rpm per 5 minuti. Le particelle di silice precipitate sono state rimosse e il supernatante è stato prelevato per la quantificazione del tassolo e il controllo della purezza mediante HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quaternary Pump, Corea) della colonna C18 in fase inversa (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 mm, 3,5 μm, Cat. # 959,963–902). La fase mobile utilizzata era metanolo/acetonitrile/acqua (25:35:40, v/v/v) a una velocità di flusso di 1,0 ml/min per 20 min [40], e le frazioni di taxolo sono state misurate a 227 nm e le loro l'identità chimica e le concentrazioni sono state confermate dal tempo di ritenzione e dall'area del picco di assorbimento rispetto al campione autentico.

Identificazione morfologica e molecolare dei funghi endofitici recuperati

Gli isolati fungini endofiti sono stati identificati ai loro livelli di specie in base alle loro caratteristiche macro e micromorfologiche crescendo su PDA, Czapek's-Dox e mezzi di estrazione di malto secondo le chiavi del riferimento [33-36]. L'identità dei più potenti isolati fungini produttori di taxolo è stata ulteriormente confermata a livello molecolare sulla base della sequenza dello spaziatore trascritto interno (ITS) [41, 42]. Il DNA genomico fungino (gDNA) è stato estratto polverizzando il micelio (~0.2 g) in azoto liquido, quindi dispensando in 1 ml di tampone di estrazione CTAB (2 percento CTAB, 2 percento PVP40, { {21}}.2 percento 2-mercaptoetanolo, 20 mM EDTA, 1.4 M NaCl in 100 mM Tris−HCl, pH 8.0). I set di primer PCR erano ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ e ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. La reazione PCR contiene 10 ul di miscela master 2×PCR (i-Taq™, Cat. No. 25027), 2 ul di gDNA, 1 ul di ciascun primer (10 pmol/ul) e completata a 20 ul con distillato sterile acqua. La PCR è stata programmata per denaturazione iniziale a 94 gradi per 2 min, denaturazione a 94 gradi per 30 s, ricottura a 55 gradi per 10 s, estensione a 72 gradi per 30 s per 35 cicli ed estensione finale a 72 gradi per 2 min. Gli ampliconi PCR sono stati analizzati con gel di agarosio all'1,5% in 1 tampone TBE (Ambion Cat# AM9864), utilizzando una scala di DNA da 1 kb (Cat. # PG010-55DI) e visualizzati dal sistema di documentazione del gel. Gli ampliconi sono stati purificati e sequenziati da Applied Biosystems Sequencer, basi HiSQV, versione 6.0 con gli stessi set di primer. Le sequenze ottenute sono state ricercate BLAST in modo non ridondante sul database NCBI, importate nel software MEGA 6.0 e allineate con l'algoritmo del muscolo Clustal W [43] e l'albero filogenetico è stato costruito con il metodo di unione dei vicini di MEGA 6.0 [44].

Struttura chimica del taxolo estratto

I punti putativi di Taxol sono stati raschiati dalle piastre di gel di silice TLC e purificati, e la purezza e la concentrazione sono state determinate dalle analisi UV-Vis a λ 227 nm (RIGOL, serie Ultra -3000) rispetto all'autentico Taxol [39]. I supporti vuoti nelle stesse condizioni sono stati utilizzati come riferimento negativo per le analisi spettrofotometriche. Lo spettro FT-IR dei campioni di Taxol purificati è stato analizzato dallo spettrofotometro JASCO FT-IR 3600. Il campione di taxolo è stato macinato con pellet di KBr, pressato in dischi sotto vuoto e l'assorbimento è stato misurato nella regione da 400 a 4000 cm-1 [3], rispetto a quello autentico. La struttura chimica del taxolo estratto è stata confermata dalla spettroscopia HNMR (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) rispetto al taxolo autentico. I campioni sono stati dissolti in CDCl3, gli spostamenti chimici sono espressi in ppm (scala δ) e le costanti di accoppiamento sono espresse in hertz (Hz).

Effetto di diversi tipi di media sulla produzione di taxolo

Due tappi di agar (9 mm) da colture di 7 giorni di ciascun isolato fungino sono stati inoculati in triplicato in 100 ml di terreno/250 ml di beuta Erlenmeyer di destrosio di patata (PDB), Czapekʼs-Dox (CZD), M1D ed estratto di malto (ME ) mezzi di brodo. Come controllo negativo sono stati utilizzati controlli non inoculati da ciascun terreno privo di spore fungine, incubati a 30 gradi per 15 giorni nelle stesse condizioni. Dopo l'incubazione, le colture fungine sono state filtrate e il taxolo è stato estratto e determinato come menzionato sopra.

Ottimizzazione del bioprocesso delle condizioni nutrizionali per massimizzare la resa in taxolo

L'ottimizzazione della composizione del mezzo per massimizzare la resa di Taxol da parte del potente isolato fungino è stata condotta mediante la metodologia della superficie di risposta utilizzando il design Placket-Burman seguito dal design composito centrale [17–20, 45]. Dai progetti RSM, le variabili positive e significative che influenzano la produzione di Taxol da parte del potente isolato fungino sono state valutate utilizzando il pacchetto software statistico di Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA). Ogni esperimento è stato eseguito in tre repliche biologiche e sono stati considerati i valori medi. Dopo l'incubazione nelle condizioni desiderate, la biomassa fungina è stata filtrata e il tassolo è stato estratto e quantificato mediante TLC e HPLC come descritto sopra.

Abbottonatura: design birmano

Il disegno abbottonato-birmano è stato frequentemente utilizzato per l'ottimizzazione della componente media per la crescita fungina e la produzione di metaboliti secondari bioattivi, valutando le variabili significative che influenzano la produzione di taxolo [18, 20, 46]. La scelta del fattore si è basata sui mezzi utilizzati nello screening qualitativo e quantitativo. Sono stati inclusi undici fattori; estratto di malto, peptone, saccarosio, soiatone, glutammina, estratto di manzo, temperatura, pH, tempo di incubazione e valori e fattori di velocità di agitazione sono stati variati su due livelli e sono stati selezionati gli intervalli dei livelli minimo e massimo. La statistica Design-Expert 7.0 è stata utilizzata per generare una serie di 12 esperimenti. Per ciascun esperimento, la produzione di Taxol è stata determinata in tre repliche biologiche ed è stata considerata la media della resa di Taxol.

L'analisi di regressione dei dati è stata condotta utilizzando un software statistico. L'effetto di ciascuna variabile è stato calcolato (Biometrika, 2020), utilizzando la seguente equazione:

dove, E è l'effetto di una variabile di test, M plus e M− sono la concentrazione di Taxol delle prove a cui il parametro era rispettivamente ai suoi livelli più alto e più basso, e N è il numero di esperimenti che è stato effettuato. L'effetto di ciascuna variabile sulla produzione è stato determinato calcolando i rispettivi valori E.

Dove Tot alto è il totale delle risposte al livello alto, Tot basso è il totale delle risposte al livello basso e No è ​​il numero di prove.

Central Composite Design e interazioni tra fattori che influenzano la produzione di taxolo

I fattori positivi più significativi che influenzano la produzione di taxolo da parte dell'isolato fungino selezionato sono stati ottimizzati utilizzando un modello sperimentale CCD di tipo superficie di risposta [47]. Utilizzando il CCD, le concentrazioni dei componenti del mezzo sono state ottimizzate e le loro interazioni studiate sono state utilizzate per generare un totale di 20 esperimenti per le tre variabili. Per determinare i livelli ottimali delle variabili per la produzione di Taxol dal potente isolato fungino, sono state tracciate curve di superficie di risposta tridimensionali (3D) per studiare l'interazione tra i vari fattori e determinare la condizione variabile di ciascun fattore che influenza la produzione di Taxol. I grafici 3D sono stati eseguiti mantenendo le costanti di tre fattori a un livello ideale e tracciando la risposta ottenuta della resa di Taxol per livelli variabili degli altri due fattori.

Effetto dell'irradiazione gamma sulla resa del tassolo

I potenti isolati endofitici che producono Taxol sono stati esposti a -irradiazione con 60fonte di cobalto (cella gamma 4000-A-India) a diverse dosi di radiazioni gamma (0.25–3.0 kGy) rispetto al controllo della coltura non irradiata; un rateo di dose di 1,2 kGy/h al momento degli esperimenti. I terreni ottimizzati sono stati inoculati dalla coltura irradiata in condizioni colturali standard, rispetto all'inoculo della spora non irradiata come controllo. Le colture sono state incubate a 30 ± 2 gradi per 15 giorni su un agitatore rotante (120 rpm). Dopo l'incubazione, le colture sono state filtrate e il tassolo è stato estratto, purificato e quantificato mediante TLC e HPLC come descritto sopra.

Sintesi e caratterizzazione di nanoparticelle d'oro (AuNPs); Coniugazione con Taxol

Attività antitumorale del taxolo

L'attività dei coniugati Taxol e Taxol-PVP-AuNPs purificati contro il carcinoma epatico (HPG2) e il carcinoma mammario (MCF7) è stata determinata da 3- (4,5-dimetiltiazol- 2-yl) Saggio -2,5-difenil tetrazolio bromuro (MTT) [48]. La piastra 96-pozzetto è stata seminata con 103 cellule per pozzetto e incubata durante la notte a 37 gradi, quindi sono state aggiunte diverse concentrazioni del farmaco e le piastre sono state nuovamente incubate per 48 ore. Il reagente MTT (25 ul) è stato aggiunto e incubato per 2 ore, e il colore viola del complesso formazano sviluppato è stato misurato a λ570 nm. Il valore IC50 è stato espresso dalla quantità di farmaco che riduce la crescita del 50% di un numero iniziale di cellule tumorali normalizzandosi al controllo positivo.

Attività antimicrobica dei coniugati taxolo e taxolo-AuNPs

L'attività antimicrobica dei coniugati Taxol e Taxol-AuNPs è stata valutata rispetto a diversi isolati batterici; Bacillus subtilis ATCC 6633 e Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Enterobacter agglomerans, oltre a Candida albicans. Le cellule batteriche testate sono state sospese in acqua peptonata sterile per ottenere un inoculo standard di ~0,5 McFarland (1–1,5)× 1{{10}}8 CFU/ ml a λ6{{18 }}0nm. L'inibizione della crescita (mm) della crescita dei patogeni microbici è stata valutata mediante il metodo di diffusione del disco di agar. Come controlli positivi sono stati utilizzati dischi antibiotici standard sterili con un diametro di 6,0 mm. Dischi antibiotici sterili (6,0 mm) sono stati caricati con 20 ul di metanolo e acido amoxicillina-clavulanico (AMC) come controllo negativo e positivo. I dischi sono stati caricati con la stessa concentrazione di Taxol, Taxol-PVP-AuNPs e AuNPs (1,0 ug/ml). Sono state preparate tre repliche biologiche. Le piastre sono state incubate a 37 gradi per 24 ore e sono state misurate le zone di inibizione. L'acido amoxicillina clavulanico (AMC) e la nistatina sono stati utilizzati per normalizzare l'attività antimicrobica di Taxol. La zona di inibizione della crescita è stata determinata con un calibro a corsoio (mm).

Analisi statistiche

Identificazione morfologica e molecolare dei potenti produttori di taxolo

Le caratteristiche morfologiche del potente isolato fungino che produce Taxol sono state esaminate secondo le chiavi descrittive macroscopiche e microscopiche, come descritto in Materiali e Metodi, e ne hanno rivelato la vicinanza morfologica con A. favus (Fig. 2). L'isolato fungino è stato coltivato su PDA a 30 gradi per 10 giorni e le caratteristiche macroscopiche e microscopiche hanno rivelato la sua identità come le teste conidiali, la modalità di ramificazione, l'identità dello stigma e l'ontologia conidiale e la formazione dei corpi fruttiferi, secondo l'universale chiavi morfologiche [33], e sono risultate identiche ad Aspergillus favus. Il potente isolato A. favus che produce Taxol è stato ulteriormente identificato in base alle loro sequenze ITS, utilizzando gDNA come modello. Gli ampliconi PCR (~ 550 bp) di A. favus sono stati risolti, purificati e sequenziati (Fig. 2). La sequenza ITS di A. favus è stata cercata in modo non ridondante nel database NCBI, mostrando una somiglianza del 99% con A. favus, con valori E. pari a zero e una copertura delle query del 95%. Pertanto, dalle analisi microscopiche e molecolari, l'isolato bersaglio è stato confermato come A. favus e depositato su GenBank con numero di accesso MW485934.1, così come l'isolato è stato depositato presso il Centro micologico dell'Università Assiut (AUMC), Egitto con un numero di deposito AUMC13892. L'attuale isolato aveva una somiglianza del 99% con gli isolati di A. favus MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Fig. 1 Aspetto morfologico della pianta di jojoba. B Colture in piastra dei potenti funghi endofiti produttori di Taxol; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) e A. oryzae Bd (25) su PDA dopo 8 giorni di incubazione a 30 gradi. Gli isolati fungini sono stati coltivati ​​su PDB e incubati alle condizioni standard, e Taxol è stato estratto e controllato mediante TLC (C). D Cromatogramma HPLC di Taxol dai potenti isolati fungini. E Resa di Taxol come quantificato da HPLC. F, Analisi spettrale UV-Vis del tassolo estratto dagli isolati fungini. G Analisi FT-IR del tassolo estratto rispetto a quello autentico

Fig. 2 A Caratteristiche macromorfologiche di A. favus un endofita di jojoba dopo 3, 5 e 8 giorni di crescita su PDA. Caratteristiche micromorfologiche, testa conidiale di A. favus a 400 ingrandimenti. C Amplicone PCR della regione ITS di A. favus di 500 bp, normalizzante a scala da 1 kb (Cat.#. SM0312). D Analisi filogenetica di ITS A. favus con il metodo della massima verosimiglianza [44]

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