L'estratto di Cistanche Deserticola può favorire la risposta immunitaria?

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Shuangshuang Feng a,1, Xiumei Yang a, Xiang Weng a,1, Bin Wang b, Ailian Zhang a,*

a Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, College of Life Science and Technology, Xinjiang University, Urumqi, 830046, Xinjiang, Cina

b Key Lab of Medical Molecular Virology, School of Basic Medical Science, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai, 200032, Cina

Rilevanza etnofarmacologica:I polisaccaridi vegetali hanno mostrato un grande potenziale di potenziamento immunitario. Gli adiuvanti sono uno strumento chiave per lo sviluppo di vaccini efficaci. Nel nostro studio precedente, un polisaccaride solubile in acqua estratto dal selvaggioCistanchedeserticoYC Ma ha mostrato una potente attività immunostimolante.

Scopo dello studio:In questo studio, i profili immunitari e l'efficacia degli estratti acquosi di coltivatoCistanchedeserticoYC Ma (AECCD) su topi ICR contro l'ovoalbumina (OVA) sono stati studiati. In esperimenti in vitro, è stato valutato il possibile meccanismo di attivazione delle DC da parte dell'AECCD.

Materiali e metodi:Gli AECCD sono stati estratti usando acqua calda dopo di che i polisaccaridi grezzi sono stati precipitati da etanolo. I topi sono stati inizialmente immunizzati per via sottocutanea con OVA (10 ug per topo) da solo o OVA (10 ug per topo) contenenti rispettivamente diverse dosi di AECCD (200, 400 e 800 ug per topo) nei giorni 1 e 14 e l'entità e la cinetica di Sono stati quindi valutati gli anticorpi e le risposte cellulo-mediate.

Risultati:L'AECCD ha suscitato risposte IgG vigorose ea lungo termine con risposte miste Th1/Th2 e livelli sovraregolati di citochine associate a Th (CD4 più IL-4, CD4 più IFN- e CD8 più IFN-). Inoltre, l'AECCD ha indotto il cellulare forteimmunerispostacaratterizzato da una maggiore proliferazione degli splenociti e dalla risposta dei linfociti T attivati. In particolare, l'AECCD ha migliorato significativamente la maturazione delle cellule dendritiche (DC) e ha inibito le Treg. Esperimenti in vitro, test preliminari hanno indicato che l'AECCD induceva l'attivazione delle DC promuovendo la maturazione fenotipica, la sezione delle citochine e l'attività allostimolatoria. Il recettore Toll-like 4 (TLR4) era un recettore essenziale per le DC per legare direttamente l'AECCD. Gli inibitori di NF-κB hanno ridotto i livelli di espressione di CD40, CD80, CD86 e MHC-II e la produzione di IFN-, TNF- e IL-6 attraverso DCS.

Conclusioni:Infine, questi risultati hanno suggerito che l'AECCD potrebbe suscitare un antigene specifico potente e duraturoimmunerisposteattraverso l'attivazione della DC, che è stata coinvolta nella regolazione dei marcatori di maturazione e dell'espressione di citochine attraverso il percorso NF-κB correlato a TLR4-. Lo studio indica che l'AECCD è un potenziale immunomodulatore.

Parole chiave:Coadiuvante polisaccaridico Coltivato,Cistanchedesertico, Immunomodulatore, Cellule dendritiche Recettore Toll-like 4, Via di segnalazione NF-κB

Cistanche deserticoestrarre promuovereimmunerisposta

1. Introduzione

Molti studi hanno suggerito che i coadiuvanti possono aumentare l'efficacia dei vaccini contro varie malattie infettive come HIV, COVID{0}}, influenza e afta epizootica (Cao et al., 2020; Giuseppe et al., 2018 ). I coadiuvanti possono indurre diversi tipi e grandezze diimmunerisposte, quindi un adiuvante opportunamente selezionato può indurre ilimmunerispostarichiesto per un determinato agente patogeno o antigene (Reed et al., 2013). Gli estratti erbacei naturali sono stati a lungo ampiamente utilizzati nella vita quotidiana o nell'assistenza sanitaria. In molti casi, la medicina tradizionale cinese (MTC) ei suoi componenti attivi, in particolare i molteplici adiuvanti derivati ​​dai polisaccaridi della MTC, hanno migliorato significativamente l'efficacia dei vaccini. I polisaccaridi della MTC (Advax™, Astragalus polysaccharide, Ginseng polysaccharide, Lycium barbarum polysaccharide e Ganoderma lucidum polysaccharide) presentavano numerosi vantaggi rispetto ad altri adiuvanti, come una migliore sicurezza, biocompatibilità, forte potenziamento immunitario e bassa reattogenicità (Li e Wang, 2015; Schijns et al., 2020). Pertanto, i composti e le formulazioni a base di polisaccaridi della MTC hanno il potenziale come candidati adiuvanti.

Cistanche deserticoYC Ma (Roucongrong in cinese) è una medicina tradizionale cinese registrata nella farmacopea cinese ed è stata usata come alimento tonico per centinaia di anni in Cina (Chinese Pharmacopoeia Commission, 1992). I moderni studi farmacologici hanno mostrato le sue molteplici applicazioni farmacologiche e immunomodulatorie (Dong et al., 2007; Fu et al., 2017). Nel nostro studio precedente, i polisaccaridi grezzi derivavano dal selvaggioCistanchedeserticoYC Ma ha promosso le risposte umorali e cellulari antigene-specifiche e ha regolato la maturazione delle cellule dendritiche (DC) (Zhang et al., 2018; Zhao et al., 2019). Tuttavia, selvaggioCistanchedeserticoYC Ma è stato eccessivamente esplorato ed elencato come specie in via di estinzione.CistanchedeserticoYC Ma è stato piantato su larga scala ed è ampiamente utilizzato nello sviluppo e nell'applicazione delle risorse MTC. Tuttavia, il potenziale coadiuvante di coltivatoCistanchedeserticoYC Ma non è ancora chiaro.

I DCS sono regolatori essenziali contro le malattie infettive. Dopo che le DC sono state attivate, le molecole di superficie e le citochine pro-infiammatorie sulle DC interagiscono con i recettori corrispondenti per attivare le cellule T e suscitare risposte antigene-specifiche e la produzione di citochine che dirigono l'adattamentoimmunerisposte(Banchereau e Steinman, 1998). È stato riportato che il recettore toll-like 4 (TLR4) sulle DC funziona come un importante recettore polisaccaridico (Park et al., 2014; Qi et al., 2016). Infatti, molti polisaccaridi possono interagire direttamente o indirettamente con TLR4 sulle DC per attivare il fattore nucleare a valle-kappa B (NF-κB), che può indurre l'espressione di vari geni proinfiammatori come IFN-, TNF- e IL{{11 }} e la risposta infiammatoria per eliminare i patogeni (Tian et al., 2019; Zhou et al., 2017; Zhu et al., 2013). Pertanto, DCS e NF-κB sono stati ampiamente studiati come potenziali bersagli per la terapia della malattia.

Nello studio, con la strategia in vivo (topi ICR), abbiamo dapprima valutato gli effetti immunostimolatori di estratti acquosi diCistanchedeserticoYC Ma (AECCD) con diverse dosi (basse, medie e alte) per suscitare animmunerispostacontro OVA e spiegare il modo in vitro per attivare le DC e le vie correlate ai recettori a valle. Con un modello murino, abbiamo rivelato che l'AECCD ha promosso la risposta anticorpale a lungo termine con un aumento dei titoli di IgG e celluleimmunerisposta. È importante sottolineare che l'AECCD ha indotto citochine Th-associate, in particolare la produzione di IFN, che ha portato alla risposta Th1 contro le infezioni. L'effetto di induzione era strettamente correlato con una maggiore maturazione delle DC e una diminuzione delle Treg. Meccanicamente, l'AECCD ha promosso l'attivazione di DC tramite il percorso NF-κB correlato a TLR4-. In sintesi, lo studio ha confermato la potente attività adiuvante dell'AECCD nel promuovere la risposta adattativa. Lo studio ha gettato le basi per lo sviluppo di adiuvanti polisaccaridici AECCD.

2. Materiali e metodi

2.1. Reagenti

Ovoalbumina (OVA), 3-(4, 5-dimetiltiazol-2-yl)-2, 5-difeniltetrazolio bromuro (MTT), polimixina B (PMB), concanavalina A (ConA), lipopolisaccaride (LPS), mitomicina C e 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina (TMB) sono stati ottenuti da Sigma (USA). Il siero fetale bovino (FBS) è stato acquistato da Biological Industries. Il kit per il conteggio cellulare-8 (CCK-8) è stato acquistato da Biosharp (Cina). I coniugati di capra anti-topo IgG/IgG1/IgG2a-HRP provenivano da Southern Biotech (USA). Inject Alum proveniva da Thermo Scientific Pierce (USA). GM-CSF proveniva da Peprotech (USA). Anticorpi fluorescenti (anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE, anti-CD62L-PE, anti-MHCII -FITC/Percp-cy5.5, anti-IL-4-PE, anti-IFN– -PE, anti-CD86-APC, anti-CD40-FITC/PE, anti- CD11c-PE/FITC, anti-CD80-APC), Golgistop, Cytofix/Cytoperm e Perm/Wash buffer provenivano tutti da BD Bioscience (USA). Il kit di colorazione dei linfociti T regolatori proveniva da eBiosciences (USA). TAK-242 proveniva da MedchemExpress (Shanghai, Cina). PDTC proveniva da Beyotime Biotechnology (Cina). Il kit di analisi del flusso multi-analita proveniva da Biolegend (USA).

2.2. Preparazione di AECCD C. deserticola

(Un campione di voucher n. CD10041602) è stato identificato dal professor Jiang He. L'AECCD è stato ottenuto mediante estrazione dell'acqua, precipitazione con etanolo e il metodo di deproteinizzazione con alcune modifiche minori (Zhang et al., 2018). In breve, coltivatoCistanchedeserticoè stato prima estratto con acqua molte volte e poi i polisaccaridi grezzi sono stati precipitati per una notte aggiungendo etanolo secondo un rapporto in volume di 1:4. Quindi i polisaccaridi grezzi ottenuti sono stati deproteinizzati con il metodo Sevag (Liu et al., 2012). Il contenuto totale di zucchero è stato rilevato pari al 76,82% con il metodo dell'acido antrone-solforico (Dubois et al., 1951).

2.3. Analisi spettroscopica a infrarossi

Allo scopo di analizzare i gruppi funzionali organici, AECCD con KBr è stato pressato in pellet per la misurazione degli spettri a infrarossi (IR). Gli spettri IR dei campioni sono stati determinati entro 4000–400 cm-1.

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2.4. Esperimenti in vivo

2.4.1. Immunizzazione animale

Topi femmine C57BL/6 e topi ICR (di 6 settimane) della Xinjiang Medical University (Urumqi, Cina) sono stati acclimatati per 3 giorni. Tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con i regolamenti del Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali dello Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering in Xinjiang University (BRGE-AE001).

I topi sono stati immunizzati per via sottocutanea con OVA da solo o OVA con diverse concentrazioni di AECCD e potenziati il ​​giorno 14 in base ai diversi gruppi come segue (6 topi in ciascun gruppo): gruppo di controllo (0.9% NaCl), gruppo OVA ( 10 ug OVA), gruppo AECCD-H (AECCD 800 ug), gruppo OVA/AECCD-L (10 ug OVA, AECCD 200 ug), gruppo OVA/AECCD-M (10 ug OVA, AECCD 400 ug) ), gruppo OVA/AECCD-H (10 ug OVA, AECCD 800 ug) e gruppo OVA/Alum (10 ug OVA, Alum100 ug). Le formulazioni del vaccino in 100 μL di NaCl allo 0,9% sono state iniettate in due siti diversi (50 μL in ciascun sito) nella pelle posteriore di ciascun topo. Dopo la vaccinazione, i campioni di sangue sono stati raccolti dal plesso retroorbitale e i sieri sono stati acquisiti e conservati a -80 ◦C per l'ulteriore analisi del rilevamento delle IgG. La proliferazione degli splenociti e il rilevamento di citochine, sottoinsiemi di cellule T, marcatori di superficie di DC e Treg sono stati condotti dopo lo stesso protocollo di vaccinazione.

2.4.2. Analisi degli anticorpi

I titoli di IgG nel siero contro OVA sono stati determinati mediante ELISA nei giorni 14, 28, 42 e 56 dopo la vaccinazione primaria menzionata in precedenza (Zhang et al., 2018). IgG1 e IgG2a sono stati misurati il ​​giorno 21. L'assorbanza a 450 nm/630 nm è stata ottenuta utilizzando un lettore (Bio-Rad, USA). I risultati della risposta anticorpale sono espressi come titoli IgG e gli isotipi IgG1 e IgG2a sono espressi come assorbanze corrispondenti.

2.4.3. Saggio di proliferazione splenocitaria

Il test di proliferazione degli splenociti nei topi è stato eseguito con un kit di test CCK-8 secondo le istruzioni del produttore. Il giorno 21 dopo la prima immunizzazione, gli splenociti sono stati isolati dalla milza dei topi immunizzati e gli eritrociti sono stati lisati dopo la macinazione. Gli splenociti (1 × 106 cellule/pozzetto) sono stati stimolati con OVA (10 ug/mL), OVA323-339 (10 ug/mL), ConA (10 ug/mL) e LPS (10 ug/mL) per due giorni e celle vuote sono state utilizzate come controllo. L'attività di proliferazione è stata espressa come indice di stimolazione (SI), che è stato calcolato il rapporto di assorbanza di una cellula stimolata rispetto a una cellula non stimolata sotto la lunghezza d'onda di 570/630 nm.

2.4.4. Analisi della fenotipizzazione dei linfociti T nei linfonodi drenanti e nella milza

Le sospensioni di splenociti dai linfonodi e dalla milza nei topi immunizzati sono state ottenute secondo il metodo sopra menzionato (Zhang et al., 2018). Dopo il lavaggio, i campioni (1 × 106 cellule/pozzetto) sono stati colorati per 30 minuti con anticorpi per marcatori di superficie, inclusi anti-CD3-PE, anti-CD4-APC, anti-CD8a-FITC, anti-CD44-PE e anti-CD62L-PE. I livelli di linfociti T sono stati esaminati mediante citometria a flusso. I risultati dei fenotipi dei linfociti T sono espressi come percentuali di cellule T CD4 più (percentuale), cellule T CD8 più (percentuale), cellule T CD44 più (percentuale) e cellule T CD62L più (percentuali).

2.4.5. Analisi flusso-citometrica dei livelli di citochine

Ai fini dell'analisi della colorazione delle citochine intracellulari, i linfociti splenici sono stati separati e trasformati in una sospensione unicellulare il giorno 21 dopo la prima immunizzazione (Zhang et al., 2017). I campioni (2 × 106 cellule/mL) stimolati con OVA (10 ug/mL) sono stati incubati per 4 h. Successivamente è stato aggiunto Golgistop per 12 h. I campioni sono stati quindi lavati, bloccati e colorati con anticorpi anti-CD4-APC o anti-CD8a-FITC per 30 minuti. Dopo la fissazione e la permeabilizzazione con Cyto fix/Cytoperm, i campioni sono stati quindi etichettati con anticorpi anti-IL-4-PE o anti –IFN– -PE. L'analisi del flusso è stata eseguita per determinare il livello di citochina.

2.4.6. Stima dell'attivazione delle DC e delle cellule Treg in una milza

Per indagare se DC e Treg svolgono un ruolo nel potenziatoimmunerispostacontro OVA, il giorno 3 dopo la prima vaccinazione, sono stati raccolti linfociti splenici da topi immunizzati per la valutazione della maturazione delle DC (Zhang et al., 2017). Le cellule sono state rispettivamente bloccate e incubate con anti-CD11c-PE/FITC, anti-CD40-PE, anti-CD86-APC, anti-CD80-APC e anti-MHCII- FITC per 30 min. Le cellule sono state analizzate mediante citometria a flusso. Il giorno 21 dopo la prima immunizzazione, le Treg sono state testate con il kit di colorazione dei linfociti T regolatori di topo. Gli splenociti sono stati colorati con anti-CD4-FITC per i marcatori di superficie cellulare, seguito da colorazione intracellulare con anti-CD25-APC e anti-Foxp3-PE secondo le istruzioni del produttore. Il livello di cellule CD4 più CD25 più Foxp3 più è stato determinato mediante citometria a flusso.

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2.5. Esperimenti in vitro

2.5.1. Generazione di DC, vitalità cellulare e livelli di endotossine

Le DC derivate dal midollo osseo di topi C57BL/6 sono state ottenute secondo il metodo descritto in precedenza (Inaba et al., 1992). In breve, le cellule sono state coltivate con terreno completo RPMI-1640 (20 ng/mL GM-CSF e 5 ng/mL IL-4). Dopo sei giorni, tutte le cellule sospese sono state raccolte come DC immature per i saggi successivi. La percentuale di CD11c più DC nelle cellule non aderenti è stata determinata al 94% mediante citometria a flusso.

La vitalità cellulare di DC e splenociti di topi su AECCD è stata rilevata con il kit CCK{{0}} secondo le istruzioni del produttore. Le cellule da DCS e splenociti sono state ottenute e quindi stimolate con diverse concentrazioni di AECCD (0, 10, 100, 400, 800 e 1600 ug/mL). La vitalità cellulare è stata espressa come rapporto tra l'assorbanza del gruppo trattato e l'assorbanza del gruppo di controllo) × 100 percento.

Allo scopo di escludere l'effetto dell'endotossina nell'AECCD, dopo che AECCD (100, 200 e 400 ug/mL) e LPS (100 ng/mL) sono stati pretrattati con PMB (100 ug/mL) per 60 min, DC (5 × 105 cellule/mL) sono state incubate con AECCD pretrattato (100, 200 e 400 ug/mL) e LPS per 12 ore. Dopo il trattamento di cui sopra, sono stati valutati i livelli di CD40, CD86, CD80 e MHCII.

2.5.2. Analisi del fenotipo DC

I livelli di molecole costimolatorie sono stati determinati per valutare la maturazione attraverso esperimenti in vitro. Il sesto giorno, le DC sono state trattate con AECCD (20, 100, 200 e 400 ug/mL) o LPS (100 ng/mL) per 12 ore. Quindi, le DC sono state colorate con molecole di superficie e analizzate mediante citometria a flusso.

2.5.3. Produzione di citochine da parte delle DC in vitro

Il supernatante di coltura cellulare è stato raccolto per misurare il livello di citochine utilizzando un kit ELISA o un kit di analisi del flusso multi-analita con il metodo CBA. Tutte le fasi sperimentali sono state eseguite secondo le istruzioni del produttore.

2.5.4. Reazione linfocitaria mista allogenica (MLR)

Gli splenociti di topi BALB/c sono stati ottenuti asetticamente in terreno RPMI- 1640 (Zhang et al., 2018). Le DC C57BL/6 mature (maturate in presenza di diverse concentrazioni di AECCD o LPS) sono state pretrattate con 50 ug/mL di mitomicina C per 60 minuti a 37 ◦C. Dopo il lavaggio, le DC sono state miscelate con gli splenociti secondo un rapporto di 1:5 o 1:10 per 2 giorni. La proliferazione cellulare è stata determinata mediante saggio MTT.

2.5.5. Esperimenti di neutralizzazione degli inibitori

Per studiare la via NF-κB correlata a TLR4-, le DC raccolte sono state caricate su una 24-piastra a pozzetti e quindi pretrattate con TAK-242 (5 μM) o PDTC (5 μM) , rispettivamente. Dopo 1-h di incubazione, le cellule sono state stimolate con diverse concentrazioni di AECCD (100, 200 e 400 ug/mL) o LPS (100 ng/mL) per 24 h. Quindi, i livelli di espressione delle molecole di superficie e delle citochine nei surnatanti di coltura sono stati determinati secondo i metodi sopra descritti.

3. Risultati

3.1. Spettroscopia FTIR

I principali picchi di assorbimento di AECCD in Fig. 1 erano picchi di assorbimento caratteristici delle strutture glicosidiche corrispondenti alla vibrazione di allungamento O–H a 3342,95 cm−1. La banda a 2933,54 cm−1 aveva il caratteristico debole assorbimento delle vibrazioni di allungamento C–H. Il picco a 1657,39 cm-1 è stato attribuito alla vibrazione flessionale O–H. L'assorbimento a 1411.00 cm− 1 è stato attribuito a vibrazioni di allungamento O–H o C–H e C–O. I picchi a 1018,38 cm-1 indicavano anche le vibrazioni della banda glicosidica CO e C–O–C.

Fig. 1. Spettri FTIR di AECCD.

3.2. Risposta anticorpale sierica OVA-specifica

I sieri dei topi immunizzati sono stati testati per verificare la presenza di anticorpi generati (IgG, IgG1 e IgG2a) contro OVA. Come mostrato in Fig. 2A, i titoli di IgG nei topi immunizzati con OVA/AECCD-M hanno suscitato IgG totali più elevati (titoli: 220,000, 25{{30}}, 000 e 250,{9}}) rispetto a quelli del gruppo OVA (titoli: 100,000, 100,{13}} e 120,000), ed era vicino al gruppo Alum (titoli: 250,000, 250,{19}} e 270,000) nei giorni 28, 42 e 56 dopo la vaccinazione primaria. OVA/AECCD-M/H ha migliorato significativamente i livelli di IgG1 rispetto al gruppo OVA (P <0,05) e="" la="" differenza="" tra="" il="" gruppo="" ova/aeccd-m/h="" e="" il="" gruppo="" alum="" non="" era="" significativa="" (p=""> 0,05). Anche i livelli di IgG2a di OVA/AECCD-M/H sono notevolmente migliorati rispetto al gruppo OVA e al gruppo Alum (Fig. 2B e C) (P <0,05). i="" livelli="" aumentati="" di="" igg2a="" potrebbero="" prevenire="" una="" malattia="" che="" richiede="">immunerisposta.

Fig. 2. Titoli anticorpali specifici per OVA e isotipi di IgG nel siero. I campioni di siero sono stati raccolti dopo immunizzazioni primarie e di richiamo per anticorpi con ELISA. (A) I titoli IgG del siero raggruppato sono stati valutati nei giorni 14, 28, 42 e 56 dopo la prima immunizzazione. (B–C) IgG1 e IgG2a sono stati misurati il ​​giorno 21 dopo la prima immunizzazione. I dati sono presentati come media ± DS (n=6). *P < 0.05="" rispetto="" a="">

3.3. Risposte immunitarie cellulari

La proliferazione dei linfociti della milza è stata studiata mediante il test MTT sotto stimolazione con OVA o OVA{{0}}. L'analisi della proliferazione ha rivelato che OVA/AECCD-M entrambi hanno aumentato notevolmente la proliferazione degli splenociti dopo l'esposizione a OVA, OVA323-339, Con A o LPS rispetto al gruppo OVA. OVA e OVA323-339 hanno migliorato significativamente la risposta di proliferazione più elevata rispetto a quella del gruppo Alum (Fig. 3) (P <>

Fig. 3. Proliferazione di splenociti dopo trattamento con AECCD in vivo. Gli splenociti sono stati nuovamente stimolati con OVA, OVA323-339, ConA o LPS e misurati con il metodo MTT il giorno 21 dopo la prima immunizzazione. La proliferazione cellulare è stata mostrata come indice di stimolazione (SI): (A–B) Indice di stimolazione di OVA e OVA323-339. (C–D) Indice di stimolazione di ConA e LPS. I dati sono presentati come media ± DS (n=5). *P<0.05, **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001="" compared="" to="" ova;="" #p="" <="" 0.05="" and="" ##p="" <="" 0.01="" compared="" to="" ova/="">

3.4. Attivazione di sottoinsiemi di cellule T nei linfonodi drenanti e nella milza

I linfonodi e la milza di topi immunizzati sono stati raccolti per rilevare i sottogruppi di cellule T il giorno 21 dopo la vaccinazione primaria. La percentuale di sottogruppi di cellule T (CD4 più, CD8 più, CD44 più cellule T) dai linfonodi nel gruppo OVA/AECCD-M era significativamente superiore a quella del gruppo OVA e del gruppo Alum (Fig. 4A-D) (P < 0.05).="" le="" percentuali="" di="" sottoinsiemi="" di="" cellule="" t="" (cd4="" plus,="" cd8="" plus,="" cd44="" plus="" e="" cd62l="" plus="" cellule="" t)="" in="" una="" milza="" erano="" significativamente="" superiori="" a="" quelle="" del="" gruppo="" ova="" (fig.="" 4e-j)="" (p=""><0,05). questi="" risultati="" hanno="" indicato="" che="" l'aeccd="" promuoveva="" la="" cellula="">immunerisposta.

Fig. 4. Livelli di sottoinsiemi di cellule T nei linfonodi drenanti e nella milza in vivo. Il giorno 21 dopo la prima vaccinazione, le cellule dei linfonodi e della milza sono state utilizzate per rilevare i sottogruppi di cellule T mediante citometria a flusso. (A–D) Percentuali di cellule T CD4 plus, CD8 plus e CD44 plus nei linfonodi. (E-J) Percentuali di cellule T CD4 plus, CD8 plus, CD44 plus e CD62L plus in una milza. I dati sono presentati come media ± DS (n=5). *P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01="" e="" ***p="">< 0,001="" rispetto="" all'ova;="" #p="">< 0,05="" e="" ##p="">< 0,01="" rispetto="" a="">

3.5. Citochine secrete dagli splenociti restimolati in vivo

"Le citochine Th1/Th2 della milza di topi immunizzati sono state determinate mediante colorazione intracellulare il giorno 21 dopo la prima vaccinazione. I livelli di CD4 più IL-4, CD4 più IFN- e CD8 più IFN- nel gruppo OVA/AECCD-M erano significativamente superiori a quelli del gruppo OVA e del gruppo Alum (P < 0="" .05,="" fig.="" 5).="" le="" differenze="" hanno="" indicato="" che="" l'aeccd="" potrebbe="" stimolare="" le="" risposte="" th1/th2,="" in="" particolare="" mediate="" dai="" linfociti="">immunerisposta.

Fig. 5. Analisi di citochine antigene-specifiche in cellule T in vivo. Gli splenociti di topi immunizzati sono stati esaminati il ​​giorno 21 dopo la prima immunizzazione mediante colorazione con citochine intracellulari. (A) Percentuali di CD4 più IL-4. (B–C) Percentuali di CD4 più IFN- e CD8 più IFN- . I dati sono presentati come media ± DS (n=5). *P < {{10}}.05="" e="" **p="">< 0,01="" rispetto="" all'ova;="" #p="">< 0,05="" rispetto="" a="">

3.6. Maturazione DC e Treg in vivo

L'attivazione della CC può avviare l'immunità adattativa. Gli effetti dell'AECCD sulla maturazione delle DC nei topi immunizzati sono stati valutati il ​​giorno 3 dopo la prima immunizzazione. OVA/AECCD-M ha indotto i livelli più alti di CD40, CD80, CD86 e MHCII sulle DC rispetto al gruppo OVA e la differenza tra OVA/AECCD-M il gruppo e il gruppo Alum erano significativi (Fig. 6A-D) (P <0,05). la="" frequenza="" di="" cd4="" più="" cd25="" più="" foxp3="" più="" tregs="" nel="" gruppo="" ova/aeccd-m="" era="" notevolmente="" inferiore="" a="" quella="" nel="" gruppo="" ova="" (fig.="" 6e)="" (p=""><0,05). questi="" dati="" hanno="" suggerito="" che="" l'aeccd="" potrebbe="" attivare="" dc="" e="" ridurre="" la="" frequenza="">

Fig. 6. Effetti dell'AECCD sulla maturazione delle DC e sulle Treg in vivo. Gli splenociti di topi ICR sono stati utilizzati per rilevare molecole costimolatorie su DC e Treg il giorno 3 o 21 dopo la prima immunizzazione. (A–D) Percentuali di CD40, CD86, CD80 e MHCII su CD11c più controller di dominio. (E) Percentuali di CD4 più CD25 più Foxp3 più Treg. I dati sono presentati come media ± DS (n {{10}}). *P < 0,05="" e="" **p="">< 0,01="" rispetto="" a="" ova;="" #p="">< 0,05="" e="" ##p="">< 0,01="" rispetto="" a="">

3.7. Saggi di citotossicità e contaminazione da endotossine

Dopo il trattamento con diverse concentrazioni di AECCD per 2 giorni, le cellule di DCS e splenociti di topo sono state utilizzate per determinare la potenziale citotossicità con il kit CCK-8. Non c'era una risposta di proliferazione inibita significativa nella vitalità cellulare di DC e splenociti rispetto a quella dei gruppi di controllo (Fig. 7A-B) (P > 0.05). Questi risultati hanno mostrato che l'AECCD alla concentrazione di 10–1600 ug/mL non ha mostrato citotossicità significativa per DC e splenociti rispetto al controllo (P > 0,05). Pertanto, la concentrazione di AECCD negli esperimenti successivi è stata fissata a meno di 1600 ug/mL.

Per escludere l'interferenza della contaminazione da endotossine negli effetti dell'AECCD sull'attivazione delle DC, è stato utilizzato il PMB, un antibiotico ampiamente riconosciuto per il suo effetto neutralizzante LPS, per escludere la contaminazione da endotossine (Morrison e Jacobs, 1976). Come illustrato in Fig. 7C–F, i livelli di espressione di CD40, CD80, CD86 o MHC-II nelle DC trattate con AECCD in presenza di PMB non hanno mostrato cambiamenti significativi ( P > 0,05). Tuttavia, è stato osservato un drastico calo dei livelli di espressione di CD40, CD80 CD86 e MHC-II nelle DC trattate con LPS in presenza di PMB (P <0,001). questi="" risultati="" hanno="" dimostrato="" che="" l'aeccd="" era="" privo="" di="" contaminazione="" da="">

Fig. 7. Citotossicità ed effetti di PMB sulla maturazione indotta di DC su AECCD. (A-B) DCS e splenociti di topi sono stati coltivati ​​in presenza di AECCD per 2 giorni per determinare la vitalità cellulare con il metodo MTT. (C–F) Le DC sono state incubate per 12 ore con AECCD o LPS pretrattate in presenza/assenza di PMB per 60 min. Sono state determinate le percentuali di CD40, CD80, CD86 e MHCII su CD11c più controller di dominio. I dati sono presentati come medie ± SD (n =3). **P < 0,01="" e="" ***p="">< 0,001="" rispetto="" al="" gruppo="" con="">

3.8. Maturazione fenotipica e attivazione funzionale delle DC in vitro

Sulla base degli esperimenti di immunizzazione di cui sopra, la maturazione fenotipica delle DC è stata ulteriormente esplorata dopo il trattamento con AECCD in vitro. Il giorno 6, le DC immature sono state stimolate con una data concentrazione di AECCD o LPS per analizzare le molecole di superficie. Maturazione cellulare indotta da AECCD caratterizzata da un aumento significativo delle percentuali di CD40, CD80 CD86 e MHC II in modo dose-dipendente (P <0,001, fig.="" 8a–d).="" una="" simile="" maturazione="" fenotipica="" delle="" dc="" è="" stata="" osservata="" anche="" dopo="" la="" stimolazione="" con="" 100="" ng/ml="" lps.="" i="" dati="" dell'analisi="" hanno="" rivelato="" che="" l'aeccd="" ha="" migliorato="" la="" maturazione="" delle="">

Dai risultati di cui sopra, l'AECCD ha migliorato la maturazione fenotipica delle DC. Al fine di osservare l'effetto dell'AECCD sulla funzione delle DC in vitro, la capacità delle DC trattate con AECCD di stimolare la proliferazione delle cellule T allogeniche in un MLR con un rapporto DC-splenociti di 1:5 o 1:10 è stata indagato. Le DC trattate con diverse concentrazioni di AECCD hanno indotto una significativa proliferazione delle cellule T rispetto alle DC non trattate (Fig. 8E-F) (P <{13}}.001). la="" maturazione="" delle="" dc="" potrebbe="" indurre="" la="" produzione="" di="" citochine.="" successivamente,="" i="" surnatanti="" di="" dc="" trattati="" con="" aeccd="" o="" lps="" sono="" stati="" rilevati="" dal="" kit="" elisa.="" i="" livelli="" di="" il-12="" e="" tnf-="" nei="" supernatanti="" delle="" dc="" sono="" stati="" notevolmente="" aumentati="" in="" modo="" dose-dipendente="" (p=""><0,001, fig.="">

Fig. 8. Maturazione fenotipica e attivazione funzionale delle DC dopo trattamento AECCD in vitro. (A–D) Il giorno 6, le DC sono state trattate con una data concentrazione di AECCD o LPS per 12 ore. Le cellule sono state colorate con anticorpi e determinate mediante citometria a flusso. Intensità di fluorescenza media (MFI) di CD40, CD80, CD86 e MHCII su CD11c più DC. (E–F) Le DC C57BL/6 trattate con diverse concentrazioni di AECCD o LPS sono state miscelate con splenociti di topi BALB/c in un rapporto di 1:5 o 1:10 in un MLR per 2 giorni. La proliferazione cellulare è stata determinata mediante saggio MTT. (G–H) I supernatanti di coltura delle DC sono stati analizzati per IL-12 e TNF-a mediante kit ELISA. I dati sono presentati come medie ± DS (n =3). *P < 0.05,="" **p="">< 0,01="" e="" ***p="">< 0,001="" rispetto="" ai="" controller="" di="" dominio="" non="" trattati;="" #p="">< 0,05="" rispetto="" a="">

3.9. TLR4, un recettore per AECCD su DC

La DCS può avviare la segnalazione cellulare da parte dei recettori di membrana. Perdeterminareil ruolo di TLR4 nella partecipazione alla maturazione delle DC trattate con AECCD, dopo il pretrattamento con l'inibitore TLR4 TAK-242, le DC sono state stimolate con una data concentrazione di AECCD, quindi lo stato di attivazione delle DC è stato esaminato mediante citometro a flusso . I livelli di espressione delle citochine nei supernatanti di coltura sono stati analizzati mediante un kit di analisi del flusso multi-analita. La sovraregolazione di CD40, CD80, CD86 e MHC-II indotta da AECCD è stata significativamente inibita bloccando le vie TLR4 (P <0,01, fig.="" 9a–d).="" inoltre,="" rispetto="" al="" controllo="" non="" trattato,="" il="" blocco="" di="" tlr4="" con="" tak-242="" ha="" avuto="" un="" effetto="" di="" inibizione="" più="" significativo="" sulla="" produzione="" di="" ifn-,="" tnf-="" e="" il-6="" (p=""><0,01, fig.="" 9e–g)="">

Fig. 9. Attivazione della segnalazione TLR4 in DC trattate con AECCD. Dopo che le DC immature sono state trattate con AECCD in assenza o presenza di TAK-242 per 12 ore, la maturazione fenotipica è stata esaminata dal citometro a flusso e i livelli di citochine nei surnatanti erano con il metodo CBA. (A–D) Percentuali di CD40, CD80, CD86 e MHCII su CD11c più controller di dominio. (E–G) Livelli di IFN-, TNF- e IL-6. I dati sono presentati come medie ± SD (n=3). **P < 0,01="" e=""><0.001 compared="" to="" the="" group="" with="">

3.10. Attivazione di CC da parte di AECCD tramite il percorso NF-κB correlato a TLR4-

Per indagare se le espressioni delle molecole di superficie e delle citochine delle DC trattate con AECCD fossero regolate da NF-κB dopo che le DC immature pretrattate con l'inibitore NF-κB PDTC sono state stimolate con AECCD per 12 ore, i livelli di espressione delle molecole costimolatorie e delle citochine sono stati misurati da citometro a flusso. I livelli di CD40, CD80 CD86 e MHC-II indotti da AECCD sono stati significativamente ridotti rispetto al controllo non trattato bloccando le vie NF-κB con i corrispondenti inibitori (P < 0,001,="" fig.="" 10a–d).="" contemporaneamente,="" anche="" l'espressione="" di="" ifn-,="" tnf-="" e="" il-6="" è="" stata="" significativamente="" inibita="" dal="" pdtc="" (p=""><0,05, fig.="">

Fig. 10. Coinvolgimento di NF-κB nell'attivazione DC indotta da AECCD. Le DC sono state trattate con AECCD in assenza o in presenza di PDTC per 24 ore. (A–D) Le percentuali di CD40, CD80, CD86 e MHCII su CD11c più DC sono state determinate mediante citometria a flusso. (E–G) I livelli di IFN-, TNF- e IL-6 nel supernatante sono stati determinati con il metodo CBA. I dati sono presentati come medie ± DS (n=3).*P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" e="" ***p="">< 0,001="" rispetto="" al="" gruppo="" con="">

4. Discussione

Attualmente, vari polisaccaridi della MTC sono stati studiati come adiuvanti per vaccini umani e animali (Sun et al., 2018; Rey-Ladino et al., 2011). In questo studio, gli effetti immunomodulatori dell'AECCD e il meccanismo di attivazione primaria delle DC sono stati studiati in vivo e in vitro mediante una serie di esperimenti al fine di valutare l'adattamentoimmunerispostacontro OVA e lo stato di attivazione di DCS. Esperimenti in vivo hanno indicato che l'AECCD promuoveva notevolmente la produzione di isotipi IgG e IgG specifici dell'OVA, migliorava la proliferazione degli splenociti e induceva l'attivazione delle cellule T e le citochine (IL-4/IFN-). Inoltre, l'AECCD ha migliorato la maturazione della DC e ha mostrato una diminuzione delle Treg. Questi risultati hanno suggerito che la funzione di AECCD come adiuvante efficiente è stata realizzata promuovendo la maturazione delle DC e inibendo le Treg. Esperimenti in vitro hanno indicato che l'AECCD promuoveva la maturazione fenotipica delle DC, la sezione delle citochine e l'attività allostimolatoria tramite il percorso NF-κB correlato a TLR4-. Questi risultati sperimentali hanno indicato che l'AECCD aveva un potenziale significativo come stimolatore immunitario.

Ogni adiuvante ha caratteristiche immunitarie uniche contro diversi antigeni, indicando che gli adiuvanti hanno un potenziale di applicazione in diverse malattie. In primo luogo, sono state testate le proprietà adiuvanti della co-somministrazione di AECCD con OVA determinandone gli effetti sull'adattamentoimmunerispostanei topi. Molti studi hanno dimostrato che le attività immunostimolanti erano direttamente proporzionali alla dose entro un certo intervallo (Li et al., 2020; Reed et al., 2020; Zhang et al., 2017). Allo stesso modo, nello studio, l'analisi dell'anticorpo e dell'isotipo ha rivelato che l'AECCD in un determinato intervallo di dose migliorava le risposte IgG, IgG1 e IgG2a specifiche dell'OVA e che la dose media di AECCD era la dose ottimale. Negli esperimenti successivi, abbiamo principalmente studiato l'effetto stimolatorio dell'AECCD a una dose media ottimale. La dose media di AECCD ha aumentato significativamente la risposta alla proliferazione degli splenociti nei topi immunizzati, indicando che l'AECCD ha promossoimmunerispostecontro OVA. Questi risultati hanno suggerito che l'AECCD migliorava sia l'umorale che quello cellulareimmunerisposte, che erano associati al potenziale adiuvante.
La sostanziale attività dei linfociti T suscitata può favorire l'eradicazione della malattia. Durante unimmunerisposta, i linfociti T attivati ​​possono raggiungere i tessuti linfoidi secondari, inclusi milza e linfonodi (Steinman, 2012). La dose media di AECCD ha effettivamente migliorato l'efficacia del vaccino in quanto potrebbe aumentare significativamente le risposte delle cellule T CD4, CD8, CD44 e CD62L nel drenare i linfonodi e la milza. Le cellule T CD8 attivate hanno mediato l'eradicazione del patogeno secernendo IFN-. Le cellule T CD4 proliferate sono state differenziate in cellule Th1 e cellule Th1. Le cellule Th1 hanno secreto la citochina Th1 per stimolare la proliferazione dei linfociti e le cellule Th2 hanno secreto la citochina Th2 per aumentare la produzione di anticorpi (Seder et al., 2008). Nello studio, i livelli di CD4 più IL-4, CD4 più IFN- e CD8 più IFN- sono stati aumentati di AECCD a una dose media. AECCD ha indotto una risposta Th1/Th2 bilanciata e ha diretto ilimmunerispostaalterando la rete di citochine.

Un adiuvante dovrebbe indurre un'immunità specifica e controllare l'esito diimmunerispostaregolando lo stato delle DC in numerosi punti (Carrera Silva et al., 2013). L'espressione delle molecole di superficie sulle DC è un indicatore cruciale per valutare la maturazione delle DC ed è tipicamente correlata alla differenziazione dei linfociti T (Steinman, 2012). In questo studio, l'AECCD ha migliorato l'espressione delle molecole costimolatorie e ha facilitato la maturazione delle DC quando è stato utilizzato come adiuvante contro gli OVA. Questo potrebbe essere uno dei modi in cui l'AECCD ha promosso umorale e cellulareimmunerisposte. Nel frattempo, l'AECCD ha anche ridotto la frequenza di CD4 più CD25 più Foxp3 più Treg, che ha fornito un'immunità equilibrata dopo la vaccinazione. I nostri risultati hanno supportato le recenti scoperte secondo cui vari polisaccaridi della MTC erano il regolatore della maturazione delle DC (Bo et al., 2019; Li et al., 2015; Zhu et al., 2016).

Attivazione di adattativoimmunerispostedai polisaccaridi adiuvanti è mediata principalmente dal loro riconoscimento da parte di specifici recettori delle DC (Akira, 2004). Le DC attivate attraverso percorsi correlati a TLR4-possono secernere vari immunomodulatori come mediatori critici contro le infezioni (Akira, 2007). Pertanto, in esperimenti successivi, abbiamo esplorato in via preliminare il meccanismo molecolare dell'effetto stimolatorio dell'AECCD sulle DC in vitro. Al fine di osservare la citotossicità dell'AECCD, è stata innanzitutto determinata la vitalità cellulare delle DC e degli splenociti dei topi. AECCD a 10–1600 ug/mL non ha mostrato citotossicità per DC e splenociti. Per escludere la contaminazione da LPS, abbiamo pretrattato AECCD con PMB. I livelli di espressione di CD40, CD80 CD86 e MHC-II nelle DC trattate con AECCD non erano diminuiti, ma il PMB ha efficacemente inibito l'espressione delle molecole costimolatorie nelle DC trattate con LPS. Ciò ha dimostrato che l'AECCD era privo di contaminazione da endotossine. Successivamente, è stato ulteriormente esplorato lo stato di attivazione dei controller di dominio. Simile alle DC trattate con LPS, in modo dose-dipendente, le DC trattate con AECCD hanno aumentato i livelli di CD40, CD80 CD86 e MHC II, nonché la produzione della citochina pro-infiammatoria, che era un parametro di maturazione funzionale delle DC. In un MLR, la capacità di proliferazione delle cellule T allogeniche è stata valutata in DC trattate con AECCD. L'AECCD potrebbe innescare e attivare i linfociti T allogenici. Le DC sono state prima pretrattate con mitomicina C e quindi lavate accuratamente per rimuovere questo reagente, quindi è improbabile che gli effetti dell'AECCD sulle DC siano attribuiti all'attività mitogenica. I dati sperimentali hanno rivelato che la maturazione fenotipica e l'attivazione funzionale delle DC potrebbero essere attribuite alla stimolazione da AECCD.

Un certo numero di polisaccaridi MTC potrebbero stimolare la maturazione delle DC tramite TLR4. NF-κB come membro della via a valle correlata a TLR4-svolge un ruolo importante nella regolazione della maturazione fenotipica e funzionale delle DC e nell'induzione dell'espressione di vari geni coinvoltiimmunerisposte(Qi et al., 2016; Re e Strominger, 2001; Wei et al., 2016; Zhu et al., 2013). Attraverso esperimenti in vitro, abbiamo scoperto che AECCD promuoveva la maturazione delle DC e che TAK-242 (inibitore TLR4) e PDTC (inibitore NF-κB) diminuivano i livelli di espressione di CD40, CD80, CD86 e MHC -II e i livelli di secrezione di IFN-, TNF- e IL-6 su DC trattate con AECCD, questi risultati hanno indicato che TLR4 e NF-κB erano coinvolti nell'attivazione di DC indotta da AECCD e nella secrezione di citochine. Questi risultati erano coerenti con gli studi precedentemente riportati perché AECCD come adiuvante migliorava il targeting dell'antigene sulle DC.

In sintesi, i nostri risultati hanno mostrato che l'AECCD ha indotto risposte durevoli e Th1/Th2, in particolare mediate dai linfociti Timmunerispostacontro OVA. L'AECCD ha attivato le DC attraverso la via NF-κB mediata da TLR4-, migliorando così la produzione di immunomodulatori e la proliferazione delle cellule T allogeniche. L'AECCD può essere utilizzato come adiuvante efficace nello sviluppo del vaccino. Tuttavia, verrà eseguita un'analisi accurata dei componenti per determinare quale componente nelle DC attivate AECCD. Con un focus sui meccanismi relativi al modo in cui l'AECCD aumenta l'immunogenicità, inclusa l'ottimizzazione delle formulazioni adiuvanti e della via di somministrazione del vaccino, esploreremo ulteriormente i componenti immunomodulatori e le proprietà adiuvanti specifiche dell'AECCD allo scopo di progettare efficaci adiuvanti del vaccino contro le malattie infettive.

Cistanche benefici della deserticolapromuovere unimmunerisposta

Contributi dell'autore

Acquisizione, analisi e interpretazione dei dati: Shuangshuang Feng, Xiumei Yang, Xiang Weng. Stesura della bozza originale: Shuangshuang Feng, Xiang Weng.

Acquisizione del finanziamento:Ailian Zhang.

Indagine:Ailian Zhang.

Metodologia:Ailian Zhang, Bin Wang.

Supervisione:Ailian Zhang.

Dichiarazione di interesse concorrente

Gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo studio.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [numero di sovvenzioni 31960164 e 31660259] I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare, nella preparazione o nel manoscritto.

Gli autori ringraziano il Prof. Xingguo Zheng e Jiang He (Urumqi, Cina) per aver gentilmente fornito materiali e identificazione.

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