Sovraespressione CD73 nei podociti: un nuovo indicatore della lesione dei podociti nella malattia renale umana
Feb 26, 2022
Astratto:La via CD73 è un importante meccanismo antinfiammatorio in vari contesti patologici. Le osservazioni nei modelli murini hanno suggerito che CD73 potrebbe avere un ruolo protettivo indanno ai reni; tuttavia, nessuna prova diretta del suo ruolo nell'uomomalattie renaliè stato descritto fino ad oggi. Qui, abbiamo ipotizzato che la lesione del podocita nell'uomomalattie renalialtera l'espressione di CD73 che può facilitare la diagnosi di podocitopatie. Abbiamo valutato l'espressione di CD73 e uno dei suoi bersagli funzionalmente importanti, il recettore delle chemochine CC di tipo 2 (CCR2), nei podociti direnebiopsie di 39 pazienti con podocitopatia (inclusa glomerulosclerosi focale segmentale (FSGS), malattia a cambiamento minimo (MCD), glomerulonefrite membranosa (MGN) e amiloidosi) e un gruppo di controllo. L'espressione del CD73 dei podociti in ciascuno dei gruppi di malattie è stata significativamente aumentata rispetto ai controlli (p < 0.0{{10}}1–p="">< 0,0001).="" inoltre,="" c'era="" una="" marcata="" correlazione="" negativa="" tra="" l'espressione="" di="" cd73="" e="" ccr2,="" come="" confermato="" dall'immunoistochimica="" e="" dall'immunofluorescenza="" (pearson="" r="-" 0,5068,="" p="0.0031;" pearson="" r="-" 0.4705,="" p="0.0313," rispettivamente),="" suggerendo="" così="" un="" ruolo="" protettivo="" di="" cd73="">danno renale.Infine, identifichiamo CD73 come un nuovo potenziale marcatore diagnostico di podocitopatie umane, in particolare di MCD che è stato noto per la mancanza di caratteristiche patologiche riconoscibili dalla microscopia ottica e dall'immunoistochimica.
Parole chiave:podocita; malattia da cambiamento minimo; CD73; CCR2;danno renale;insufficienza renale
introduzione
Il ruolo evolutivo cruciale dell'adenosina trifosfato (ATP) come fonte di energia intracellulare onnipresente è stato aggiornato più di tre decenni fa con una nozione rivoluzionaria che i membri del sistema purinergico (ATP, adenosina di- e trifosfato (ADP e AMP, rispettivamente) può anche fornire segnali extracellulari per mediare le interazioni cellulari [ 1 , 2 ].Questo concetto ha portato alla comprensione che il sistema purinergico partecipa alla formazione delle risposte immunitarie attraverso la modulazione del profilo di espressione del recettore, la secrezione di citochine, la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e digestione intracellulare di agenti patogeni [3–7].L'ATP extracellulare subisce conversione/defosforilazione in ADP e AMP tramite CD39 (ecto-nucleosidtrifosfato difosfoidrolasi 1) e, infine, l'AMP viene degradato ad adenosina da CD73 (ecto{9}} nucleotidasi) [ 8 ] Il CD73 può essere presente in forma solubile o legata alla membrana La forma a membrana ha una struttura dimero costituita da due subunità identiche da 70 kD che si legano a la membrana plasmatica attraverso un legame tra serina C-terminale e glicosilfosfatidilinositolo (GPI) [ 9 ]. Degno di nota, i substrati CD39 ATP e ADP sembrano essere inibitori competitivi di CD73 [9 – 11]. L'espressione di CD73 rappresenta quindi il percorso critico di regolazione del livello di adenosina nello spazio extracellulare. CD73 non è una molecola specifica per cellula o organo; la sua espressione su leucociti, endotelio, cellule epiteliali o mesenchimali di vari organi (rene, polmone, fegato, colon, cervello e cuore) e cellule staminali è stato ben documentato [ 12 – 14 ]. Peralta et al. [ 15 ]. In accordo con questi dati, è stato dimostrato che la sua azione migliora il danno polmonare acuto, il rigetto delle vie aeree dell'allotrapianto, la malattia acuta del trapianto contro l'ospite e la sepsi [4,16-19].
CISTANCHE MIGLIORERA' L'INSUFFICIENZA RENALE/RENALE
Come dimostrato in modo convincente in diversi modelli murini, CD73 può partecipare all'interazione tubulo-glomerulare nelrene. È stato dimostrato che la generazione mediata da CD73-di adenosina derivata da CD73 dall'ATP di origine tubulare durante il danno da ischemia-riperfusione attenua l'infiammazione attraverso l'inibizione della funzione effettrice dei neutrofili [ 20 ]. Inoltre, i topi con deficit di CD73- mostrano un'infiammazione autoimmune accompagnata da un numero ridotto di podociti e fenestrazioni endoteliali [ 21 ]. Questo fenomeno è stato associato ad un aumento dei livelli sierici di citochine pro-infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale (TNF)-alfa o il ligando 2 del motivo CXC delle chemochine (CXCL-2). Nella cornice dell'umanomalattie renali,è stato ipotizzato che il danno podocitario rappresenti probabilmente una miscela di meccanismi adattativi e distruttivi della risposta cellulare a stimoli patologici, non riflettendo necessariamente le osservazioni pubblicate da modelli in vitro o animali. L'eziologia del danno podocitario varia da stress meccanico (iperfiltrazione glomerulare), stress ossidativo (come nella nefropatia ipertensiva o diabetica, danno tossico, infiltrazione di cellule infiammatorie o modelli animali di malattia a cambiamento minimo) allo stress immunologico (cioè, immunocomplesso e danno mediato dal complemento durante la glomerulonefrite) [ 22 ]. L'ambiente infiammatorio della glomerulonefrite può stimolare i podociti a sintetizzare varie citochine, potenzialmente tramite la segnalazione mediata dal recettore 2 delle chemochine CC (CCR2). Tuttavia, si sa poco sul ruolo del CD73 nell'uomomalattie renali, specialmente nel contesto di infiammazioni croniche e lesioni dei podociti.
Nel presente studio, abbiamo ipotizzato che il CD73 svolga un ruolo nella patogenesi delle malattie glomerulari umane e abbiamo analizzato l'espressione del CD73 del podocita nell'uomorenebiopsie di pazienti con patologie correlate alla podocitopatia. Dimostriamo che l'espressione della superficie dei podociti di CD73 è un marker affidabile di danno dei podociti, supportando così in particolare il valore diagnostico di CD73 nella malattia a cambiamento minimo (MCD). Inoltre, riportiamo una correlazione negativa tra l'espressione di CCR2 e CD73 del podocita, suggerendo che la sovraespressione di CD73 rappresenta una risposta adattativa alla lesione glomerulare.
Risultati
Dati clinici e imaging ultrastrutturale del danno podocitarioLa tabella 1 delinea la presentazione clinica dei casi inclusi nello studio per quanto riguarda i valori di età, sesso, creatinina e proteinuria totale. Tutti i pazienti con FSGS avevano una forma NOS primaria (non altrimenti specificata). Tra i 12 pazienti con MGN, 5 erano positivi al recettore della fosfolipasi A2 (PLA2R) (42%). Nel gruppo dell'amiloidosi, 2 pazienti avevano amiloidosi AA (16,7 percento) e 10 amiloidosi AL (83,3 percento); in 2 pazienti con AL-amiloidosi a catena leggera kappa era evidente (20%) e 8 erano positivi per lambda (80% del gruppo AL-amiloidosi). In tutti i pazienti con MCD, FSGS, MGN e amiloidosi, il danno podocitario è stato chiaramente rilevato mediante microscopia elettronica (Figura 1).
Figura 1. Immagine ultrastrutturale del danno podocitario primario e secondario. ( a ) Diffusione del corpo podocitario sulla membrana basale glomerulare (freccia) con retrazione dei processi del piede in un caso di MCD. ( b ) Ampia cancellazione del processo del piede podocitario (freccia) e vacuolizzazione citoplasmatica (stella) in un paziente con FSGS primario. ( c ) Cancellazione del processo del piede (freccia), vacuolizzazione e organelli prominenti (doppia freccia) con materiale epimembranoso denso di elettroni (stella) sottostante nella glomerulonefrite membranosa primaria. ( d ) Accumulo sottoepiteliale di fibrille amiloidi (freccia a due punte) con distacco consecutivo di podociti (come segno di danno podocitario irreversibile) in un paziente con amiloidosi AL (lambda). Tutte le micrografie elettroniche sono presentate con un ingrandimento di 4000 ×. Inserti: fotomicrografie al microscopio ottico corrispondenti (40 × /0,65 NA; dimensione della barra della scala: 50 µm in (a, c, d) e 100 µm in (b); colorazione PAS).
L'espressione superficiale di CD73 è associata alla lesione dei podociti nella malattia renale umana
Per esplorare se i podociti esprimono CD73 nell'ambiente fisiologico e per valutare il modello di CD73 in diverse malattie correlate al danno topodocitario, abbiamo eseguito un'analisi immunoistochimica dell'espressione di CD73. L'analisi ultrastrutturale ha confermato il danno podocitario come irregolarità del citoscheletro con almeno la cancellazione del processo del piede (Figura 1). Nel nostro gruppo di controllo negativo senza lesione dei podociti, non è stata rilevata alcuna espressione podocitaria significativa di CD73 nonostante la positività di un controllo interno (capillari peritubulari) che in genere si colora di positivo (Figura 2). D'altra parte, i gruppi di danno podocitario (MCD, FSGS, MGN e amiloidosi) hanno mostrato una sovraregolazione statisticamente altamente significativa del podocita CD73 (p < 0.{{1{{20}}}}="" 001);="" l'incremento="" significativo="" è="" risultato="" consistente="" anche="" confrontando="" singole="" entità="" con="" controlli="" negativi="" (p="" almeno="">< 0,001).="" è="" interessante="" notare="" che="" l'entità="" della="" sovraregolazione="" di="" cd73="" tendeva="" ad="" essere="" inferiore="" nel="" gruppo="" mcd,="" sebbene="" significativamente="" inferiore="" solo="" rispetto="" ai="" campioni="" mgn="" (p="0.0043)" (figura="" 2).="" nei="" gruppi="" con="" danno="" podocitario,="" non="" c'era="" correlazione="" tra="" punteggio="" cd73="" semiquantitativo="" e="" proteinuria="" a="" livello="" binario="" (nefrotico/non="" nefrotico)="" o="" quantitativo="" (g/24="" h)="" (spearman="" r="-" 0,0807,="" p="0" .6302="" e="" spearman="" r="-" 0.076,="" p="0.6497," rispettivamente;="" figura="" 3a).="" nel="" complesso,="" non="" c'era="" correlazione="" tra="" il="" punteggio="" cd73="" e="" il="" livello="" di="" creatinina="" (spearman="" r="0.0722," p="0.6259;" figura="" 3b).="" inoltre,="" non="" abbiamo="" potuto="" rilevare="" una="" correlazione="" significativa="" tra="" l'espressione="" di="" cd73="" e="" l'ipertensione="" (spearman="" r="-" 0,03024,="" p="0.8384)" o="" il="" diabete="" mellito="" (spearman="" r="-" 0,1784,="" p="" {{45="">
La sovraregolazione del CD73 derivato dai podociti nella malattia glomerulare umana correla negativamente con l'espressione del recettore CCR2 e non correla con l'espressione di nefrina e podocinaApprezzando i dati pubblicati sulla downregulation dell'espressione di CCR2 dei macrofagi dopo la sovraespressione di CD73 in un modello di cellule staminali, abbiamo ipotizzato che la sovraregolazione di CD73 durante la lesione del podocita sia inversamente correlata con l'espressione di CCR2 pro-infiammatoria e abbiamo eseguito l'analisi immunoistochimica di CCR2. Nel gruppo di controllo, non è stata rilevata alcuna o solo una lieve espressione di CCR2, senza una discrepanza significativa rispetto alla firma CD73 negli stessi campioni. Al contrario, una sovraregolazione per lo più significativa della CCR2 di superficie (ma di varia intensità) è stata osservata nella maggior parte dei campioni da biopsie con danno ai podociti ed è stata generalmente sovraregolata rispetto al gruppo di controllo (p=0.0206; Figura supplementare S1). I gruppi di malattie non differivano in modo significativo l'uno dall'altro in questo senso.
Abbiamo ulteriormente analizzato una potenziale correlazione tra le intensità di espressione di CD73 e CCR2. Infatti, confrontando i punteggi CD73 e CCR2 dalla coorte della biopsia del danno podocitario, è stata osservata una marcata correlazione negativa (Spearman r=− 0.4821, p=0.{{18} }052), (figura 4). Da notare che i glomeruli con podociti CD73-positivi tendevano a mostrare una ridotta espressione di CCR2 non solo nei podociti ma anche nelle cellule circostanti, come le cellule epiteliali parietali (Figura 4). La correlazione inversa è stata confermata dalla valutazione della co-colorazione immunofluorescente per CD73/CCR2 nei podociti danneggiati mediante microscopia confocale (Spearman r=- 0,4478, p {20}}.0282), (Figura 5). Per affrontare l'eventuale associazione tra positività CD73 e (perdita di) espressione proteica specifica del podocita, abbiamo eseguito ulteriori colorazioni immunofluorescenti per nefrina e podocina e valutato il loro pattern di espressione nei gruppi di controllo, MCD e FSGS (Figura 6a) nonché co-colorazione con CD73 in campioni con lesione dei podociti (Figura 6b-e). Non è stato possibile rilevare una correlazione significativa tra l'intensità media di fluorescenza dell'espressione di podocina o nefrina da un lato e l'espressione media di CD73 dall'altro (n=39, Spearman r=0.212, p {{33} }.1948 per podocina e n=60, Spearman r=0.01906, p=0.8851 per nefrina).
Discussione
Descriviamo qui per la prima volta l'espressione di CD73 sulla superficie dei podociti feriti nell'uomomalattia renale. Analizzandorenalebiopsie da pazienti con danno podocitario prominente come in MCD, FSGS, MGN e amiloidosi, riportiamo una significativa sovraregolazione dell'espressione del CD73 del podocita in ciascuno di questi gruppi rispetto al controlloreni,indipendente dall'eziologia del danno podocitario. Inoltre, riportiamo una correlazione inversa tra l'espressione di CD73 e CCR2 da parte dei podociti dei gruppi di danni ai podociti. È stato dimostrato che il CCR2 specifico per i podociti potenziato media il diabetedanno renalenei topi [ 23 ]. Inoltre, è stato riportato che il blocco di CCR2 in un modello murino di FSGS indotto da Adriamicina riduce la proteinuria e il danno glomerulare [24]. Un recente studio di Lee et al., utilizzando anche un modello murino, indica che la deplezione di CCR2 potrebbe migliorare l'albuminuria indotta dall'obesità attraverso il blocco dello stress ossidativo e dell'accumulo di lipidi [25]. Infatti, in un sistema in vitro che impiega cellule staminali mesenchimali (MSC) da tessuto pericardico murino, è stato dimostrato che le MSC con sovraespressione di CD73- determinano processi riparativi attraverso l'attività antinfiammatoria, tra gli altri fattori anche a causa dell'inibizione del CCR{ {9}}infiltrazione positiva dei macrofagi [ 13 ]. Quindi, alla luce dei nostri risultati e dei dati pubblicati, si è tentati di postulare che l'espressione di CD73 da parte dei podociti possa agire in modo protettivo indanno renale, possibilmente tramite percorsi che attenuano CCR2. La segnalazione di CCR2 è strettamente correlata all'adesione e all'attivazione dei macrofagi [26, 27]. Poiché i macrofagi possono influenzare la patogenesi della podocitopatia associatamalattie renali(come MGN primario, dove l'infiltrazione di CD68 plus, CCR2 plus macrofagi è stata riconosciuta come un indicatore significativo di stadio terminaleinsufficienza renale[ 28 ]), ulteriori studi di associazione tra contenuto di monociti/macrofagi, origine (infiltrante vs. residente), profili di attivazione (M1 — proinfiammatorio vs. M2 — alternativamente attivato) ed espressione di CD73 nell'uomomalattie renalisono necessari per verificare la corrispondenza dei nostri risultati con i dati precedenti di modelli murini.
In un microambiente infiammatorio che può essere visto nell'ipossia, nell'ischemia-riperfusione o nel danno tissutale autoimmune, più cellule rilasciano membri del sistema di segnalazione purinergico, prevalentemente sotto forma di ATP o ADP pro-infiammatorio [29, 30]. In questi contesti, l'ectonucleotidasi CD73 e il suo prodotto adenosina sono fattori importanti per la regolazione e il silenziamento della risposta immunitaria. In modelli animali, CD73 ha dimostrato di essere protettivoreneil danno da ischemia da riperfusione e la sua carenza hanno indotto una disfunzione dei podociti, che porta a infiammazione autoimmune emalattie renali[ 21 , 31 ]. Altri esperimenti su topi in vivo che utilizzano l'ischemia riperfusione-lesione hanno rivelato l'importante influenza antinfiammatoria del CD73 espresso dalle cellule epiteliali tubulari prossimali e la sua azione cruciale inreneprotezione durante la nefropatia diabetica tramite la segnalazione del recettore Adora2b dell'adenosina-endoteliale [20,32]. Le podocitopatie sono il gruppo più frequente di lesioni glomerulari che portano a proteinuria. La MCD, un prototipo di podocitopatia "primaria", è la causa più comune di proteinuria nefrosica nei bambini di età > 1 anno [33, 34]. Le attuali ipotesi sulla patogenesi della MCD suggeriscono un ruolo significativo delle citochine e di altri mediatori immunitari nell'interruzione dell'integrità della membrana basale podocita-glomerulare [35 – 38]. La discrepanza tra l'assenza di cambiamenti visibili al microscopio ottico e la grave proteinuria è il segno distintivo della MCD; l'evidenza ultrastrutturale di danno podocitario mediante microscopia elettronica è quindi una conditio sine qua non per la diagnosi di MCD fino ad oggi. Questo algoritmo diagnostico sottolinea il significato di ulteriori strumenti diagnostici di prima linea a questo riguardo. L'esame dell'espressione di CD73, specialmente nel contesto della disponibilità limitata della microscopia elettronica, potrebbe quindi aiutare a differenziare tra fonti di proteinuria glomerulare (cioè podocitopatica) ed extraglomerulare (ad esempio tubulare o paraproteinemica). Il confronto tra immunoistochimica e immunofluorescenza nel nostro studio parlerebbe a favore di quest'ultima.
CISTANCHE MIGLIORA LA MALATTIA RENALE/RENALE
Diverse pubblicazioni hanno documentato in modo convincente la distribuzione aberrante e la perdita di proteine specifiche dei podociti in varimalattie renaliimpostazioni che includono danno podocitario e proteinuria, come recentemente rivisto [39]. Nel nostro studio, all'interno del gruppo con danno ai podociti, non abbiamo potuto rilevare una correlazione significativa tra l'intensità della fluorescenza di podocina/nefrina e l'intensità dell'espressione di CD73. Tuttavia, limitazioni specifiche precludono l'interpretazione fisiopatologica di podocina/nefrina rispetto ai dati statistici CD73. Innanzitutto, per la valutazione dell'intensità della fluorescenza abbiamo selezionato i podociti utilizzando le capacità tecniche di ingrandimento e risoluzione della microscopia confocale. Sebbene queste condizioni consentano facilmente il rilevamento dei corpi dei podociti, i processi principali e in particolare i processi del piede rimangono indistinti, quindi probabilmente non contrassegnati / analizzati. In secondo luogo, la correlazione tra l'espressione di CD73 e proteine podocita-specifiche in glomeruli interi non può essere giustificata: sebbene la valutazione di podocina e nefrina a questo livello sia legittima (poiché è ragionevole presumere che nessun'altra cellula glomerulare esprima queste proteine) ciò non può essere rivendicato per CD73 che è parzialmente espresso almeno dalle cellule endoteliali. In terzo luogo, la valutazione dell'intensità media della fluorescenza da sola come marker indipendente di danno podocitario è discutibile, poiché non copre il modello patologico di distribuzione granulare di podocina e nefrina all'interno del glomerulo, che potremmo osservare chiaramente nella Figura 6. Pertanto, siamo riluttanti attribuire l'assenza di correlazione tra CD73-podocina e CD73-nefrina nella nostra analisi a percorsi molecolari divergenti di questi marcatori. Sono necessari ulteriori studi sui podociti in vitro e sugli animali per esplorare eventuali interferenze tra queste cascate di segnalazione.
Presi insieme, riconoscendo la piccola dimensione del campione come la principale limitazione del nostro studio, dimostriamo qui una sovraespressione coerente di CD73 da parte di podociti feriti e suggeriamo CD73 come un nuovo marcatore diagnostico di podocitopatia. Nella malattia a cambiamento minimo, i nostri risultati possono aiutare a identificare i podociti danneggiati e comportare un processo diagnostico meno dispendioso in termini di tempo e denaro. Inoltre, i nostri risultati sono in linea con i dati pubblicati da approcci sperimentali murini e suggeriscono un'interazione protettiva tra CD73 e CCR2 nell'uomomalattie renali. Sono necessari ulteriori studi multicentrici con coorti di pazienti più ampie per affrontare i meccanismi di segnalazione di CD73 nell'uomorenemalattia e il suo valore prognostico. Allo stesso modo, sarebbero necessari numeri di coorte più grandi per stabilire una potenziale correlazione tra la gravità della malattia e l'espressione di CD73.
Materiale e metodi
Coorte di studioUn totale di 49 biopsie incluse in questo studio da 49 diversi pazienti sono state diagnosticate tra il 1 gennaio 2018 e il 31 dicembre 2019 presso l'ospedale universitario di Mannheim, Università di Heidelberg. Ulteriori criteri di selezione erano una biopsia rappresentativa con la possibilità di eseguire una tripla diagnostica con immunoistochimica ed EM, informazioni cliniche adeguate, diagnosi chiara e materiale sufficiente per questo studio. Tutti i pazienti erano adulti e caucasici. Le indagini hanno incluso 39 biopsie di pazienti con danno podocitario di varia eziologia (7 biopsie di pazienti con glomerulosclerosi segmentaria focale primaria - FSGS; 8 da malattia a cambiamento minimo - MCD; 12 da pazienti con glomerulonefrite membranosa - MGN; 12 da pazienti con amiloidosi). I controlli negativi eranorenebiopsie di 10 pazienti senza lesione podocitaria e senza proteinuria (6 pazienti con nefrosclerosi lieve, 2 pazienti con nefrite interstiziale e 2 pazienti senza alterazioni patologiche). Tutte le biopsie sopra menzionate sono state incluse nell'analisi dell'espressione del CD73 del podocita; per CCR2, previa esclusione di sezioni in paraffina con numero insufficiente di glomeruli non sclerotici (<5), we="" performed="" analysis="" of="" surface="" expression="" and="" of="" correlation="" with="" cd73="" signature="" in="" 6="" samples="" from="" fsgs,="" 8="" from="" mcd,="" 10="" from="" mgn="" and="" 8="" from="" the="" amyloidosis="" group.="" in="" the="" ccr2="" analysis,="" the="" control="" group="" consisted="" of="" 6="" biopsies.="" relevant="" clinical="" data="" were="" collected="" from="" electronic="" medical="" records="" (table="" 1).="" informed="" consent="" was="" waived="" because="" of="" the="" retrospective="" nature="" of="" the="" study,="" because="" of="" the="" fact="" that="" anonymous="" clinical="" data="" were="" used="" for="" analysis="" and="" because="" the="" study="" was="" performed="" on="" already="" existing="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" after="" completing="" the="" diagnostic="" process,="" as="" approved="" by="" the="" ethic="" committee="" of="" the="" university="" medical="" centre="" mannheim,="" university="" of="" heidelberg="" (reference="" number:="">
Istologia, Immunoistochimica, Immunofluorescenza e Microscopia ElettronicaLe sezioni seriali da 1 µm sono state eseguite su paraffinarenebiopsie e colorate con ematossilina/eosina (H/E), acido periodico-Schiff (PAS), colorazione tricromica di Masson e immunoistochimica di routine standard per scopi diagnostici. La colorazione immunoistochimica e immunofluorescente di biopsie incluse in paraffina fissate in formalina per sono state eseguite manualmente utilizzando l'anticorpo monoclonale anti-umano CD73 di coniglio (clone D7F9A, Cell Signaling, Francoforte sul Meno, Germania) e l'anticorpo monoclonale anti-umano CCR2 murino (clone 7A7; Abcam, Cambridge, Regno Unito), anticorpi policlonali di coniglio anti-nefrina (Abcam, Cambridge, Regno Unito) e anticorpi anti-podocina di coniglio (Sigma, Saint Louis, MO, USA), secondo i protocolli del produttore. Tutte le biopsie sono state incluse nell'analisi dell'espressione del CD73 del podocita mediante immunoistochimica; per CCR2, sezioni in paraffina con numero insufficiente di glomeruli non sclerotici (<5) were="" excluded.="" to="" minimize="" the="" noise,="" antibody="" optimization="" for="" immunohistochemistry="" was="" performed="" using="" control="" (tonsil)="" tissue.="" the="" tissue="" sections="" were="" stained="" with="" dako="" real="" detection="" system="" alkaline="" phosphatase/red="" rabbit/mouse="" kit="" (agilent,="" santa="" clara,="" ca,="" usa)="" and="" avidin/biotin="" blocking="" kit="" (vector="" laboratories,="" burlingame,="" ca,="" usa).="" antigen="" retrieval="" was="" performed="" for="" 20="" min="" using="" dako="" target="" retrieval="" solution="" (equivalent="" citrate="" buffer,="" ph="" 6.0).="" primary="" antibodies="" were="" incubated="" for="" 60="" min="" in="" dako="" antibody="" diluent="" with="" 2%="" dry="" milk="" at="" 37="" ◦="" c="" and="" detected="" using="" the="" dako="" real="" link,="" biotinylated="" secondary="" antibodies="" (included="" in="" the="" kit),="" and="" dako="" real="" streptavidin="" alkaline="" phosphatase="" (ap).="" the="" reaction="" was="" visualized="" by="" a="" red="" chromogen="" (included="" in="" the="" kit).="" the="" slides="" were="" counterstained="" with="" hematoxylin,="" dehydrated,="" mounted="" using="" aquatex="" (merck,="" darmstadt,="" germany)="" and="" cover-slipped.="" for="" immunofluorescence,="" ccr2/cd73="" co-expression="" was="" evaluated="" in="" total="" of="" 22="" podocytes="" from="" all="" podocyte="" lesion="" groups.="" cd73="" was="" stained="" with="" alexa="" flour="" tm="" 488="" tyramide="" superboost="" tm="" kit,="" streptavidin="" (invitrogen,="" thermo="" fisher,="" waltham,="" ma,="" usa)="" using="" secondary="" biotinylated="" anti-mouse="" antibody="" (biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" secondary="" antibodies="" for="" the="" immunofluorescence="" were="" donkey="" anti-mouse="" cf="" 594="" and="" donkey="" anti-rabbit="" cf="" 594="" (both="" from="" biotium,="" fremont,="" ca,="" usa).="" for="" electron="" microscopy,="" biopsies="" were="" post-fixed="" with="" 1%="" osmium="" tetroxide="" (roth,="" karlsruhe,="" germany),="" embedded="" in="" agar="" 100="" resin="" (agar="" scientific,="" stansted,="" uk),="" cut="" at90nm="" thickness="" andstained="" with1%="" uranylacetate(serva,="" heidelberg,="" germany).="" micro-graphs="" were="" taken="" on="" transmission="" electron="" microscope="" jem-1400="" (joel,="" freising,="">
CISTANCHE MIGLIORERA' LA FUNZIONE RENALE/RENALE
Microscopia ottica e analisi morfometricheL'acquisizione e l'analisi delle immagini sono state eseguite utilizzando il microscopio a scansione PreciPoint M8 con obiettivo Olympus PlanCN 40 × /0.65 e il software MicroPoint (v.5 2 maggio016; PreciPoint, Freising , Germania). La valutazione semiquantitativa dell'espressione della superficie del CD73 del podocita nella colorazione immunoistochimica è stata valutata utilizzando una scala di punteggio da 0 a 3 (0—nessuna espressione; 1—positività segmentale focale (<50% podocytes="" positive="" in=""><50% glomeruli);="" 2—focal="" global="" (="">50 per cento di podociti positivi in<50% glomeruli);="" 3—diffuse="" (any="" percentage="" of="" podocytes="" positive="" in="">50 percento di glomeruli). I podociti CD73 positivi e negativi sono stati analizzati per la co-espressione CCR2 utilizzando un sistema di punteggio semiquantitativo basato sull'intensità (0—nessuna espressione, 1—espressione debole, 2—espressione moderata e 3—espressione forte, secondo il controllo positivo CCR2 interno alla biopsia— endotelio e cellule immunitarie infiltranti). La valutazione è stata eseguita in modo indipendente da due patologi (SP e ZP) in modo cieco.
Microscopia confocaleLe immagini di CD73 (Alexa Fluor 488), CCR2 (Alexa Fluor 594) e nuclei (DAPI) dei podociti sono state acquisite in sequenza con il microscopio confocale motorizzato Olympus FV1000 dotato di un HeNe 594 nm, Argon 488 nm e un diodo UV 405 nm laser e tubi fotomoltiplicatori (PMT) controllati dal software FluoView, utilizzando l'obiettivo 60 × /1,35 UPlanSApo. Le 12-immagini bit con frame da 512 × 512 pixel e dimensioni pixel di 0,41 µm per le panoramiche e 0,10 µm per l'alta risoluzione sono state acquisite mantenendo costanti tutte le impostazioni del microscopio. Le immagini sono state ulteriormente elaborate e analizzate in modo semiautomatico utilizzando una macro ImageJ sviluppata internamente (data di accesso: 15 dicembre 2020). In breve, le immagini sono state segmentate per i singoli podociti, è stata applicata la soglia e l'intensità media è stata misurata, analizzata statisticamente e tracciata. Tutte le immagini sono state elaborate con impostazioni costanti e visualizzate con lo stesso pseudo-colore regolato in modo ugualmente lineare per i singoli canali sulle immagini unite
Analisi statisticheLe analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prismv. 8.4.3 software (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). Tutti i dati sono riportati come media ± SEM. Le differenze statistiche sono state calcolate utilizzando il test t accoppiato o non accoppiato e l'analisi di correlazione di Pearson, come indicato.
