Rilascio mediato dai neutrofili CAR di nanofarmaci reattivi al microambiente tumorale per la chemioimmunoterapia del glioblastoma

Il glioblastoma (GBM) è uno dei tumori solidi più aggressivi e letali nell’uomo. Sebbene siano state sviluppate terapie efficaci, come le cellule T emergenti del recettore dell’antigene chimerico (CAR) e i chemioterapici, per trattare vari tumori, la loro efficacia nel trattamento del GBM è stata in gran parte ostacolata dalla barriera emato-encefalica e dalle barriere emato-encefaliche. I neutrofili umani attraversano efficacemente le barriere fisiologiche e mostrano immunità effettrice contro i patogeni, ma la breve durata di vita e la resistenza all’editing genomico dei neutrofili primari hanno limitato la loro ampia applicazione nell’immunoterapia. Qui progettiamo geneticamente cellule staminali umane pluripotenti con knock-in genetico mediato da CRISPR/Cas9- per esprimere vari costrutti CAR anti-GBM con domini di segnalazione CD3ζ specifici per T o specifici per neutrofili. I neutrofili CAR con la migliore attività antitumorale vengono prodotti per fornire e rilasciare nanofarmaci sensibili al microambiente tumorale in modo specifico e non invasivo per colpire il GBM senza la necessità di indurre ulteriore infiammazione nei siti tumorali. Questa chemio-immunoterapia combinata mostra attività anti-GBM superiori e specifiche, riduce la somministrazione di farmaci fuori bersaglio e prolunga la durata della vita nei topi femmine portatrici di tumore. Insieme, questo sistema biomimetico di somministrazione di farmaci CAR-neutrofili costituisce una piattaforma sicura, potente e versatile per il trattamento del GBM e possibilmente di altre malattie devastanti.

Benefici della cisanche tubulosa-Antitumor

Il glioblastoma (GBM) è caratterizzato da un alto tasso di mortalità, una breve durata di vita e una prognosi sfavorevole con un'elevata tendenza alla recidiva1,2. L’efficacia terapeutica sia della chirurgia che dei farmaci chemioterapici è ostacolata principalmente dalla sottile struttura cerebrale e dalla barriera fisiologica emato-encefalica (BBB) ​​o dalla barriera emato-encefalica-tumorale (BBTB)3-5. In particolare, la somministrazione di farmaci al sistema nervoso centrale (SNC) per il trattamento dei tumori cerebrali è molto impegnativa:<1% of administered nanoparticle dose is found to be delivered to a solid tumor based on 376 published datasets6, and 0.8% delivered to brain cancer7. Due to their native capacity to migrate towards inflamed sites, traverse BBB/BBTB, and infiltrate solid tumors, mouse neutrophil-mediated delivery of nanoparticulated chemo drugs has been investigated to enhance targeted drug delivery to the brain tumors for improved therapeutic efficacy8–10. However, an invasive surgical resection of the tumor or tumor microenvironment priming is needed to induce additional inflammation for neutrophil recruitment before neutrophil/chemotherapeutic administration, leading to limited neutrophil recruitment in tumor sites beyond the inflamed surgical margin11. Furthermore, neutrophil-delivered chemotherapeutics were primarily enriched in the spleen, but not in the targeted brain of tumor-bearing mice. While necrosis was not observed in the major organs of experimental mice, there are still concerns regarding off-target tissue toxicity or even systemic toxicity in patients12. Previous studies also focused on mouse neutrophils. The feasibility and safety of using human neutrophils in drug delivery remain elusive since neutrophils have a short lifespan and are prone to apoptosis ex vivo. In addition, massive neutrophil extraction from pre-surgical patients for drug loading may lead to neutropenia or other risks. Thus, a safe and effective human neutrophil-mediated biomimetic drug delivery system that utilizes the natural chemo-attractive GBM microenvironment is urgently needed.

L'immunità innata e la plasticità dei neutrofili contro vari tumori12-16, compreso il GBM, sono state meno esplorate rispetto alla loro applicazione come trasportatori cellulari nella somministrazione di farmaci8-10. I neutrofili circolanti nel sangue ospitano il microambiente tumorale ipossico (TME), dove diventano neutrofili eterogenei associati al tumore (TAN), un componente essenziale della TME immunosoppressiva che contribuisce alla progressione del cancro e alla resistenza terapeutica12,17. Simili ai macrofagi, i fenotipi antitumorali N1 e pro-tumorali N2 dei TAN sono stati trovati all'interno del TME18-21 ipossico. Sono state sviluppate varie strategie terapeutiche per colpire direttamente i neutrofili con particolare attenzione alla deplezione o all'inibizione dei neutrofili12,22, che hanno portato a diversi studi clinici (ad esempio, l'inibitore di CCR5 Maraviroc in NCT03274804). Pertanto, l'applicazione diretta di neutrofili non trattati come nanocarrier può rappresentare un rischio aggiuntivo per i pazienti affetti da cancro in cui i neutrofili deputati al traffico di droga possono essere riprogrammati sul fenotipo N2 protumorale immunosoppressore all'interno della TME dopo aver raggiunto i siti tumorali13,23. Inoltre, le attività antitumorali intrinseche dei neutrofili naïve dovrebbero essere esplorate e potenziate per ottenere un’efficacia terapeutica ottimizzata quando utilizzati come trasportatori di farmaci in combinazione con chemioterapici.

Benefici della cisanche tubulosa-rafforzare il sistema immunitario

La modifica del recettore dell'antigene chimerico (CAR) ha migliorato significativamente le attività antitumorali delle cellule T immunitarie o delle cellule natural killer (NK)24-27. Tuttavia, la loro efficacia nei tumori solidi è ancora limitata, in parte a causa del loro traffico relativamente basso e della loro capacità di penetrazione nel tumore. La presenza di BBB e BBTB fisiologici ostacola ulteriormente l’efficacia di queste terapie emergenti contro il GBM nel cervello. Abbiamo ipotizzato che la combinazione di ingegneria CAR e neutrofili altamente mobili potrebbe sostenere il loro fenotipo antitumorale N1 e produrre un'eccellente efficacia terapeutica nel trattamento del GBM. I neutrofili primari hanno vita breve e sono resistenti all’editing genomico28, limitando la loro applicazione nell’immunoterapia diretta al CAR. Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), che sono più accessibili all'editing genetico e in grado di differenziarsi massicciamente in neutrofili, potrebbero fornire una fonte illimitata di neutrofili CAR di alta qualità per l'immunoterapia mirata in condizioni chimicamente definite e prive di xeno29. I neutrofili inoltre fagocitano preferenzialmente agenti patogeni microbici con superfici ruvide o lunghe, come S. aureus ed E. coli30, che dovrebbero essere presi in considerazione per la progettazione delle nanoparticelle nella somministrazione di farmaci mediata dai neutrofili. Infatti, Safari et al. recentemente riportato la fagocitosi preferita di particelle allungate somministrate per via endovenosa, senza complicate modifiche superficiali, mediante circolazione di neutrofili30. Un design così semplice e bioispirato in nanoparticelle caricate con farmaci può massimizzare il caricamento del farmaco nei neutrofili e consentire livelli terapeutici di somministrazione del farmaco in siti mirati.

In this work, we design and screen four anti-GBM chlorotoxin (CLTX)-CAR constructs with T or neutrophil-specific signaling domains by knocking them into the AAVS1 safe harbor locus of hPSCs via CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination and identified an optimized CAR, composed of a 36-amino acid GBM-targeting CLTX peptide27, a CD4 transmembrane domain and a CD3ζ intracellular domain, for neutrophil-mediated tumor-killing. The resulting stable CAR-expressing hPSCs are then differentiated into CAR-neutrophils, which sustain an anti-tumor N1 phenotype and exhibit enhanced anti GBM activities under the hypoxic tumor microenvironment. A biode gradable mesoporous organic silica nanoparticle with a rough surface (R-SiO2) is synthesized and employed to load hypoxia-activated prodrug tirapazamine (TPZ) or clinical chemo-drug temozolomide (TMZ) and JNJ-64619187 (a potent PRMT5 inhibitor under clinical trial NCT03573310) into hPSC-derived CAR-neutrophils, which are unharmed by the nanoparticulated cargo and retain the inherent physiological properties of naïve neutrophils. CAR-neutrophils loaded with drug-containing SiO2 nanoparticles display superior anti-tumor activities against GBM, possibly due to a combination of CAR-enhanced direct cytolysis and chemotherapeutic-mediated tumor killing via cellular uptake and glutathione (GSH)-induced degradation of nanoparticles within the targeted tumor cells. In an in situ GBM xenograft model, hPSC-derived CAR-neutrophils precisely and effectively deliver TPZ-loaded SiO2 nanoparticles to the brain tumors without invasive surgical resection for amplified inflammation, significantly inhibiting tumor growth, and prolonging animal survival, representing a targeted and efficacious combinatory chemoimmunotherapy. Notably, Si content measurement suggests that>Il 20% dei nanofarmaci somministrati vengono somministrati ai tumori cerebrali dai neutrofili CAR rispetto all’1% dei nanofarmaci liberi. In sintesi, il nostro sistema biomimetico di somministrazione di farmaci CAR-neutrofili è una piattaforma sicura, potente e versatile per il trattamento del GBM e di altre malattie devastanti.

Benefici della cisanche tubulosa-Antitumor

Risultati

Screening delle strutture CAR specifiche dei neutrofili per attività antitumorali potenziate

To engineer CAR-neutrophils for targeted drug delivery to brain tumors (Fig. 1a–b), we first designed and tested 4 different CAR structures optimized for anti-tumor activities of hPSC-neutrophils. All CAR structures shared the same extracellular granulocyte-macrophage colony-stimulating factor receptor (GM-CSFR) signal peptide (SP), glioblastoma-targeting domain CLTX27, and IgG4 hinge29 (Fig. 2a). CAR #1 is a first-generation T cell-specific CAR that uses the CD4 transmembrane (TM) domain and CD3ζ intracellular signaling domain. CAR #2, CAR #3, and CAR #4 differ from CAR #1 in using a transmembrane domain from neutrophil-specific CD32a (or FcγRIIA), a single-chain transmembrane receptor that is highly expressed in neutrophils (30,000 to 60,000 molecules/cell31) and critical for neutrophil activation31–34. CAR #3 and CAR #4 also include an Fc domain γ-chain of CD32a, which relies on a highly conserved immunoreceptor tyrosine based activation motif (ITAM) to express and signal in neutrophils. Notably, CAR #3 contains a combo signaling domain by fusing CD32aITAM to the CD3ζ intracellular domain. Since primary neutrophils are short-lived and resistant to genome editing, we engineered human pluripotent stem cells (hPSCs) with these different CARs to achieve stable and universal immune receptor expression on differentiated neutrophils by knocking CAR constructs into the AAVS1 safe harbor locus via CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair (Fig. 2b). After nucleofection, single cell-derived hPSC clones were isolated and screened with puromycin for about two weeks. Genotyping identified successfully targeted hPSCs with an average CAR knock-in efficiency of >Il 90% e la maggior parte dei cloni presi di mira sono eterozigoti (Figura 1a-d supplementare). L'espressione CAR su hPSC ingegnerizzate è stata ulteriormente confermata dalla RT-PCR e dall'analisi della citometria a flusso di CLTX-IgG4 (Figura 1e-g supplementare). Come previsto, le hPSC che esprimono CAR hanno mantenuto alti livelli di espressione di marcatori pluripotenti, tra cui OCT4, SSEA4 e SOX2 (Figura 1f supplementare).

Per produrre neutrofili CAR de novo, le hPSC che esprimono CAR sono state prima differenziate in progenitori ematopoietici multipotenti e poi mieloidi con trattamento con citochine stadio-specifico35 (Fig. 2c). Il successivo impiego di G-CSF e dell'agonista dell'acido retinoico AM580 ha promosso una robusta produzione di neutrofili36. Simili alle loro controparti nel sangue periferico (PB), i neutrofili CLTX-CAR derivati ​​da hPSC presentavano la tipica morfologia dei neutrofili e marcatori di superficie CD16, CD11b, MPO, CD15, CD66b e CD18 (Figura 2 supplementare). Successivamente abbiamo determinato gli effetti dell'espressione CAR sulla citotossicità antitumorale dei neutrofili derivati ​​da hPSC co-coltivandoli con cellule U87MG di glioblastoma (GBM) in vitro. Come previsto, i neutrofili CLTX-CAR derivati ​​da hPSC presentavano una migliore capacità di uccidere il tumore rispetto ai neutrofili PB (Fig. 2d), in linea con le precedenti osservazioni nelle cellule CLTX CAR-T27. Tra questi diversi CAR, il CAR n. 1 ha mediato attività superiori di uccisione del tumore nei neutrofili hPSC. In particolare, il CAR #4 basato sulla catena è meno efficace nell'innescare l'uccisione del tumore mediata dai neutrofili, il che potrebbe essere dovuto alla minore copia di ITAM nella subunità ζ e alla minore espressione di CAR portanti sulla superficie cellulare28. I neutrofili rilasciano specie reattive dell'ossigeno citotossiche (ROS) e il fattore di necrosi tumorale (TNF-) per uccidere le cellule bersaglio. La produzione di ROS e TNF- (Fig. 2e, f) da diversi neutrofili coincideva bene con la loro maggiore citolisi. Come previsto, la produzione di ROS e TNF- da diversi neutrofili dopo la cocoltura con cellule gliali SVG p12 normali è rimasta bassa quanto il gruppo di controllo negativo (Figura 3a, b supplementare). Inoltre, una maggiore citotossicità antitumorale dei neutrofili CAR è stata osservata solo in co-incubazione con cellule GBM, tra cui U87MG, GBM43 adulto primario e cellule SJ-GBM2 pediatriche (Figura 3c supplementare), dimostrando l'elevata specificità del nostro CLTX -AUTO. In particolare, i neutrofili CAR hanno mostrato un'elevata biocompatibilità con le normali cellule gliali SVG p12, hPSC e cellule derivate da hPSC (Figura 3d supplementare), in linea con una precedente osservazione secondo cui i neutrofili primari inattivati ​​non uccidono le cellule sane16. Collettivamente, i neutrofili CAR derivati ​​da hPSC, in particolare i neutrofili CAR portatori di CD3ζ, hanno presentato una maggiore citotossicità antitumorale e hanno prodotto più ROS e TNF-in vitro, evidenziando il loro potenziale nell'immunoterapia mirata.

Figura 1|Schema di una maggiore efficacia anti-glioblastoma utilizzando l'immunoterapia combinatoria di neutrofili CAR e nano-farmaci reattivi al microambiente tumorale. Le cellule staminali pluripotenti umane sono state ingegnerizzate con CAR e differenziate in neutrofili CAR caricati con nanoparticelle di silice ruvida (SiO2 NP) contenenti tirapazamina (TPZ) mirata all'ipossia o altri farmaci, come doppia immunochemioterapia. b Le NP CAR-neutrofil@R-SiO2- TPZ somministrate per via sistemica attaccano innanzitutto le cellule tumorali normossiche esterne formando sinapsi immunologiche e uccidono le cellule tumorali tramite fagocitosi. Dopo l'apoptosi, i neutrofili CAR potrebbero quindi rilasciare NP R-SiO2-TPZ, che vengono superate dalle cellule tumorali. Successivamente, i nano-profarmaci rispondono al microambiente ipossico del tumore e uccidono efficacemente le cellule tumorali. TEOS tetraetil ortosilicato, BTES bis[3-(trietossisilil) propil] tetrasolfuro, TPZ tirapazamina, BTZ benzotriazinile.

I neutrofili CAR hanno sostenuto attività antitumorali superiori in microambienti tumorali immunosoppressivi

Simili ai macrofagi, i fenotipi antitumorali N1 e pro-tumorali N2 dei neutrofili associati al tumore sono stati trovati nel microambiente tumorale immunosoppressore17. I neutrofili N2 protumorali svolgono un ruolo fondamentale nell’angiogenesi tumorale, nelle metastasi e nell’immunosoppressione, ma il targeting terapeutico di questo tipo di cellule è stato impegnativo.

Piuttosto che una strategia di deplezione sistemica22, qui abbiamo valutato il potenziale dell’ingegneria CAR nel sostenere il fenotipo antitumorale dei neutrofili. I neutrofili derivati ​​da CAR hPSC e PB sono stati trattati con ipossia (3% O2) e TGF, che contribuiscono all'immunosoppressione del microambiente tumorale37,38, per valutare la loro attività sostenuta di uccisione del tumore. Mentre i neutrofili PB presentavano una citolisi significativamente ridotta contro le cellule GBM in condizioni immunosoppressive, i neutrofili CAR sostenevano elevate attività di uccisione del tumore (Figura 4a supplementare). Osservazioni simili sono state fatte anche nel rilascio di TNF e nella generazione di ROS (Figura 4b, c supplementare) da neutrofili PB o CAR in condizioni immunosoppressive e normali. Per confermare ulteriormente il fenotipo dei neutrofili in condizioni ipossiche e TGF, abbiamo misurato l'espressione di iNOS N1-specifico e arginasi N2- N2-specifica sui neutrofili isolati mediante citometria a flusso (Fig. 4d–f). Rispetto alla normossia, all'ipossia immunosoppressiva e al TGF sono stati significativamente ridotti i livelli di espressione di iNOS e aumentati i livelli di arginasi nei neutrofili PB, mentre i neutrofili CAR hanno mantenuto elevati livelli di espressione di iNOS. Studi precedenti indicano che l'attivazione della via di segnalazione Syk-Erk porta alla produzione di ROS39–42. Pertanto, abbiamo rilevato e confrontato l'attivazione di Syk-Erk nei neutrofili non modificati e nei neutrofili CAR, e i nostri risultati hanno suggerito un'attivazione significativamente più elevata della via Syk-Erk nei neutrofili CAR sotto ipossia (Figura 5a-d supplementare), che può sostenere la produzione invariata di ROS dei neutrofili CAR in ipossia. Nel loro insieme, i neutrofili CAR hanno sostenuto un fenotipo antitumorale e hanno mantenuto elevate attività antitumorali in condizioni che imitano il microambiente tumorale in vitro, evidenziando il loro potenziale nell’immunoterapia mirata.

Figura 2|Screening delle strutture del recettore dell'antigene chimerico (CAR) specifico dei neutrofili con attività antitumorali potenziate mediate dai neutrofili. uno schema di varie strutture CAR. b Schema del costrutto CAR n. 1 e strategia knock-in mirata nel locus Safe Harbor AAVS1 delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). La freccia verticale indica l'AAVS1 che prende di mira lo sgRNA. Le frecce orizzontali rosse e blu indicano i primer per analizzare rispettivamente l'efficienza del targeting e l'omozigosi. HDR: riparazione per ricombinazione omologa. c Schema della differenziazione ottimizzata dei neutrofili dalle hPSC in condizioni chimicamente definite. d I test di citotossicità contro le cellule di glioblastoma U87MG sono stati eseguiti con diversi rapporti tra neutrofili e bersaglio tumorale utilizzando i neutrofili indicati. I dati sono rappresentati come media ± DS di cinque repliche biologiche indipendenti, test t di Student a due code. Sono state determinate la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) (e) e l'analisi ELISA del rilascio di TNF (f) da diversi neutrofili dopo la cocoltura con cellule U87MG. n=5 campioni biologicamente indipendenti. I dati sono rappresentati come media ± SD, test t di Student a due code. I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.

Preparazione e caratterizzazione di neutrofili CAR hPSC caricati con nanoparticelle di SiO2 contenenti tirapazamina (TPZ)

I neutrofili PB sono stati utilizzati come trasportatori cellulari per somministrare farmaci per immagini e terapeutici nei tumori cerebrali8-10, sebbene l'infiltrazione mirata di neutrofili richieda un'infiammazione indotta da un intervento chirurgico o dalla luce e la somministrazione di farmaci fuori bersaglio possa rappresentare una preoccupazione11. Per migliorare ulteriormente le attività antitumorali dei neutrofili CAR, abbiamo preparato nanoparticelle di silice (SiO2-NP) con una superficie ruvida o liscia per caricare farmaci chemioterapici o radioattivi nei neutrofili. Le immagini al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) hanno dimostrato che entrambe le nanoparticelle SiO2 erano ben disperse e mostravano una morfologia sferica con una dimensione uniforme (Fig. 3a, Fig. 6a supplementare). L'analisi della distribuzione della composizione tramite scansione TEM (STEM) con spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDS) ha mostrato che l'elemento zolfo (S) era distribuito uniformemente all'interno delle intere nanoparticelle ruvide di SiO2 (R-SiO2) (Fig. 3b). Utilizzando le isoterme di adsorbimento-desorbimento di azoto (N2) e la corrispondente analisi della distribuzione delle dimensioni dei pori, le dimensioni dei pori delle NP R- e SSiO2 sono state misurate rispettivamente come 25 nm e 35 nm (Fig. 3c, Fig. 6b supplementare). Data l'elevata area superficiale e le grandi dimensioni dei pori, i farmaci terapeutici potrebbero essere caricati efficacemente in entrambe le NP R- e S-SiO2, come esemplificato dalla tirapazamina pro-farmaco sensibile all'ipossia (TPZ) (Fig. 3d, Fig. 6c supplementare) . Dopo il caricamento di TPZ, non sono stati osservati cambiamenti significativi nella dispersione, nella morfologia e nelle dimensioni di R-SiO2-TPZ utilizzando TEM e analisi dinamica della diffusione della luce (Figura 6d, e supplementare). I legami tetra-solfuro incorporati nelle NP R-SiO2 sono sensibili agli ambienti riduttivi e possono essere rapidamente degradati dalla grande quantità di glutatione (GSH) presente all'interno delle cellule tumorali43. Successivamente abbiamo determinato la degradabilità reattiva al GSH delle NP R-SiO2-TPZ in presenza di GSH 10 mM, 1 mM e 10 μM, che erano le stesse delle condizioni intracellulari delle cellule tumorali, delle cellule normali e degli ambienti extracellulari43, rispettivamente. Dopo il trattamento con GSH da 10 mM, la struttura sferica iniziale delle NP R-SiO2 –TPZ è stata gravemente distrutta dopo 24 ore (Figura 6f, g supplementare). Le nanoparticelle sono state completamente disintegrate in piccoli detriti dopo 48 ore, determinando il rilascio di TPZ in modo sensibile al GSH (Fig. 3e). I detriti delle NP R-SiO2 non hanno causato alcuna citotossicità significativa alle cellule testate in vitro (Figura 6h supplementare), indicando la relativa sicurezza delle NP R-SiO2.

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Successivamente abbiamo valutato la fattibilità dell'utilizzo di NP SiO2-TPZ per caricare farmaci terapeutici nei neutrofili CAR come chemioimmunoterapia combinatoria per ottenere una maggiore efficacia terapeutica. Dopo la centrifugazione, abbiamo misurato l'assorbimento cellulare di NP SiO2 – TPZ da parte dei neutrofili utilizzando un microscopio a fluorescenza e un'analisi di citometria a flusso (Fig. 3f, g) e rilevato un assorbimento cellulare più significativo di NP R-SiO2 –TPZ rispetto a S-SiO2– NP TPZ da parte dei neutrofili. Il contenuto di Si cellulare nei neutrofili è stato misurato come 11,3 e 19,1 ng Si/ug di proteina per SiO2 NP lisce e ruvide @TPZ (Fig. 3h), rispettivamente, mediante spettrometria di massa al plasma accoppiato induttivamente (ICP-MS). Data la loro elevata capacità di carico nei neutrofili, le NP R-SiO2-TPZ sono state impiegate per esperimenti successivi. Abbiamo quindi cercato di testare le funzioni fisiologiche dei neutrofili CAR dopo aver caricato le NP R-SiO2 –TPZ. Non sono stati osservati cambiamenti nella vitalità cellulare (Fig. 3i, Fig. 6i supplementare), capacità di migrazione dei transwell (Fig. 3j), chemiotassi e velocità corrispondente (Fig. 3k, l) dei neutrofili CAR prima o dopo il caricamento di R-SiO2 –NPZ TPZ, dimostrando la loro elevata biocompatibilità. È stata eseguita anche l'analisi del caricamento di nanofarmaci dipendente dal tempo e il contenuto di caricamento massimo è stato raggiunto a 1 ora dopo l'incubazione delle cellule NP (Figura 7a supplementare). Oltre il 95% dei neutrofili CAR è stato caricato con successo con NP R-SiO2 –TPZ (Figura 7b supplementare). Il livello di espressione di CD11b, una proteina di superficie dei neutrofili che media la funzione di adesione e migrazione in seguito alla stimolazione delle molecole infiammatorie, non è stato modificato sui neutrofili CAR con o senza carico R-SiO2-TPZ (Figura 7c, d supplementare). Il superossido o le specie reattive dell'ossigeno (ROS) vengono rilasciate dai neutrofili attivi per uccidere i microbi e le cellule tumorali44. Come previsto, la generazione di ROS da parte dei neutrofili CAR è stata significativamente aumentata dopo il trattamento con N-formilmetionina-leucil-fenilalanina (fMLP) e non sono state osservate differenze significative nella produzione di ROS da parte dei neutrofili CAR prima e dopo il caricamento di R-SiO2- TPZ (Fig. 3m). Nel loro insieme, i nostri dati hanno dimostrato che i neutrofili CAR caricati con R-SiO2-TPZ mantenevano le attività fisiologiche dei neutrofili wild-type e potevano migrare attivamente verso stimoli infiammatori, evidenziando il loro potenziale nella chemioimmunoterapia mirata contro il cancro.

I neutrofili CAR caricati con nanoparticelle R-SiO2-TPZ uccidono efficacemente le cellule di glioblastoma

Successivamente abbiamo valutato l'effetto di R-SiO2-TPZ sulla capacità di uccidere il tumore dei neutrofili CAR. L'interazione intima effettore-bersaglio era un prerequisito per la citolisi mediata dai neutrofili. Come previsto, i neutrofili CAR@R-SiO2-TPZ hanno formato sinapsi immunitarie con cellule tumorali entro 2 ore e hanno mostrato numeri di interazione effettore-bersaglio simili a quelli dei neutrofili CAR privi di farmaci (Fig. 4a, Figura 8 supplementare) . In particolare, non sono state trovate interazioni osservabili tra CAR-neutrofili@RSiO2-TPZ e cellule somatiche non cancerose (Figura 8 supplementare), evidenziando la specificità di CLTX-CAR contro i tumori cerebrali. Inoltre, le NP R-SiO2-TPZ sono state rilasciate dai neutrofili nel mezzo di coltura (Figura 9a, b supplementare) 12 ore dopo la co-coltura e sono entrate nelle cellule tumorali rimanenti (Figura 4a). Ventiquattro ore dopo la co-incubazione di neutrofili CAR caricati con NP SiO2-TPZ con cellule tumorali, fino al 95% delle cellule tumorali conteneva NP R-SiO2-TPZ (Fig. 4a, Fig. 9c supplementare), indicando un successo cascata di trasporto che coinvolge neutrofili trasportatori che esercitano la loro funzione di cellula effettrice e vanno incontro ad apoptosi, rilasciando così passivamente NP R-SiO2-TPZ alle cellule tumorali bersaglio45. Abbiamo anche convalidato la funzione di risposta ipossica e la citotossicità del pro-farmaco TPZ all'interno delle cellule tumorali mediante analisi spettroscopica di risonanza paramagnetica elettronica (EPR) della generazione di radicali da TPZ (Figura 9d supplementare) e analisi di citometria a flusso di TOPRO-3 sul tumore cellule (Figura 9e supplementare) sotto ipossia e normossia. Per determinare la citolisi dei neutrofili CAR caricati con NP R-SiO2 –TPZ, abbiamo implementato un modello di stimolazione del tumore normossia-ipossia in vitro (Fig. 4b). Ventiquattro ore dopo la cocultura normossica, i neutrofili CAR caricati con NP R-SiO2-TPZ o non mostravano una citotossicità antitumorale simile (Fig. 4c), ed entrambi erano superiori a quelli dei neutrofili PB caricati con R -SiO2-TPZ NP o no e R-SiO2- TPZ NP da sole. La maggiore citotossicità è dovuta principalmente alla maggiore capacità dei neutrofili di colpire il tumore dopo l’ingegneria CAR. Dopo un'ulteriore cocoltura ipossica di 12 e 24- ore con cellule tumorali, i neutrofili CAR caricati con NP R-SiO2-TPZ hanno mostrato una capacità antitumorale superiore rispetto ad altri gruppi (Fig. 4d, e). Inoltre, i neutrofili CAR caricati con NP R-SiO2-TPZ hanno mostrato un'eccellente citolisi contro le cellule tumorali fresche riseminate (Fig. 4f), indicando la capacità antitumorale dell'R-SiO2-TPZ rilasciato nanoparticelle dopo l'apoptosi dei neutrofili.

Abbiamo quindi eseguito l'analisi di sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) sulle cellule tumorali per chiarire il potenziale meccanismo molecolare alla base della citolisi antitumorale potenziata dei neutrofili mediante espressione di CAR e NP R-SiO2-TPZ. L'analisi dell'espressione genica ha dimostrato che, rispetto al controllo e alle NP R-SiO2-TPZ, i neutrofili CAR caricati con o senza NP R-SiO2-TPZ hanno ridotto significativamente l'espressione dei geni del citoplasma e della membrana nelle cellule tumorali ( Figura 10a supplementare, Figura 4g), supportando ulteriormente la loro fagocitosi delle cellule tumorali dopo la cocoltura. Mentre tutti i gruppi sperimentali hanno aumentato lo stress ossidativo cellulare nelle cellule tumorali, i neutrofili CAR caricati con R-SiO2-TPZ hanno sovraperformato gli altri gruppi nell'attivare la segnalazione dello stress ossidativo. Inoltre, i neutrofili CAR caricati con R-SiO2-TPZ hanno promosso significativamente l'apoptosi e ridotto la proliferazione nelle cellule tumorali. Per comprendere ulteriormente le attività antitumorali potenziate dei neutrofili CAR caricati con R-SiO2-TPZ, abbiamo applicato un inibitore della fagocitosi citocalasina D e uno scavenger di specie reattive dell'ossigeno (ROS) N-acetil-cisteina (NAC) e un inibitore dei ROS GSK2795039 alla cocultura tumore-neutrofili. La citolisi delle cellule tumorali da parte dei neutrofili CAR è stata significativamente ridotta da 5 μM di citocalasina D, 5 mM di NAC e 100 nM di GSK2795039 (Figura 10b, c supplementare), indicando il ruolo prominente della fagocitosi e dei ROS nelle cellule tumorali mediate dai neutrofili CAR uccidendo. Il restante 40%-50% della lisi delle cellule tumorali in presenza di neutrofili e NAC o GSK2795039 indica il coinvolgimento del meccanismo indipendente dai ROS nell'uccisione del tumore mediata dai neutrofili che merita ulteriori indagini.

Figura 3|Preparazione e caratterizzazione di neutrofili CAR hPSC caricati con nanoparticelle di SiO2 contenenti tirapazamina (TPZ). a–e Vengono mostrate le immagini di mappatura elementare del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) (a) e della spettroscopia a dispersione di energia (EDS) (b) di nanoparticelle grezze di SiO2. c Viene mostrata l'isoterma di adsorbimento-desorbimento di azoto di nanoparticelle grezze di SiO2 insieme al grafico di distribuzione delle dimensioni dei pori di Barrett-JoynerHalenda (BJH). I triplicati biologici sono stati eseguiti in modo indipendente. Il contenuto di caricamento TPZ nelle nanoparticelle di SiO2 (d) e il rilascio di TPZ reattivo al glutatione (GSH)--(e) sono stati misurati al momento indicato. n=3 campioni biologicamente indipendenti. Analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) per (e). Immagini di fluorescenza (f) e analisi di citometria a flusso (g) di neutrofili caricati con SiO2-TPZ liscio e ruvido. I triplicati biologici sono stati eseguiti in modo indipendente. h È stato misurato il contenuto di SiO2 cellulare nei neutrofili CAR derivati ​​da hPSC. n=5 campioni biologicamente indipendenti, test t di Student a due code. Vitalità cellulare (i), n=3 campioni biologicamente indipendenti, trasmigrazione (j), n=5 campioni biologicamente indipendenti, capacità di chemioattrazione (k, l), n=20 campioni biologicamente indipendenti e È stata mostrata la capacità di generazione di ROS (m) dei neutrofili CAR derivati ​​da hPSC caricati con o senza SiO2-TPZ grezzo, n=5 campioni biologicamente indipendenti, test t di Student a due code. PMA: forbolo miristato acetato. Tutti i dati in questa figura sono rappresentati come media ± DS. I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.

Valutazione funzionale di neutrofili CAR caricati con nano farmaci utilizzando modelli di glioblastoma biomimetico in vitro

Per valutare ulteriormente le attività dei neutrofili CAR caricati con R-SiO2-TPZ NP, abbiamo implementato un modello di tumore della barriera emato-encefalica (BBB) ​​basato su transwell utilizzando cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (Fig. 5a, Figura supplementare .11a). Come previsto, i neutrofili CAR caricati con R-SiO2-TPZ NP hanno mostrato un'eccellente capacità di trasmigrazione attraverso il modello BBB in vitro (Fig. 5b), uccidendo efficacemente le cellule tumorali mirate dopo la trasmigrazione sia in condizioni normossiche che ipossiche (Fig. 5c , d) e rilasciando più citochine infiammatorie (Fig. 5e) che possono attrarre altre cellule effettrici per uccidere le cellule tumorali. Inoltre, i neutrofili CAR non hanno influenzato in modo significativo la vitalità delle cellule endoteliali dopo la trasmigrazione (Figura 11b supplementare). I neutrofili CAR caricati con R-SiO2-TPZ NP hanno mantenuto un'eccellente capacità di trasmigrazione durante il secondo esperimento di trasmigrazione (Fig. 5f) e una capacità antitumorale superiore rispetto ad altri gruppi (Fig. 5g). Un modello sferoidale tumorale tridimensionale (3D) è stato quindi utilizzato per valutare la capacità di penetrazione del tumore dei neutrofili CAR caricati con R-SiO2-TPZ NP (Fig. 5h). I neutrofili CAR migrarono gradualmente verso il centro dello sferoide tumorale e si distribuirono uniformemente nello sferoide dopo 8 ore di incubazione (Fig. 5i). È stato osservato un alto grado di co-localizzazione tra neutrofili CAR e NP R-SiO2-TPZ (Figura 12a-c supplementare), dimostrando che le NP R-SiO2-TPZ erano incapsulate stabilmente nel CAR -neutrofili durante l'infiltrazione del tumore prima della loro citolisi. Senza il rilascio mediato dai neutrofili, le NP R-SiO2-TPZ sono state trovate solo sullo strato esterno degli sferoidi tumorali. Rispetto alle NP R-SiO2-TPZ e ai neutrofili CAR, i neutrofili CAR caricati con NP R-SiO2-TPZ hanno mostrato una citolisi antitumorale superiore nel modello tumorale 3D (Fig. 5j). Le NP CAR-neutrofili@R-SiO2 possono anche essere impiegate per fornire altri farmaci, tra cui temozolomide clinico (TMZ) e JNJ- 64619187, in modelli tumorali 3D e uccidere in modo efficiente le cellule GBM (Figura 12d-f supplementare). Nel loro insieme, i neutrofili CAR combinatori e i nanofarmaci hanno mostrato eccellenti attività antitumorali nel microambiente tumorale biomimetico imitando le condizioni in vitro, evidenziando il potenziale terapeutico della chemioimmunoterapia combinatoria basata sui neutrofili.

Cistanche tubulosa: migliora il sistema immunitario

Distribuzione in vivo di nanoparticelle R-SiO2-TPZ rilasciate dai neutrofili CAR

In addition to improving the direct tumor-killing ability, we hypothesize that CAR engineering of hPSC-neutrophils will significantly enhance their targeted delivery of therapeutic drugs without additional surgery- or light-induced inflammation11. To test this hypothesis, we employed a mouse xenograft model of glioblastoma and an in vivo imaging system to determine the trafficking and biodistribution of R-SiO2-TPZ NP-loaded CAR-neutrophils. We fluorescently labeled SiO2 NPs with a near-infrared dye Cyanine 5 (Cy5) and then performed fluorescence imaging 3 h and 24 h after systemic administration (Fig. 6a). Three hours after intravenous injection, R-SiO2-TPZ NPs traveled to the whole body of tumor-bearing mice and emitted strong fluorescence with or without neutrophil-mediated delivery (Fig. 6b). CAR-neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs accumulated in the brain tumor site within 24 h, whereas free R-SiO2-TPZ NPs were still evenly distributed across the whole body (Fig. 6b). To further quantify the biodistribution of R-SiO2-TPZ NPs in various organs, inductively coupled plasma-optical emission spectrometry (ICP-OES) analysis of Si content was performed on the harvested organs 24 h post-injection. CAR neutrophil-delivered R-SiO2-TPZ NPs were significantly enriched in the mouse brain (Fig. 6c), although a low-level delivery to the liver and spleen was observed. Si content measurement also demonstrated that >Il 20% dei nanofarmaci somministrati sono stati somministrati ai tumori cerebrali dai neutrofili CAR rispetto all'1% dai nanofarmaci liberi, il che è coerente con i rapporti precedenti6. Il rilascio mirato di NP R-SiO2-TPZ al cervello ospite attraverso BBB da parte dei neutrofili CAR è stato confermato anche dall'analisi istologica (Fig. 6d). Al contrario, le NP R-SiO2-TPZ da sole si accumulavano principalmente nel fegato e nella milza. Collettivamente, i nostri dati hanno dimostrato un rilascio mirato potenziato di NP R-SiO2-TPZ da parte dei neutrofili CAR senza la necessità di indurre ulteriore infiammazione nel sito del tumore, evidenziando la fattibilità e la sicurezza della chemioimmunoterapia basata sui neutrofili nel trattamento del cancro.

La chemioimmunoterapia combinata di neutrofili CAR e nanoparticelle R-SiO2-TPZ ha mostrato eccellenti attività anti glioblastoma in vivo

Per determinare l'efficacia terapeutica dei neutrofili CAR caricati con R-SiO2-TPZ NP, è stato creato un modello di xenotrapianto in situ di glioblastoma nei topi NOD.Cg-RAG1tm1MomIL2rgtm1Wjl/SzJ (NRG) utilizzando cellule U87MG che esprimono luciferasi. Ai topi portatori di tumore sono stati somministrati per via endovenosa 5 × 106 neutrofili settimanalmente (Fig. 7a) e il carico tumorale negli ospiti è stato misurato e quantificato (Fig. 7b, c). Rispetto ai topi trattati con PBS o PB-neutrofili, il trattamento con neutrofili CAR e NP CAR neutrophil@R-SiO2-TPZ ha rallentato efficacemente la crescita del tumore. Le NP CAR @R-SiO2–TPZ hanno mostrato una citotossicità antitumorale molto più elevata rispetto a qualsiasi altro gruppo sperimentale. Al contrario, i neutrofili PB hanno promosso in modo significativo la crescita del tumore nel cervello, provocando la morte di topi portatori di tumore già al giorno 23 (Fig. 7d), suggerendo che i neutrofili non ingegnerizzati possono comportare rischi aggiuntivi. Successivamente abbiamo misurato il rilascio di citochine umane nel plasma di diversi gruppi di topi sperimentali (Fig. 7e). Tutti i gruppi sperimentali non PBS hanno prodotto TNF e IL-6 rilevabili nel plasma dal giorno 5 al giorno 26, suggerendo l'attivazione dei neutrofili umani in seguito alla stimolazione del tumore. Coerentemente con il tasso di crescita tumorale più elevato osservato, i neutrofili non modificati rilasciano gradualmente più IL-6 e TNF, il che può portare alla sindrome da rilascio di citochine nei pazienti e richiedere studi più approfonditi sulla sicurezza con i bloccanti dell'IL-646,47 . In particolare, le NP CAR-neutrofili@RSiO2-TPZ hanno mostrato una ridotta capacità di produzione di citochine in momenti successivi (giorno 19 e giorno 26), suggerendo un rischio potenzialmente basso di sindrome da rilascio di citochine nei pazienti trattati con chemioimmunoterapia basata su CAR-neutrofili. La biocompatibilità dei neutrofili CAR combinatori e delle NP R-SiO2-TPZ è stata valutata attraverso la misurazione settimanale del peso corporeo e il monitoraggio dei cambiamenti patologici nei principali organi dei topi. Non è stata osservata alcuna differenza nel peso corporeo tra i topi trattati con CAR neutrophils@R-SiO2–TPZ NP e qualsiasi altro gruppo sperimentale (Fig. 7f), indicando una tossicità sistemica minima e un'eccellente biocompatibilità delle CAR-neutrofils@R-SiO2–TPZ NP all'interno 28 giorni di trattamento. L'analisi istologica sugli organi principali tagliati dai topi il giorno 30 ha mostrato che i topi trattati con CAR-neutrofili@R-SiO2-TPZ NP non causavano anomalie evidenti o danni agli organi nel cuore, nel fegato, nella milza, nei polmoni e nei reni (Fig. 13), confermando ulteriormente la sicurezza dei neutrofili CAR combinatori e delle NP R-SiO2-TPZ.

Figura 4|I neutrofili CAR caricati con nanoparticelle R-SiO2-TPZ uccidono efficacemente le cellule di glioblastoma. Sono state mostrate immagini rappresentative delle sinapsi immunologiche indicate dall'accumulo polarizzato di F-actina all'interfaccia tra neutrofili CAR e cellule tumorali a 6, 12 e 24 ore. Le nanoparticelle R-SiO2-TPZ rilasciate dai neutrofili CAR durante la fagocitosi delle cellule tumorali sono state assorbite dalle cellule tumorali. I triplicati sono stati eseguiti in modo indipendente. b Schema del test di citotossicità antitumorale mediata dai neutrofili. La citotossicità contro le cellule di glioblastoma U87MG è stata eseguita con diversi rapporti tra target neutrofili e tumore utilizzando i neutrofili indicati a 24 ore (c), 36 ore (d), 48 ore (e) e 72 ore (f). n=3 campioni biologicamente indipendenti. I dati sono rappresentati come media ± DS, analisi della varianza unidirezionale (ANOVA). g L'analisi di sequenziamento dell'RNA in massa è stata eseguita su cellule U87MG in varie condizioni. La mappa termica mostra i livelli di espressione di citoplasma, membrana, stress ossidativo, apoptosi e geni correlati alla proliferazione selezionati nelle cellule di glioblastoma indicate. n=2 campioni biologicamente indipendenti. I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.

Figura 5|Valutazione funzionale di neutrofili CAR caricati con nanoparticelle R-SiO2-TPZ utilizzando modelli di glioblastoma biomimetico (GBM) in vitro. uno schema del nostro modello tumorale in vitro di GBM con barriera emato-encefalica (BBB), composto da cellule endoteliali sulla membrana dell'inserto cellulare e cellule tumorali sul fondo dello stesso transwell. b Viene mostrata l'analisi della migrazione transwell dei neutrofili a 12 ore. La citotossicità anti-GBM dei neutrofili indicati a 24 ore (c) e 36 ore (d) è stata misurata e quantificata. e È stata eseguita l'analisi ELISA di IL-6 e TNF rilasciati dai neutrofili indicati a 36 ore. f Viene mostrata la seconda migrazione di diversi neutrofili a 48 ore. g La citotossicità anti-GBM dei neutrofili indicati a 60 ore è stata misurata e quantificata. h-j Lo schema del modello di tumore tridimensionale (3D) infiltrato da neutrofili in vitro è stato mostrato in (h). Sono state mostrate immagini fluorescenti rappresentative dei neutrofili infiltrati nei modelli tumorali 3D. DAPI è stato utilizzato per colorare il nucleo cellulare e CD45 è stato utilizzato per colorare i neutrofili. Barre di scala, 200 μm. I triplicati biologici sono stati eseguiti in modo indipendente. j La corrispondente capacità di uccidere il tumore dei neutrofili indicati è stata misurata e quantificata utilizzando un kit di citotossicità. I dati sono rappresentati come media ± DS di cinque repliche biologiche indipendenti, analisi della varianza a una via (ANOVA). I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.

Mentre le NP CAR-neutrofili@R-SiO2–TPZ hanno rallentato significativamente la crescita del tumore nei topi xenotrapiantati, la differenza nella sopravvivenza degli animali nei gruppi sperimentali di neutrofili CAR, NP SiO2–TPZ e NP CAR-neutrofili@R-SiO2–TPZ è insignificante (p > 0.05), probabilmente dovuto alla morte dei neutrofili di breve durata durante la preparazione e l'iniezione delle cellule. Successivamente ci siamo concentrati su questi tre gruppi e abbiamo determinato se la riduzione del tempo di preparazione delle cellule e l'aumento dei dosaggi di neutrofili CAR e nano farmaci avrebbero fatto qualche differenza nella sopravvivenza degli animali (Fig. 7g). Quando somministrati sistemicamente 6 volte, le NP CAR-neutrofili@R-SiO2-TPZ hanno sovraperformato gli altri due gruppi nell'estendere la durata della vita dei topi portatori di tumore (Fig. 7h), mentre la differenza di sopravvivenza degli animali nei gruppi di neutrofili CAR e SiO2-NP Le NP di TPZ sono rimaste insignificanti. Sebbene tra questi due studi indipendenti sugli animali sia stata osservata una curva di sopravvivenza simile del gruppo R-SiO2- TPZ, il tempo di isolamento delle cellule e di preparazione per l'iniezione è stato ridotto da un totale di circa 4 ore a 1 ora durante i primi 4 cicli di neutrofili le dosi hanno portato a un miglioramento della sopravvivenza degli animali nei gruppi CAR-neutrofili prima del giorno 32. Collettivamente, i nostri dati hanno dimostrato l’importanza della preparazione dei neutrofili e dell’ottimizzazione del dosaggio nelle future applicazioni cliniche delle terapie neutrofile.

Discussione

È stato dimostrato che i neutrofili di topo sono un potente trasportatore per somministrare in modo efficiente nanofarmaci ai tumori cerebrali postoperatori infiammati8,9. Tuttavia, la fattibilità e la sicurezza dell’utilizzo dei neutrofili umani nella somministrazione dei farmaci rimangono sfuggenti. La grande quantità di neutrofili di topo (10 volte superiore al numero totale di neutrofili circolanti nei topi11) utilizzata in questi studi per ottenere benefici terapeutici può ostacolare ulteriormente la loro traduzione clinica poiché l’estrazione di un gran numero di neutrofili da pazienti affetti da cancro può portare a neutropenia e porre altri rischi. Per affrontare queste sfide, abbiamo sfruttato il potere delle hPSC autorinnovanti per ottenere un numero illimitato di neutrofili umani de novo29. Abbiamo sviluppato un potente sistema di somministrazione di farmaci mediato da neutrofili bioispirato con l'ingegneria CAR29 e abbiamo utilizzato neutrofili CAR umani ingegnerizzati come nanocarrier con straordinarie attività antitumorali. Le NP SiO2 ruvide funzionano meglio delle NP SiO2 lisce nei portatori di neutrofili CAR, in linea con le osservazioni precedenti secondo cui i neutrofili fagocitano preferenzialmente i patogeni microbici ruvidi30. È stato segnalato che i neutrofili promuovono la proliferazione e la progressione delle cellule di glioma48. Abbiamo osservato un effetto protumorale simile dei neutrofili non modificati nel nostro studio sugli animali, evidenziando la necessità dell’ingegneria CCAR o di altre modifiche nei neutrofili per garantirne la sicurezza nella somministrazione di farmaci e in altre applicazioni terapeutiche. In particolare, la nostra somministrazione di farmaci mediata dai neutrofili CAR dipende esclusivamente dalla capacità chemio-attrattiva nativa del GBM, ma non dai segnali infiammatori post-chirurgici amplificati, suggerendo l'elevata specificità e il potenziale terapeutico del nostro sistema di somministrazione di farmaci nell'eradicazione dei gliomi profondamente infiltrati che non può essere rimosso chirurgicamente. Poiché la resezione chirurgica e la chemioterapia/radioterapia adiuvante sono gli interventi clinici primari per GBM12, il trattamento combinato con nanocarrier di neutrofili CAR e chirurgia/radioterapia può raggiungere un'efficacia terapeutica ottimale e merita ulteriori indagini. I costrutti CAR specifici delle cellule T e NK sono stati ampiamente utilizzati per migliorare le attività antitumorali delle cellule T e NK, ma non sono stati descritti CAR specifici dei neutrofili che migliorano le funzioni antitumorali dei neutrofili. In precedenza è stato segnalato che i recettori immunitari chimerici CD4ζ e CD4 migliorano la citolisi dei neutrofili contro le cellule trasfettate con HIVenv in vitro. Tuttavia, l'efficienza della lisi era solo del 10% circa con un rapporto effettore-bersaglio (E: T) di 10:128. Fc RIIA (CD32a) è un recettore transmembrana a catena singola a bassa affinità per IgG monomeriche che è altamente espresso nei neutrofili (da 30,000 a 60,000 molecole/cellula31) e la sua legatura induce Fc - funzioni dipendenti nei neutrofili, come il rilascio del contenuto dei granuli, la mobilizzazione del Ca2+, la citotossicità antitumorale e la fagocitosi49. Dato il ruolo prominente del CD32a nell'attivazione e nella funzione dei neutrofili, abbiamo progettato e testato costrutti CAR basati su CD32a. Tuttavia, i nostri risultati hanno dimostrato che CD3ζ media una citolisi significativamente migliore rispetto a CD32a quando espresso in neutrofili derivati ​​da hPSC, il che può essere in parte dovuto alle copie più elevate di ITAM in CD3ζ rispetto a CD32a: tre e una copia, rispettivamente, e livelli di espressione più elevati di ζ che sulla superficie cellulare dei neutrofili28. Come il CD32a, l'Fc RIII (CD16b) è un altro recettore a bassa affinità per le IgG monomeriche ed è espresso a un livello molto più elevato rispetto al CD32a sui neutrofili31. Sebbene la reticolazione del CD16b induca solo la mobilizzazione e la degranulazione del Ca2+, ma non la fagocitosi e la citolisi nei neutrofili28,50, sarà comunque di interesse negli studi futuri eseguire un confronto sistematico sulle capacità di CD3ζ- e CD16b -CAR nell'innescare e potenziare le funzioni antitumorali dei neutrofili.

Figura 6|Distribuzione in vivo di nanoparticelle (NP) R-SiO2-TPZ rilasciate dai neutrofili CAR. uno schema di NP CAR neutrophil@R-SiO2 e NP R-SiO2 marcate con Cy5- somministrate per via endovenosa per lo studio di tracciamento cellulare in vivo. 5 × 105 cellule U87MG che esprimono luciferasi (Luci) sono state impiantate stereotassicamente nel prosencefalo destro dei topi NRG. Dopo 4 giorni, i topi sono stati trattati per via endovenosa con PBS, 5 × 106 NP CAR neutrophil@R-SiO2 marcate con Cy5- e NP R-SiO2. b La biodistribuzione tempo-dipendente dei neutrofili Cy5+ nell'intero corpo, nel cervello e in altri organi è stata determinata e quantificata mediante imaging in fluorescenza alle ore indicate. c La biodistribuzione di CAR neutrophil@R-SiO2 NP e R-SiO2 NP nei topi a 24 ore dopo l'iniezione è stata analizzata mediante spettrometria di emissione ottica al plasma accoppiata induttivamente (ICP-OES) basata sull'elemento Si e i dati sono stati espressi come percentuale di dose iniettata per grammo di tessuto (%ID/g). n=5 campioni biologicamente indipendenti. I dati sono rappresentati come media ± DS. I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine. d Sono state mostrate immagini di fluorescenza rappresentative di CD45 e SiO2 negli xenotrapianti di glioblastoma indicati isolati da topi portatori di tumore. Barre di scala, 100 μm. I triplicati biologici sono stati eseguiti in modo indipendente.

Figura 7|Le attività antitumorali in vivo dei neutrofili CAR combinatori e delle nanoparticelle (NP) R-SiO2-TPZ sono state valutate tramite iniezione endovenosa. uno schema di PBS, neutrofili PB, neutrofili CAR e NP CAR-neutrofili@ R-SiO2-TPZ somministrati per via endovenosa per lo studio in vivo sull'uccisione del tumore. 5 × 105 cellule U87MG che esprimono luciferasi (Luci) sono state impiantate stereotassicamente nel prosencefalo destro dei topi NRG. Dopo 4 giorni, i topi sono stati trattati per via endovenosa con i neutrofili indicati settimanalmente per un mese. Il carico tumorale dipendente dal tempo è stato determinato (b) e quantificato (c) mediante imaging bioluminescente (BLI) nei giorni indicati. I dati sono media ± DS per i topi in (b) (n=5), analisi della varianza a una via (ANOVA). d È stata mostrata la curva di Kaplan-Meier che dimostra la sopravvivenza dei gruppi sperimentali indicati (n=5). Il fattore di necrosi tumorale umano rilasciato (TNF) e IL-6 nel sangue periferico (e) e il peso corporeo (f) di diversi gruppi di topi sono stati misurati nei giorni indicati. I dati sono media ± DS, n=5 campioni biologicamente indipendenti. g, h È stata valutata l'attività antitumorale delle frequenze di dosaggio aumentate di neutrofili CAR e NP RSiO2-TPZ. g Schema di neutrofili CAR, NP R-SiO2-TPZ e NP CAR-neutrofili@ R-SiO2-TPZ somministrati per via endovenosa per lo studio sull'uccisione del tumore in vivo. h È stata mostrata la curva di Kaplan-Meier che dimostra la sopravvivenza dei gruppi sperimentali indicati (n=5). Le curve di Kaplan-Meier sono state analizzate mediante il log-rank test. I dati di origine vengono forniti come file di dati di origine.

Abbiamo anche presentato qui una piattaforma modulare e versatile per la somministrazione di farmaci per neutrofili hPSC che potrebbe essere riprogettata e messa a punto in futuro per supportare altri sforzi basati sui neutrofili per il trattamento di altre malattie umane. Innanzitutto, l’ingegneria CAR è più accessibile nelle hPSC che nelle cellule T immunitarie primarie e nei neutrofili. È necessario un solo editing genomico una tantum per ottenere un’espressione stabile e omogenea di vari CAR29. Oltre ai CAR CLTX, abbiamo anche costruito linee hPSC stabili che esprimono un CAR-anti-fluoresceina (FITC)51 universale o un CAR52 anti-PD-L1, entrambi i quali potrebbero essere sfruttati per ottenere nanocarrier CAR-neutrofili solidi universali mirati al tumore. Altre modifiche genetiche, come la fibrosi mirata ai CAR anti-FAP53, possono essere eseguite anche per indirizzare i nanovettori di neutrofili al trattamento di malattie degenerative fatali, inclusi traumi cerebrali e fibrosi cardiaca. Inoltre, le hPSC che esprimono CAR potrebbero anche essere facilmente adattate per produrre cellule CAR-T o CAR-NK29 e le combinazioni di queste immunoterapie con nanovettori CAR-neutrofili possono ottenere benefici terapeutici antitumorali ottimali. Infine, il nostro sistema di nanofarmaci bioispirati sensibili al glutatione tumorale (GSH) è una piattaforma modulare e versatile per caricare farmaci chemioterapici o radioattivi promettenti nei neutrofili CAR per la somministrazione mirata di farmaci, come esemplificato dalla clinica TMZ, JNJ64619187 e dal pro-farmaco TPZ. Studi futuri sulla sperimentazione di altre nanoparticelle potrebbero produrre un caricamento ottimizzato del farmaco nei neutrofili e ottenere la massima efficacia terapeutica in vivo.

Sebbene abbiamo dimostrato il concetto terapeutico dell'utilizzo dei neutrofili CAR per somministrare in modo specifico ed efficiente farmaci chemioterapici ai tumori cerebrali attraverso la BBB, ci sono alcune limitazioni in questo studio. In primo luogo, l'inoculazione di cellule tumorali in 4-giorni potrebbe non essere sufficiente per stabilire tumori che imitano lo scenario clinico per l'indagine terapeutica, ed è necessario un lavoro futuro con diversi periodi di inoculazione del tumore per ricapitolare le diverse fasi di sviluppo del glioblastoma e la risposta terapeutica in diversi pazienti54,55. In secondo luogo, i topi immunodeficienti che abbiamo utilizzato qui mancano di immunità adattativa e sono necessari altri modelli preclinici con un sistema immunitario intatto, come i cani da compagnia con glioma spontaneo56, per valutare meglio la sicurezza e l’efficacia dei neutrofili CAR prodotti in vitro. In particolare, è necessaria la profilazione della tossicità fuori bersaglio dei neutrofili CAR con o senza caricamento di nanofarmaci negli animali infusi, inclusa la sindrome da rilascio di citochine, la neurotossicità e le tossicità fuori bersaglio fuori tumore osservate nelle cellule CAR-T57, nonostante la breve durata di vita. dei neutrofili. Sebbene siano facilmente disponibili approcci fattibili, come la progettazione di hPSC da donatori universali ipoimmunogenici58-61 e la conservazione di librerie di hPSC omozigoti di antigene leucocitario umano (HLA)62, per evitare il potenziale rischio di malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD), modelli animali preclinici con un Sono ancora necessari sistemi immunitari intatti per valutare il potenziale traslazionale delle nostre terapie per neutrofili. Infine, sono state osservate una citotossicità antitumorale limitata e un'estensione della durata di vita degli animali delle terapie nanofarmacologiche CAR-neutrofili. Pertanto, la futura esplorazione di farmaci chemioterapici o radiosensibilizzatori più efficaci e di terapie combinatorie con CAR-T classico e resezione chirurgica è essenziale per ottenere la massima efficacia antitumorale delle terapie CAR-neutrofili. Ad esempio, un recente studio sulla progettazione basata su meccanismi ha portato a un farmaco più efficace KL-50 che supera la resistenza acquisita come osservato nel farmaco clinico TMZ63 e può quindi essere incorporato nella nostra piattaforma modulare di nanofarmaci CAR-neutrofili per un potenziale migliore efficacia terapeutica. È anche possibile estendere la durata di conservazione dei neutrofili a 5 giorni tramite il trattamento con CLON-G (caspasi-permeabilizzazione della membrana lisosomiale-inibizione dell'ossidante-necroptosi più fattore stimolante le colonie di granulociti64) e/o utilizzando un sistema di rilascio controllato del farmaco a lungo termine nei neutrofili CAR. ottenere un’efficacia antitumorale sostenuta in vivo dopo l’apoptosi dei neutrofili. Collettivamente, i nostri risultati hanno chiaramente dimostrato che i neutrofili CAR caricati con R-SiO2-TPZ potrebbero sostenere il fenotipo antitumorale N1 e uccidere efficacemente le cellule tumorali in varie condizioni simili a quelle di nicchia tumorale in vitro. I neutrofili CAR funzionali potrebbero anche essere prodotti in grandi quantità da hPSC ingegnerizzate per fornire con precisione nanofarmaci sensibili al microambiente tumorale per colpire il GBM in vivo, portando a una chemioimmunoterapia combinatoria con attività anti-GBM robuste e specifiche e somministrazione minima di farmaci fuori bersaglio che durata della vita prolungata nei topi portatori di tumore.

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