Capitolo 2: Il fattore 15 simile a Krϋppel sopprime la proliferazione delle cellule mesangiali glomerulari renali attraverso il miglioramento della coniugazione P53 SUMO1

Per maggiori informazioni. contattotina.xiang@wecistanche.com

3. RISULTATI

3.1|Screening dei geni leganti KLF15- attraverso ChIP-Seq in MC glomerulari renali primari

Per identificare i geni partner di legame diretto di KLF15, abbiamo eseguito l'analisi ChlP-Seq e alla fine abbiamo proiettato 2478 geni. L'analisi GO di questi geni attraverso lo strumento sul sito Web www.uniprot.org (Figura 1A, B) ha rivelato termini di funzione molecolare associati a 1941 geni, termini di componenti cellulari relativi a 1662 geni e termini di processo biologico relativi a 1766 geni. Poiché il nostro obiettivo era scoprire in che modo KLF15 influisce sulle MC, ci siamo concentrati sui geni correlati al processo cellulare. Tra i 1315 geni correlati al processo cellulare, è stato riscontrato che 74 geni partecipano ai processi del ciclo cellulare; in particolare, questi geni hanno partecipato al ciclo cellulare mitotico, alla transizione di fase del ciclo cellulare e ad altri processi (Figura 1C, D). Inoltre, abbiamo analizzato i geni coinvolti nella crescita e abbiamo scoperto che erano correlati alla crescita dello sviluppo, alla crescita cellulare e ad altri tipi di crescita (Figura 1E).

3.2|Screening di geni differenzialmente regolati in KLF15-che sovraesprimono MC glomerulari renali utilizzando SILAC e LC/MS

L'analisi SILAC e LC/MS di HRMC che sovraesprimono KLF15 rispetto alle cellule parentali ha portato all'identificazione di 1357 proteine. Abbiamo utilizzato DAVID e IPA per acquisire i domini GO e le vie arricchite delle proteine ​​quantificate identificate da SILAC. È interessante notare che i termini relativi alla funzione biologica di molte proteine ​​erano tra i primi 30 termini GO significativamente arricchiti, inclusa la regolazione del processo metabolico degli aminoacidi cellulari, il complesso proteosomico, il legame proteico e i termini di trascrizione e traduzione, tutti strettamente correlati a ubiquitinazione (Figura 2A). La figura 2B mostra i primi 30 termini di percorso significativamente arricchiti. Diversi termini di processi biologici, inclusi i termini di proteasoma e malattie neurodegenerative, erano anche correlati all'ubiquitinazione.

Clicca per saperecistancein vendita con dettagli

3.3|Analisi bioinformatica dei geni leganti KLF15- che sono potenzialmente associati alla proliferazione renale glomerulare MC

Per esplorare i geni leganti KLF15-a cui sono potenzialmente associatiglomerulare renaleProliferazione MC, abbiamo eseguito un'analisi bioinformatica dei dati ChIP-Seq e dei dati SILAC-LC/MS. Sono stati selezionati cinquantadue geni (Tabella 2 e Figura 2C) e cinque di questi geni, tra cui SUMO1, fattore inibitorio della migrazione dei macrofagi (MIF), fattore di iniziazione eucariotica (EIF), fattore di crescita simile all'insulina (IGF) e reticolocalbina (RCN). ), erano strettamente imparentati conproliferazione cellulare. Poiché le analisi del GO e del percorso delle proteine ​​differenzialmente espresse hanno suggerito che i geni schermati fossero correlati principalmente al processo di ubiquitinazione, abbiamo concluso che SUMO1, un membro della famiglia delle proteine ​​ubiquitina-simili (UBL), partecipa a modificazioni post-traduzionali simili a ubiquitinazione come gene bersaglio di KLF15.

Una quantità crescente di prove ha indicato che l'HG è uno dei principali fattori che inducono lo sviluppo della nefropatia diabetica e promuove la proliferazione del MC e l'aumento della sintesi della matrice in vitro.25 Uno studio precedente ha dimostrato che il PDGF-BB è essenziale per la proliferazione del MC che precede lo sviluppo di glomerulosclerosi nella glomerulonefrite sperimentale.26 Dopo aver confermato che gli MC sono stati stimolati da HG o PDGF-BB in vitro, abbiamo rilevato cambiamenti nell'espressione di KLF15 e SUMO1 sia a livello dell'RNA che della proteina

livelli e ha scoperto che queste molecole avevano tendenze simili (Figura 2D-l). Infine, abbiamo determinato che SUMO1 è il gene bersaglio di KLF15.

3.4|KLF15 up-regola l'espressione del gene SUMO-1 legandosi a una regione del promotore CACCCA-SUMO-1 di 16 bp e un motivo ricco di C più A

Abbiamo utilizzato la suite MEME (http://meme-suite.org/tools/meme) per caratterizzare i motivi di legame KLF15- dei 52 geni selezionati dai dati ChlP-Seq KLF15 e identificato il motivo di legame KLF (Figura 3A). Inoltre, abbiamo ulteriormente analizzato più di mille basi a monte del promotore SUMO1 e abbiamo scoperto che KLF15 potrebbe riconoscere e legarsi a una sequenza di 16 bp (nucleotidi -205~-199) tra cui - CACCCA-(Figura 3B).Chip-PCR ha confermato che KLF15 è legato al promotore SUMO1 e i risultati hanno mostrato un'espressione significativamente più alta di SUMO1 nel gruppo di anticorpi anti-KLF15 rispetto al gruppo di controllo in background (Figura 3C).

Inoltre, abbiamo eseguito un test reporter della doppia luciferasi per confermare la relazione di targeting tra SUMO1 e KLF15. Il gruppo promotore SUMO1 wild-type ha mostrato una maggiore attività della luciferasi rispetto al vettore pGL3 e ai gruppi mutanti negli HRMC e l'attività è stata significativamente aumentata dalla sovraespressione di KLF15. I miglioramenti nell'attività della luciferasi sono stati invertiti dalla trasfezione con un plasmide che esprime la regione del promotore mutante (Figura 3D). Presi insieme, questi dati suggeriscono che SUMO1 è un obiettivo trascrizionale diretto di KLF15.

3.5 |Screening di P53 come substrato di SUMOylation di SUMO1

Le modifiche SUMO sono modifiche post-traduzionali ampiamente espresse negli eucarioti. La coniugazione reversibile di queste modifiche alle proteine ​​del substrato è anche nota come SUMOylation, che svolge un ruolo importante nella regolazione delle funzioni delle proteine ​​​​bersaglio e partecipa ulteriormente a vari processi biologici, come il trasporto nucleocitoplasmatico, la regolazione trascrizionale, l'apoptosi, la stabilizzazione proteica, le risposte allo stress e progressione del ciclo cellulare.27 Per esplorare le molecole di segnalazione a valle direttamente coniugate da SUMO1, abbiamo eseguito un'analisi di rete di SUMO1 utilizzando il database IPA e i dati hanno mostrato che SUMO1 potrebbe coniugarsi direttamente a P53, APP, JUN e AKT, tra gli altri proteine ​​(Figura 4A-C). Inizialmente abbiamo selezionato P53 come molecola a valle di SUMO1 perché è una proteina ben nota che è strettamente correlata alla proliferazione cellulare.28.29 Inoltre, abbiamo utilizzato il software SUMOsp per prevedere le possibili sequenze SUMOylation di P53invariespecie e abbiamo scoperto che P53 aveva la sequenza SUMOylation （ Figura 4D）. Per determinare se P53 è effettivamente modificato da SUMOylation, abbiamo trasfettato transitoriamente HRMC con un plasmide di sovraespressione SUMO1 o un siRNA SUMO1. Sia i risultati IP che Western blot hanno rivelato tendenze nei cambiamenti di espressione di SUMO1-P53 e P53 che erano coerenti con i cambiamenti in SUMO1 (Figura 4E-J). Questi dati indicano che P53 è un substrato di SUMOylation di SUMO1.

3.6 |KLF15 inibisce la proliferazione di MC promuovendo l'espressione di SUMO1 e la SUMOilazione di P53

Per stabilire la regolazione della SUMOilazione di P53 e della proliferazione di MC da parte di KLF15 e SUMO1, siamo intervenuti con l'espressione di KLF15 o SUMO1 in HRMC e HRMC trattati con PDGF-BB. Tra le HRMC trattate con PDGF-BB, le cellule trasfettate con il plasmide di sovraespressione KLF15 hanno mostrato una maggiore espressione di SUMO1-P53, P53, KLF15 e SUMO1 rispetto alle cellule trasfettate con il plasmide di controllo KLF15. Gli stessi cambiamenti in SUMO1-P53, P53 e SUMO1 sono stati trovati nelle cellule trasfettate con plasmide con sovraespressione di SUMO1, mentre l'espressione di KLF15 era invariata in queste cellule (Figura 5A-F). PDGF-BB è uno dei fattori di crescita più efficaci di MC descritti finora ed è stata osservata una risposta proliferativa di HRMC a PDGF-BB. Come mostrato nella Figura 5G, H, la percentuale di cellule EdU-positive è stata significativamente aumentata dalla somministrazione di PDGF-BB ricombinante. I risultati della colorazione EdU hanno indicato che la sovraespressione sia di KLF15 che di SUMO1 inibiva la proliferazione cellulare indotta da PDGF-BB (Figura 5G, H).

Per ottenere ulteriori informazioni sui ruoli di KLF15 e SUMO1 nella proliferazione degli HRMC, abbiamo trasfettato cellule con solo siRNA SUMO1 o le abbiamo cotrasfettate con siRNA SUMO1 e un plasmide di sovraespressione KLF15. La down-regulation di SUMO1 non ha influenzato l'espressione di KLF15, ma i livelli di espressione di SUMO1-P53 e P53 sono stati ovviamente ridotti dopo la trasfezione di siRNA SUMO1 (Figura 6A-C). Inoltre, quando l'espressione di SUMO1 è stata inibita, anche i livelli di espressione di SUMO1-P53 e P53 sono stati soppressi anche nelle cellule che sovraesprimono KLF15 (Figura 6D-F). Quindi, la proliferazione di MC è stata valutata utilizzando un test di colorazione EdU. SUMO1 RNAi ha migliorato l'effetto proliferativo degli HRMC PDGF-BBon e il gruppo cotrasfettato con il plasmide di sovraespressione KLF15 e il siRNA SUMO1 aveva più cellule EdU-positive rispetto al gruppo cotrasfettato con il plasmide di sovraespressione e il controllo della sequenza ibrida siRNA (Figura 6G, H) . Pertanto, concludiamo che KLF15 sopprime la proliferazione di MC migliorando la SUMOilazione di P53.

3.7|L'espressione globale di SUMO1 e P53 nelle MC glomerulari è correlata negativamente con la proliferazione delle MC nella nefrite Thy-1 di ratto

La nefrite anti-Thy1 è un modello classico di glomerulonefrite proliferativa mesangiale autolimitata con una fase proliferativa e una fase di recupero. Abbiamo iniettato un anticorpo Thy1 nei ratti Wistar per creare questo modello. Sia l'azoto ureico sierico che la creatinina non hanno variazioni significative tra i ratti di controllo e i ratti modello (Figura S1). Una marcata proliferazione mesangiale e un accumulo di ECM sono stati osservati durante la fase proliferativa (giorni 5 e 7) nei ratti modello e il numero di MC è diminuito durante la fase di recupero il giorno 10 (Figura 7A). Abbiamo anche rilevato i cambiamenti di espressione nel marcatore di proliferazione cellulare PCNA da IHC (Figura 7A, B). I livelli di PCNA sono stati aumentati il ​​giorno 5, hanno raggiunto il picco il giorno 7 e sono diminuiti il ​​giorno 10 (Figura 7F). L'analisi Western blot ha mostrato che l'espressione proteica di P53, SUMO1 e KLF15 nei glomeruli isolati era inferiore nei gruppi modello rispetto al gruppo di controllo (Figura 7C, D), coerentemente con i risultati immunoistochimici (Figura 7E, F). Questi risultati indicano che la proliferazione anormale di MC nei ratti modello anti-Thy1 è correlata all'espressione di basso livello di KLF15 e SUMO1. Interferire con l'espressione di queste molecole dovrebbe alleviare il fenotipo patologico nei ratti.

4. DISCUSSIONE

Ilglomerulisono le unità di filtrazione delrene. L'interruzione della funzione glomerulare può essere causata da patologia glomerulare primaria o può essere secondaria a malattie sistemiche. Sono stati osservati cambiamenti mesangiali a seguito di lesioni glomerulari inclusa l'iperproliferazione di MC seguita da un'eccessiva produzione di ECM (espansione mesangiale) e produzione di chemioattrattivo per le cellule infiammatorie. Pertanto, la modulazione delle risposte MC, in particolare la proliferazione anormale, è un nuovo approccio terapeutico. KLF15 è una proteina che svolge un ruolo regolatorio come fattore di trascrizione legandosi a specifiche sequenze di DNA. Molti studi hanno riportato che KLF15 è coinvolto nella regolazione della proliferazione cellulare. Ad esempio, è stato scoperto che KLF15 partecipa all'inibizione delle vie di segnalazione legate alla proliferazione di MC,15,30 ma il suo gene bersaglio diretto non è stato riportato in letteratura. Pertanto, questo studio ha coinvolto principalmente lo screening congiunto dei livelli di trascrizione e traduzione per identificare il gene bersaglio diretto di KLF15.

KLF15 regola diversi geni in diverse specie e in diversi tessuti e organi. Nel processo di regolazione della proliferazione delle MC, KLF15 influenza l'espressione di più geni e partecipa a più percorsi.131,32 Per esplorare i geni bersaglio diretti di KLF15, abbiamo usato ChIP-Seg.Klein RH ei suoi colleghi hanno usato ChlP-seq tecnologia per studiare la regolazione di KLF7 sulla differenziazione delle cellule epiteliali corneali.33 Ying M et al ha utilizzato questa tecnica per studiare l'effetto inibitorio di KLF9 sulla pluripotenza del glioblastoma.34Rispetto a ChlP-chip, ChIP-Seq consente una vera analisi dell'intero genoma con una risoluzione più elevata, una maggiore sensibilità di rilevamento e una minore richiesta di dimensioni del campione.35 Abbiamo utilizzato ChP per ottenere i frammenti di DNA legati direttamente da KLF15 e, dopo il confronto e l'analisi con GenBank, abbiamo selezionato 2478 possibili geni bersaglio. Attraverso l'analisi del GO e del percorso, abbiamo identificato molti geni bersaglio coinvolti nel ciclo cellulare e nei processi di proliferazione.

Gli esperimenti ChlP-Seq richiedono la PCR per l'amplificazione del segnale di rilevamento e un certo grado di distorsione durante il processo di amplificazione è inevitabile. Inoltre, ChIP-Seq ottiene solo i geni che KLF15 può legare e non indica i cambiamenti che si verificano nell'espressione di questi geni quando cambia l'espressione di KLF15. Abbiamo utilizzato l'analisi proteomica SILAC-LC/MS per compensare queste carenze. Questa tecnica fornisce informazioni su tutte le proteine ​​la cui espressione cambia in seguito alla regolazione da parte di KLF15, comprese le proteine ​​regolate direttamente da KLF15 e le proteine ​​che sono regolate indirettamente o modificate post-traduzionalmente. Gli HRMC sono stati coltivati ​​​​utilizzando SILAC e KLF15 è stato sovraespresso nelle cellule attraverso la trasfezione del plasmide. Le proteine ​​sono state raccolte per il rilevamento LC/MS e sono state ottenute 1357 proteine ​​differenzialmente espresse. Le analisi del GO e del percorso hanno rivelato che alcune delle proteine ​​differenzialmente espresse erano coinvolte nell'ubiquitinazione. I dati sui geni e sulle proteine ​​sono stati intersecati. I geni non correlati allo scopo della ricerca e i geni non direttamente regolati da KLF15 sono stati rimossi; alla fine, sono stati selezionati 52 geni. Tra questi, sono stati selezionati i cinque geni con le differenze di espressione più evidenti che erano i più strettamente correlati alla proliferazione. Dati i risultati combinati dell'analisi del percorso, dell'analisi dell'espressione SUMO1 e KLF15 in HRMC proliferanti, ChlP-PCR e saggi reporter della doppia luciferasi, la proteina SUMO1 è stata selezionata come gene bersaglio di KLF15.

Oltre all'ubiquitina, viene identificato un numero crescente di UBLproteins,3637 tra cui SUMO,38 precursore neurale espresso da cellule, down-regolato 8(NEDD8)3940 e gene 15(ISG15) stimolato dall'interferone41. Queste proteine ​​modificatrici regolano potentemente una varietà di processi biologici. L'aggiunta covalente di SUMO ai substrati, denominata SUMOylation, è una modifica post-traduzionale coinvolta in una serie di processi cellulari, tra cui il trasporto nucleare-citosolico, la regolazione trascrizionale, l'apoptosi, il controllo della stabilità proteica, le risposte allo stress e la progressione del ciclo cellulare.27 SUMO è tipicamente attaccato ai residui di lisina accettore di substrati proteici che ospitano una sequenza consenso e contribuisce alla regolazione delle interazioni proteina-proteina, nonché alla compartimentazione subcellulare e alla stabilità delle proteine.2 SUMO1, in quanto membro della famiglia SUMOS, può influenzare la proliferazione cellulare modificando il substrato e stabilizzare le proteine ​​​​regolatrici del ciclo cellulare.43 Pertanto, in combinazione con il rapporto della letteratura e i risultati completi di screening e analisi, ci siamo concentrati su come KLF15 regola l'effetto di SUMO1 sulla proliferazione delle cellule mesangiali.

Per identificare i substrati di SUMO1, abbiamo eseguito un'analisi di rete di SUMO1 utilizzando il database IPA e il software SUMOsp. In combinazione con la ricerca pubblicata su P53, i nostri dati di screening iniziali hanno suggerito P53 come molecola a valle di SUMO1 con la sequenza SUMOylation YKxD/E. Precedenti studi hanno dimostrato che P53 era un substrato di SUMOylation,45 e una maggiore coniugazione di P53 SUMO1 promuoveva la stabilità e l'attività di P53 e induceva la se-nescenza.46 Nel nostro studio, l'interferenza con l'espressione di SUMO1 negli HRMC ha prodotto le stesse tendenze di cambiamento in SUMO1-P53 e P53, a indicare che P53 era un substrato di SUMOilazione di SUMO1.

Prove emergenti hanno indicato che la SUMOilazione e la de-SUMOilazione svolgono ruoli in numerose malattie nefropatiche, come disgenesia renale, carcinoma renale, malattia glomerulare, apoptosi dei podociti e ipertonicità del midollo renale, danno renale acuto e nefrolitiasi.7-51 Per chiarire il relazione tra KLF15, SUMO1, P53 SUMOylation e proliferazione MC, abbiamo eseguito una serie di trattamenti di trasfezione su cellule che avevano subito la proliferazione indotta da PDGF-BB. La sovraespressione di KLF15 ha sovraregolato l'espressione di SUMO1, mentre la sovraespressione di SUMO1 non ha influenzato l'espressione di KLF15. La sovraespressione di KLF15 o SUMO1 ha aumentato la SUMOylation di P53 e ha antagonizzato la proliferazione cellulare indotta da PDGF-BB. Quando l'espressione di SUMO1 è stata inibita, anche la SUMOylation di P53 è stata inibita e KLF15 ha perso il suo effetto antagonista sulla proliferazione cellulare. In vivo. la proliferazione delle MC è gradualmente aumentata con l'aggravarsi della nefrite proliferativa mesangiale, mentre l'espressione di KLF15, SUMO1 e P53 è diminuita in modo significativo. Considerando le osservazioni integrate in cellule e tessuti, concludiamo preliminarmente che KLF15 regola la SUMOylation di P53 attraverso SUMO1, inibendo così la proliferazione di MC.

5. CONCLUSIONI

Alcuni studi hanno indicato che KLF15 svolge un ruolo importante nella regolazione della proliferazione delle MC. In questo lavoro, abbiamo esplorato i meccanismi di soppressione della proliferazione MC mediata da questo fattore di trascrizione. Abbiamo identificato SUMO1 come l'obiettivo principale di KLF15 negli MC tramite analisi bioinformatiche che coinvolgono ChIP-Seq e SILAC-LC/MS. Inoltre, con l'aiuto del database IPA e del software SUMOsp, abbiamo determinato che P53 era un substrato diretto di SUMO1. Esperimenti in vitro e in vivo hanno confermato che KLF15 potrebbe promuovere l'espressione di SUMO1 e la SUMOylation di P53 quindi inibire la proliferazione di MC (Figura S2). Questi risultati contribuiscono alla comprensione del ruolo regolatorio di KLF15 nella proliferazione di MC e forniscono una base teorica per trovare nuovi trattamenti per le malattie renali correlate alla proliferazione di MC.