Cambiamenti nei profili degli aminoacidi e nei composti bioattivi dei bozzoli di seta tailandesi influenzati dall'estrazione dell'acqua Parte 2

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2.8. correlazioni

È stata utilizzata un'analisi di correlazione (test di Pearson) per effettuare confronti (come coefficienti di correlazione,r) tra e tra i valori per il contenuto fenolico totale, il contenuto totale di flavonoidi, l'attività di scavenging dei radicali DPPH, ABTS plus, FRAP test, anti- -amilasi , anti- -glucosidasi e anti-glicazione di SPE nei ceppi Nangsew ed Eri (Tabelle 5 e 6). Ciascun parametro ottenuto dallo studio ha dimostrato forti correlazioni positive tra TPC, TFC, DPPH, ABTS, FRAP anti- -amilasi, anti{7}}glucosidasi e anti-glicazione. Ciò può essere dovuto al fatto che i composti bioattivi presenti nell'estratto di seta sono in grado di scavenging vari radicali liberi e anti{9}}amilasi, anti{10}}glucosidasi e anti-glicazione. I nostri risultati hanno anche dimostrato che esiste una correlazione lineare altamente significativa tra i risultati per i due ceppi. Questi risultati erano in accordo con quelli di Benzie e Stezo [29], che hanno trovato una forte correlazione positiva tra il contenuto fenolico totale e il test FRAP. Risultati simili sono stati trovati anche tra TPC e DPPH(R2=0.711) e FRAP (R2=0.948), rispettivamente nella zucca amara come riportato da Kubola [30]. Kumar et al.[31] ha condotto una valutazione dell'attività antiossidante e del fenolo totale in diverse varietà di foglie di Lantana Camara. Gli estratti hanno mostrato forti correlazioni tra contenuto fenolico e attività di scavenging DPPH, FRAP e ABTS. È stata trovata la correlazione più alta (r=0.998, R2=0.997) tra il contenuto fenolico totale e il test di scavenging dell'ABTS. Inoltre, Kaewseejan et al. [32].

Le correlazioni tra proprietà biologiche e attività inibitoria sono state trovate nella ricerca di Quan et al.[33] che ha studiato le proprietà antiossidanti e potenziali inibitorie del diabete degli estratti di corteccia di C.tramdenum. Anche i loro risultati hanno scoperto questoantiossidantei test (inclusi DPPH, ABTS, potere riducente e ossido nitrico) erano fortemente correlati con il test inibitorio -amilasi e -glucosidasi a p<>

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3. Materiali e metodi 3.1.Silk Coc00ns

Sono stati raccolti ceppi Nangsew ed Eri di bozzoli di seta tailandesi. IlCeppo Nangsew(bozzoli gialli) è stato ottenuto da Baan Hua Saban, distretto di Phutthaisong, provincia di Buriram, Thailandia. Il ceppo Eri (bozzoli bianchi) proveniva dalla comunità di Nong Ya Plong, Mancha Khiri, provincia di Khon Kaen, Thailandia.

3.2. Sostanze chimiche e reagenti

Tutti gli standard sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA), compresi gli amminoacidi essenziali: fenilalanina, valina,triptofano, treonina, isoleucina, metionina, istidina, arginina, lisina e leucina. Gli aminoacidi non essenziali studiati erano glicina, acido glutammico, acido aspartico, glutammina, serina, tirosina, alanina e asparagina. I reagenti per la determinazione dell'attività antiossidante sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich Co:Folin-Ciocalteu reagent,2,2-diphenyl{5}}picrylhydrazyl(DPPH),2,4,{8}}tripiridyl-s-triazina (TPTZ),2,2'-e-bis(3-thylbenzthiazoline-6-solfonico acido)(ABTS). I solventi e i reagenti utilizzati nell'analisi HPLC sono stati acquistati da Merck (Darmstadt, Germania). La -amilasi (da Aspergillus oryzae), -Glucosidasi (da Bacillus stearothermophilus), p-nitrofenil{20}}D-glucopiranoside (PNP-G), sieroalbumina bovina (BSA) e sodio azide sono state acquistate da Sigma-Aldrich co.

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3.3. Estrazione con acqua distillata

L'estrazione è stata effettuata utilizzando il metodo di Sangwong et al. [34]. I bozzoli di seta sono stati tagliati in piccoli pezzi. Due grammi di questi pezzi sono stati estratti con 200 mL di acqua distillata a 100 gradi per i tempi di estrazione specificati. Gli estratti sono stati centrifugati a 5000 × g per 10 minuti mediante centrifuga (Universal 320/320R, Hettich, Boucherville, QC, Canada). Gli estratti sono stati filtrati attraverso carta Whatman n. 1 sotto vuoto per rimuovere il materiale insolubile, producendo così l'estratto di proteine ​​della seta (SPE).

3.4. Determinazione delle proteine

La determinazione delle proteine ​​è stata determinata mediante il saggio Bradford [35]. SPE (0,5 ml) è stato aggiunto a 1,{4}} ml di soluzione di Bradford e incubato a temperatura ambiente per 5 min. L'albumina sierica bovina (BSA) è stata utilizzata come proteina di riferimento standard. L'assorbanza dei campioni è stata misurata a 595 nm con uno spettrofotometro nel visibile (DR 2700rM Portable Spectrophotometer, Hach, Loveland, CO, USA).

3.5.Amin0-Contenuto acido di LCMS/MS

L'analisi dell'amminoacido ha coinvolto uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo LC-MS-MS (Shimadzu LCMS-8030), una modalità di ionizzazione elettrospray (ESI), seguita dall'analisi in un sistema Shimadzu HPLC (Shimadzu, Kyoto, Giappone) (Chumroenphat et al. [36). L'analisi HPLC prevedeva una portata di 0,2 ml/min; la temperatura del forno a colonna era di 38 gradi e l'autocampionatore era di 4 gradi. Le fasi mobili sono state preparate (A)acido formico acquoso {{10}},1 percento (o/o) e (B) il metanolo-acqua (50:50); quindi il miscelatore era acido formico 0,1 percento (o/v). L'ago dell'autocampionatore è stato spurgato con metanolo prima e dopo l'aspirazione del campione. Le analisi sono state eseguite in triplicato.

3.6. Contenuto fenolico totale (TPC)

Il contenuto fenolico totale nell'estratto proteico della seta è stato analizzato secondo il metodo Folin-Ciocalteu [30]. In breve, 0,3 mL di SPE sono stati miscelati con 2,25 mL di reagente Folin-Ciocalteu al 10 percento disciolto in acqua distillata. Dopo 5 minuti di incubazione, sono stati aggiunti 2,25 mL di una soluzione di carbonato di sodio al 6% (NazCO) e le miscele sono state lasciate riposare per 90 minuti a temperatura ambiente. L'assorbanza dei campioni di soluzione è stata misurata a 725 nm utilizzando uno spettrofotometro. Il TPC nei fagioli è stato espresso come mg di acido gallico equivalenti (GAE) per g di peso secco (mg GAE/g DW). Le analisi sono state eseguite in triplicato.

3.7. Contenuto totale di flavonoidi (TFC)

Il contenuto totale di flavonoidi di SPE è stato determinato secondo Kubota e [30], modificato. In breve,0,5 ml di ciascuna soluzione campione sono stati miscelati con 2,25 ml di acqua distillata e 0,15 ml di NaNO al 5%, soluzione (p/v). La soluzione è stata lasciata riposare per 6 minuti e quindi sono stati aggiunti 0,3 ml di AlCl3(p/v) al 10% alla soluzione. Dopo 5 minuti, sono stati aggiunti 0,1 ml di soluzione 1 M di NaOH （w/ø） e quindi l'assorbanza è stata misurata a 510 nm utilizzando uno spettrofotometro. I risultati sono stati espressi come mg di rutina equivalenti (RE) per g di peso secco (mg RE/g DW).

3.8. DPPH Attività di scavenging radicale

Le attività antiossidanti della SPE sono state determinate come attività di scavenging del radicale libero stabile 1,1-difenil-2-picrylidrazyl (DPPH) secondo Brand-Williams et al.[37]. L'estratto di proteine ​​della seta 0.1 ml è stato aggiunto a 3 ml di un0.001 M DPPHin metanolo. La miscela è stata mantenuta per 30 minuti al buio a temperatura ambiente. L'assorbanza è stata determinata a 517 nm utilizzando uno spettrofotometro. L'equazione per il calcolo dell'inibizione DPPH era la seguente:

(1) Inibizione ( percentuale )=[(Controllo ass.- Campione ass.)/Ass. controllo]×100)

dove gli Abs. il campione è l'assorbanza del campione e Abs. il controllo è l'assorbanza del controllo.

3.9.Attività antiossidante mediante saggio ABTS

Il metodo del catione radicale ABTS di Re et al. (1999) [22] è stato modificato per valutare gli effetti di scavenging dei radicali liberi. La soluzione di lavoro di ATBS è stata preparata combinando 7,4 mM di ABTS e 2,6 mM di persolfato di potassio in un rapporto di 1:1 (v/v), lasciandolo reagire al buio per 12 ore a temperatura ambiente e quindi diluendolo con acqua deionizzata . L'assorbanza è stata determinata a 734 nm utilizzando uno spettrofotometro fino a raggiungere 1,1 ±0.02. Quindi 150 μL di SPE e 2850 μL di soluzione di lavoro ATBS sono stati fatti reagire al buio per 2 ore con miscelazione e il assorbanza a 734 nm utilizzando uno spettrofotometro; come controllo è stato utilizzato metanolo al 100%. L'equazione per calcolare l'inibizione era come Equation(1).

3.10. Saggio di potere riducente/antiossidante ferrico (FRAP)

Il potere riducente degli estratti si basava sul saggio FRAP [23]. Il reagente FRAP fresco è stato preparato miscelando 100 mL di tampone acetato (0,3 mol LI, pH 3,6), 10 mL di soluzione TPTZ disciolti in 10 mL di 40 mmol L-1HC e 10 mL di 20 mmolL -1FeCl; in un rapporto di 10∶1∶1 e, 120 ml di acqua distillata a 37 gradi. In breve, 60 μL di SPE e 180 μL di acqua deionizzata sono stati aggiunti a 1,8 mL di reagente FRAP. La soluzione è stata agitata mediante miscelazione a vortice. Dopo che la soluzione è stata incubata in un bagno d'acqua a 37 gradi per 4 minuti, l'assorbanza è stata misurata a 593 nm contro un controllo. I valori FRAP sono stati visualizzati come mg FeSO4 per g su base secca (mg FeSO4/g DW).

3.11.Attività inibitoria contro l'enzima -amilasi

-L'attività inibitoria dell'enzima amilasi è stata misurata usando il metodo di Xiao et al. (2006)[38] con lievi modifiche. Il substrato è stato preparato facendo bollire 100 mg di fecola di patate in 5 ml di tampone fosfato (pH 7,0) per 5 minuti, quindi raffreddando a temperatura ambiente. SPE （50μL）, substrato （300μL） e 5ug/mL di soluzione di amilasi （20μL）sono stati miscelati e la soluzione è stata incubata a 37 gradi per 15 min. La reazione è stata interrotta aggiungendo 50 μL 1 M HCl, quindi sono stati aggiunti 50μL di soluzione di iodio. L'assorbanza è stata misurata a 650 nm da un lettore di micropiastre. L'acarbosio è stato utilizzato come controllo positivo. La percentuale di inibizione della x-amilasi è stata valutata come Equazione (1).

3.12.Attività inibitoria contro l'enzima -glucosidasi

Il saggio di inibizione dell'enzima -glucosidasi è stato eseguito secondo il metodo di Wang e Zhao[39].SPE (2mL disciolti in dimetilsolfossido; DMSO) e 0.5 U/mL a-glucosidasi(40 mL) sono stati miscelati in 120 mL di tampone fosfato 0,1 M (pH 7,0). Dopo 5 minuti di pre-incubazione, è stata aggiunta una soluzione 5 mM di p-nitrofenil{16}}D-glucopiranoside (40 mL) e la soluzione è stata incubata a 37 gradi per 30 minuti. L'assorbanza è stata misurata a 405 nm mediante un lettore di micropiastre con spettrofotometro di assorbimento UV/Vis. La percentuale di inibizione della -glucosidasi è stata valutata come Equazione (1).

3.13.Valutazione dell'Attività di Formazione Anti-AGEs

Le capacità inibitorie della formazione di AGE della proteina della seta e delle sue frazioni sono state misurate utilizzando il metodo di Vinson e Howard [40]. Il volume totale della soluzione di reazione di glicazione (2,5 mL) è stato preparato miscelando 5{{10}}0 μL di SPE, 500 μL di 20 mg/mL di BSA in tampone fosfato, 500 μL di 0,5 M di glucosio in tampone fosfato e 1 ml di tampone fosfato 0,1 M a pH 7,4 contenente 0,02 percento (p/v) di sodio azide. Questa miscela è stata incubata a 37 gradi per 5 giorni al buio e quindi il numero di AGE fluorescenti formati è stato determinato utilizzando uno spettrometro fluorescente con una lunghezza d'onda di eccitazione di 330 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 410 nm. La percentuale di formazione di anti-AGE è stata calcolata in base all'intensità fluorescente risultante (FI) utilizzando la seguente equazione:(2) n =[1-(FIsample - FIsample bianco)/(controllo-controllo bianco )]×100 dove Flsample è l'intensità fluorescente del campione, bianco campione è l'intensità fluorescente del bianco campione, controllo è l'intensità fluorescente del controllo e bianco FIcontrol è l'intensità fluorescente del bianco di controllo campione.

3.14. Analisi statistica

Tutti i dati sono stati analizzati dal software SPSS (IBM SPSS, Chicago, IL, USA). I risultati sono riportati come media ± deviazione standard (DS) di tre repliche e i dati sono stati analizzati utilizzando il test dell'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) con la differenza meno significativa (LSD) per determinare la significatività relativa al controllo e la correlazione di Pearson test per valutare le correlazioni tra le medie. In tutti i casi, pag<0.05 was="" considered="">

4. Conclusioni

Il nostro studio sugli effetti dell'estrazione della proteina della seta ha comportato l'estrazione con acqua distillata a 100 gradi per sei ore; questa procedura ha fornito i valori più elevati di contenuto proteico, amminoacidi, contenuto fenolico totale (TPC), contenuto totale di flavonoidi (TFC), attività di scavenging dei radicali DPPH, test della capacità di scavenging dei radicali ABTS, test FRAP, anti- -amilasi, anti-a-glucosidasi e anti-glicazione rispetto ad altri tempi di estrazione. Inoltre, la SPE dei ceppi Nangsew ha fornito un contenuto più elevato di tutte queste sostanze nutrizionalmente benefiche, rispetto agli estratti dei ceppi Eri. I risultati suggeriscono che Nangsew sarebbe il ceppo preferito per i nostri piani in corso di sviluppo di un additivo naturale per alimenti funzionali, a base di sericina estratta durante il trattamento del bozzolo, che offre opportunità per un'alternativa nella produzione di bevande funzionali.

Contributi dell'autore:Concettualizzazione, CBand SS; Metodologia, CBand SS; Convalida, CBand SS; Analisi formale, CBand SS; Indagine, C e SS; Scrittura: preparazione della bozza originale, CBand SS; Scrittura: revisione e modifica, CBand SS; Visualizzazione, CBandS.S. Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento:Questa ricerca è stata finanziata da Thailand Science Research and Innovation (TSRI) e Siam Natural Products Co., Ltd.

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale:Non applicabile.

Dichiarazione di consenso informato:Non applicabile. Dichiarazione sulla disponibilità dei dati: Non applicabile.

Ringraziamenti:Il Laboratory Equipment Center della Mahasarakham University per la cooperazione e gli ausili scientifici forniti. Grazie anche a Colin Wrigley, University of Queensland, Australia, per la correzione di bozze in inglese.

Conflitto di interessi:Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.

Questo articolo è estratto da Molecules 2021, 26, 2033. https://doi.org/10.3390/molecules26072033 https://www.mdpi.com/journal/molecules