Caratterizzazione degli acidi caffeilchinici da Lepisorus Thunbergianus e loro attività inibitoria sulla melanogenesi

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hak Hyun Kim, Jae Kwon Kim, Jaehyun Kim, Se-Hui Jung* e Kooyeon Lee*

ASTRATTO:L'iperpigmentazione derivante dall'iperattivazione della tirosinasi porta a macchie o macchie più scure sulla pelle umana. Sebbene questi fenomeni siano innocui, c'è ancora una grande richiesta di inibitori della melanogenesi per prevenire l'iperpigmentazione inibendo la tirosinasi, un enzima limitante la velocità della melanogenesi. Sebbene Lepisorus thunbergianus sia stato utilizzato nei rimedi popolari come agente diuretico ed emostatico, il suo effetto sulla melanogenesi non è stato ancora riportato. In questo studio, abbiamo preparato un estratto di L.thunbergianus e le sue frazioni solvente e ne abbiamo valutato l'attività biologica contro la sintesi di radicali liberi e melanina. L'estratto di L. thunbergianus ha inibito l'attività della tirosinasi dei funghi in modo più efficiente e con attività antiossidante simile all'arbutina in vitro. La valutazione comparativa dell'attività anti-melanogenesi e anti-tirosinasi delle frazioni di solvente di L. thunbergianus ha dimostrato che, inibendo l'attività della tirosinasi, la frazione butanolo ha il più alto potenziale per l'inibizione delle cellule di melanoma della melanogenesi. Abbiamo scoperto mediante analisi strutturale mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) e spettroscopia NMR che i principali composti nella frazione butanolo erano tre derivati ​​dell'acido caffeilchinico. I tre derivati ​​avevano simili attività di rimozione dei radicali e anti-tirosinasi in vitro, mentre solo l'acido 5- caffeilchinico aveva un effetto inibitorio sulla melanogenesi indotta da -MSH. L'effetto inibitorio dell'acido 5-caffeilchinico è stato verificato mediante la determinazione del contenuto di melanina e dell'attività della tirosinasi nel melanoma dopo aver trattato le cellule con un composto commerciale. Inoltre, abbiamo rivelato che 5-l'acido caffeilchinico ha inibito la melanogenesi chelando un catione rame da un complesso rame-tirosinasi. Pertanto, 5-l'acido caffeilchinico o la frazione butanolo isolata da L. thunbergianus potrebbero essere utili nei cosmetici come agente sbiancante per la pelle.

Cistanche tubulosa: l'agente sbiancante della pelle.

INTRODUZIONE

La melanina, un gruppo di pigmenti naturali presenti nella maggior parte degli organismi, svolge un ruolo importante nell'imbrunimento di frutta, funghi e vegetali e nella pigmentazione della pelle umana.1 La melanina è prodotta dall'amminoacido tirosina attraverso un processo a più fasi che include l'ossidazione enzimatica e la polimerizzazione. 2 Negli esseri umani, il pigmento di melanina è sintetizzato da melanociti specializzati delle cellule dendritiche situati alla giunzione tra l'epidermide e il derma in cui la sintesi è avviata dall'esposizione ai raggi ultravioletti (UV).3 Il pigmento di melanina viene trasportato ai cheratinociti per proteggere la pelle dai raggi UV e dai radicali liberi; quindi, il colore della pelle è determinato dal modello di distribuzione del pigmento melanina.2 La disregolazione nella sintesi della melanina porta a molte forme di iperpigmentazione, come melasma, lentiggini, macchie senili, lentigo solare, iperpigmentazione postinfiammatoria e altre sindromi da iperpigmentazione.4 Più di un centinaia di proteine ​​sono correlate alla sintesi della tomelanina e, tra queste, la tirosinasi è l'enzima limitante il tasso riconosciuto come responsabile della sintesi della formelanina.5 Pertanto, la maggior parte dei lavori di ricerca per prevenire l'iperpigmentazione si concentrano sull'identificazione, l'isolamento, la sintesi e la caratterizzazione di nuovi potenti inibitori della tirosinasi per la prevenzione della melanogenesi.1,6 Numerosi inibitori della tirosinasi, come acido cogico, arbutina, idrochinone, acido azelaico, acido ellagico e acido tranexamico, sono stati usati in modo popolare nell'industria cosmetica come agenti anti-melanogenesi; tuttavia, a causa dei limiti dei farmaci chimici, che includono citotossicità ed effetti collaterali, sono ancora richiesti nuovi materiali con maggiore sicurezza, stabilità ed efficacia.7

I prodotti naturali, tra cui piante, batteri e funghi, sono diventati fonti alternative per la scoperta di efficaci ingredienti sbiancanti per la pelle grazie alla loro minore tossicità e migliore biocompatibilità e biodisponibilità.1,8 Lepisorus thunbergianusi è una felce appartenente alle Polypodiaceae, che cresce attaccata a vecchie rocce o la corteccia degli alberi ed è distribuito nelle regioni temperate dell'Asia orientale, come Corea, Giappone, Cina, Filippine e Indocina. L. thunbergianus è stato usato come agente adiuretico ed emostatico ed è antitosse nei rimedi popolari coreani. Precedenti studi hanno riportato che un estratto di L. thunbergianus ha un'attività topica di perossidazione anti-lipidica nell'attività locale e antiossidante.9 Inoltre, l'estratto di L. thunbergianus ha mostrato una significativa inibizione della crescita dipendente dalla concentrazione nel cancro orale e nelle cellule del cancro del colon.10 L'estratto di L. thunbergianus potrebbe avere potenziali applicazioni nell'industria cosmetica perché questa pianta contiene vari composti flavonoidi e numerose molecole bioattive, che includono quercetina {7}} metil etere-glucoside, vitexina, orientale, periodical-glucoside, isovitexina, orientina, Corentin e acido caffeoilchinico.9a Tuttavia, gli effetti del L'estratto di L. thunbergianus sulla sintesi della melanina nei melanociti deve ancora essere chiarito.

Figura 1. Analisi dell'estratto di L. thunbergianus per (A) ABTS radical scavenging, (B) anti-tirosinasi e (C) attività di scavenging ROS intracellulare

In questo studio, abbiamo preparato l'estratto di L. thunbergianus e le sue frazioni solventi tramite frazionamento seriale e studiato gli effetti inibitori delle frazioni solvente sulla biosintesi della melanina nelle cellule di melanoma B16F10. Abbiamo identificato la frazione di tebutanolo (n-BuOH) come una porzione principale contenente l'inibitore naturale e ulteriormente caratterizzato gli effetti dei derivati ​​dell'acido caffeilchinico isolati dagli estratti di L. thunbergianus sull'inibizione della biosintesi della melanina.

recensione cistanche: antiossidante

RISULTATI E DISCUSSIONE

Etanolo Estratto di L. thunbergianus Scavenges 2,2′-Azinobis(3-etil-benzotiazoline{5}}acido solfonico (ABTS) Radicale e inibisce l'attività tirosinasi.

L'estrazione di L. thunbergianus con il 70 percento di etanolo (EtOH) è stato eseguito per valutare la potenziale attività inibitoria dei composti naturali nella pianta. L'attività di scavenging dei radicali dell'estratto di L.thunbergianus è stata determinata nell'intervallo di concentrazione di 2-200 ug/mL. L'estratto di etanolo ha mostrato un'attività di scavenging dei radicali dipendente dalla concentrazione con un effetto massimale a 50 ug/mL in cui il risultato era coerente con quello dell'arbutina usata come controllo positivo (Figura 1A).

Abbiamo anche valutato l'effetto inibitorio dell'estratto sull'attività della tirosinasi del fungo misurando il tasso di sintesi del dopacromo catalizzato dalla tirosinasi. L'estratto di etanolo ha inibito l'87% dell'attività della tirosinasi a 500 ug/mL, mentre l'arbutina ha inibito solo il 38% dell'attività della tirosinasi alla stessa concentrazione (Figura 1B). Quindi, abbiamo valutato l'attività di scavenging dell'estratto su ROS intracellulare aumentata di 100 μM di perossido di idrogeno. Il trattamento con perossido di idrogeno ha indotto un aumento di circa 21- volte del livello di ROS intracellulare delle cellule B16F10 (Figura 1C). Abbiamo scoperto che l'aumento di ROS intracellulare mediato dal perossido di idrogeno è stato spazzato via dall'estratto in modo dose-dipendente: l'attività massima di scavenging a 100 ug/mL era del 78 percento (Figura 1C). Questi risultati suggeriscono che l'estratto etanolico di L. thunbergianus contenga ingredienti bioattivi che inibiscono l'attività della tirosinasi, nonché il radicale scavengingABTS e il ROS intracellulare.

estratto di cistanche deserticola: inibisce l'attività della tirosinasi.

Potenziale inibitorio di L. thunbergianus Frazioni contro la melanogenesi.

A crude EtOH extract was fractionated with various solvents including hexane (Hex), methylene chloride (CH2Cl2), ethyl acetate (EtOAc), and butanol to identify and characterize ingredients inhibiting melanogenesis. To identify which solvent fractions have the potential against melanin synthesis, we performed a comparative analysis of four different L. thunbergianus solvent fractions for the radical scavenging and anti-tyrosinase activities. First, to evaluate the antioxidant activity of the four solvent fractions of the L. thunbergianus extract, we determined the ABTS radical scavenging activities in the concentration range of 2−200 μg/ mL. All fractions showed a concentration-dependent increase in ABTS radical scavenging activity (Figure 2A). In particular, EtOAc and n-BuOH fractions completely scavenged the ABTS radical at a 50 μg/mL concentration. The ABTS radical scavenging activity was in the order of n-BuOH > EtOAc >CH2Cl2 > Hex, che è coerente con il precedente rapporto.10bInoltre, gli effetti inibitori delle diverse frazioni di solvente dell'attività dell'ontirosinasi sono aumentati in modo concentrazione-dipendente: le attività inibitorie massime delle frazioni n-Hex e CH2Cl2 erano inferiori al 65%, ma quelle di EtOAc e Le frazioni n-BuOH erano superiori al 70 percento (Figura 2B). L'attività inibitoria era nell'ordine di n-BuOH > EtOAc > CH2Cl2 > n-Hex. Questi risultati suggeriscono che più frazioni idrofile, comprese le frazioni n-BuOH ed EtOAc, hanno mostrato una maggiore attività di scavenging dei radicali e una migliore attività inibitoria rispetto alle frazioni telipofile n-Hex e CH2Cl2 .

Successivamente, sono stati studiati gli effetti delle frazioni di solvente di L. thunbergianus sulla proliferazione delle cellule di melanoma trattando le cellule B16F10 con 200 ug/mL ciascuna di frazioni diverse o 2 mg/mL di arbutina nel presenza di un ormone stimolante i melanociti (-MSH), che è ben noto per promuovere la melanogenesi attraverso l'induzione del fattore di trascrizione associato alla microftalmia (MITF).11 I risultati hanno mostrato che nessuna delle frazioni ha avuto alcun effetto significativo sulla proliferazione cellulare del melanoma (Figura 2C). Abbiamo quindi studiato l'effetto inibitorio delle frazioni di solvente sulla melanogenesi stimolata da -MSH nelle cellule di melanoma. Il trattamento con -MSH ha indotto un aumento di circa 2.0-volte del contenuto di melanina intracellulare delle cellule B16F10 (Figura 2D). Abbiamo scoperto che la melanogenesi mediata da -MSH era completamente inibita dalla frazione n-BuOH (p <0,01) e="" parzialmente="" inibita="" dall'azione="" etoacfrazione="" (40="" percento,="" p=""><0,01), mentre="" la="" melanogenesi="" mediata="" da="" -msh="" non="" era="" significativamente="" modificata="" da="" n-hex="" e="" frazioni="" ch2cl2="" (figura="" 2d).="" inoltre,="" gli="" effetti="" inibitori="" delle="" frazioni="" solvente="" sull'attivazione="" della="" tirosinasi="" mediata="" da="" -msh="" sono="" stati="" determinati="" poiché="" la="" tirosinasi="" svolge="" un="" ruolo="" chiave="" nella="" melanogenesi.="" le="" frazioni="" di="" n-buoh="" (95%,="" p=""><0,001) ed="" etoac="" (66%,="" p=""><0,001) hanno="" invertito="" l'attivazione="" della="" tirosinasi="" mediata="" di="" -msh,="" mentre="" le="" frazioni="" n-hex="" e="" ch2cl2="" non="" lo="" facevano,="" come="" mostrato="" nella="" figura="" 2e.="" inoltre,="" l'effetto="" scavenging="" di="" diverse="" frazioni="" di="" solvente="" sull'aumento="" dei="" ros="" intracellulari="" è="" stato="" stimolato="" dal="" perossido="" di="" idrogeno.="" tutte="" le="" frazioni="" di="" solvente="" hanno="" invertito="" l'aumento="" di="" ros="" intracellulare="" mediato="" dal="" perossido="" di="" idrogeno,="" come="" mostrato="" nella="" figura="" 2f.="" questi="" risultati="" indicano="" che="" la="" frazione="" buoh="" di="" l.="" thunbergianus="" ha="" inibito="" la="" sintesi="" della="" melanina="" indotta="" da="" msh="" inibendo="" l'attività="" della="" tirosinasi="" intracellulare="" nelle="" cellule="" b16f10.="" inoltre,="" questi="" risultati="" suggeriscono="" che="" gli="" ingredienti="" bioattivi="" che="" inibiscono="" la="" sintesi="" della="" melanina="" erano="" idrofili="" e="" si="" trovavano="" principalmente="" nella="" frazione="">

Figura 2. Effetti delle frazioni di solvente sulle attività di scavenging radicale, anti-tirosinasi e anti-melanogenesi ABTS.

Identificazione e caratterizzazione dei composti bioattivi dell'estratto di L. thunbergianus.

Per identificare e caratterizzare gli ingredienti che inibiscono la melanogenesi, è stata eseguita l'analisi della cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) per tutte le frazioni solventi. L'analisi HPLC delle frazioni solvente ha rivelato che tutte le frazioni contengono tre composti principali con tempi di ritenzione di 21, 28 e 29 minuti rispettivamente per i composti 1, 2 e 3 (Figura 3A-D). Questi tre composti principali sono stati ulteriormente isolati mediante purificazione HPLC preparativa. Le quantità dei tre composti principali nella frazione n-BuOH sono state determinate utilizzando derivati ​​commerciali dell'acido caffeilchinico come molecole standard interne, secondo il precedente rapporto.12

I composti isolati sono stati quindi identificati confrontando i loro dati NMR 1H e 13C con la letteratura e sono stati trovati in accordo con le strutture proposte (Figura 4).13 La Figura 3E mostra la struttura molecolare dei tre composti. Il composto 1 (resa, 3,2 ± 0,1 mg/100 mg n frazione BuOH) è stato ottenuto come polvere giallo pallido. 1HNMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9,66 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,49 (1H, d, J=15,9 Hz), 7,04 (1H, s), 6,99 ( 1H, re, J=8.2Hz), 6,78 (1H, re, J=8.1 Hz), 6,23 (1H, re, J=15.9 Hz), 5,20( 1H, m), 5,08 (1H, brs), 4,89 (1H, brs) 4,13 (1H, m), 3,84 (1H, m), 3,56 (1H, s), 3,35 (1H, s), 1,99 (1H, m), 1,92 (1H, m), 1,89 (1 H, m), 1,79 (1 H, m). 13C{1H} NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ (176.42, 168.10, 148.14, 145.53, 144.75, 125.65, 121.07, 115.75, 114.71, 114.22, 72.88, 71.01, 60.45,). Il composto 1 è stato identificato come 3-acido caffeoilchinico mediante analisi NMR e confronto con la letteratura precedente.13b

Il composto 2 (resa, 14,1 ± 0,1 mg/100 mg di n-BuOHfraction) è stato ottenuto come polvere giallo pallido. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, re, J=8.1 Hz) 6,79(1H, re, J=7.9 Hz), 6,30 (1H, re, J=15.9 Hz), 4,85 ( 1H, brs),4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97(2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77,125.54, 121.19, 115.76, 114.68, 114.57, 76.66, 73.92, 63..05, 4). Il composto 2 è stato identificato come 5-acido caffeilchinico mediante analisi NMR e confronto con la letteratura precedente.13c

Il composto 3 (resa, 3,9 ± 0,2 mg/100 mg di n-BuOHfraction) è stato ottenuto come polvere giallo pallido. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ 9,64 (1H, brs), 9,20 (1H, brs), 7,52 (1H,d, J=15,9 Hz), 7,06 (1H, s), 7,02 ( 1H, re, J=8.1 Hz) 6,79(1H, re, J=7.9 Hz), 6,30 (1H, re, J=15.9 Hz), 4,85 ( 1H, brs),4,70 (1H, d, J=4,9 Hz), 4,12 (1H, brs), 3,95 (1H, m), 1,97(2H, m), 1,88 (1H, m), 1,83 (1H, m). 13C{1H} NMR (100MHz, DMSO-d6) δ (176.02, 166.27, 148.28, 145.55, 144.77,125.54, 121.19, 115.76, 114.68, 114.57, 76.66, 73.92, 63..05, 4). Il composto 3 è stato identificato come 4-acido caffeilchinico mediante analisi NMR e confronto con la letteratura precedente.13a

Figura 3. Cromatogrammi HPLC di (A) n-Hex, (B) CH2Cl2, (C) EtOAc e (D) n-BuOH frazioni di L. thunbergianus e (E) struttura dei tre composti principali.

Potenziale inibitorio dei derivati ​​dell'acido caffeilchinico isolati da L. thunbergianus contro la melanogenesi.

Successivamente, per identificare l'ingrediente biologicamente attivo alla base del potente anti-melanogenesi, abbiamo determinato l'attività inibitoria dei tre derivati ​​dell'acido caffeilchinico isolati da L. thunbergianus contro le cellule di melanoma di sintesi della melanina. In primo luogo, sono stati studiati gli effetti dei tre derivati ​​sullo scavenging radicale dell'ABTS. I risultati hanno mostrato che i tre derivati ​​avevano attività di scavenging radicali ABTS simili (Figura 5A). Abbiamo quindi studiato l'effetto inibitorio dei tre derivati ​​isolati dall'attività dell'ontyrosinase di L. thunbergianus. I tre derivati ​​hanno mostrato un'inibizione dipendente dalla concentrazione dell'attività della tirosinasi, con un'inibizione massima a una concentrazione di 200 μM (Figura 5B). Inoltre, abbiamo studiato l'effetto inibitorio dei tre derivati ​​sulla sintesi di melanina indotta da MSH nelle cellule B16F10. Il trattamento con -MSH ha indotto un aumento di circa 20-volte del contenuto di melanina intracellulare delle cellule B16F10 (Figura 5C). È interessante notare che i composti 1 (3-acido caffeoilchinico) e 3 (4- acido caffeoilchinico) hanno aumentato significativamente la sintesi di melanina rispettivamente del 25 e 23 percento (Figura 5C, p< 0.001),="" while="" compound="" 2="" (5-caffeoylquinic="" acid)="" completely="" reversed="" α-msh-induced="" melanogenesis="" (p="" <="" 0.001).="" these="" results="" suggest="" that="" the="" three="" caffeoylquinic="" acid="" derivatives="" with="" similar="" structures="" but="" different="" substitution="" sites="" have="" different="" biological="" activities="" on="" melanogenesis.="" furthermore,="" 5-caffeoylquinic="" acid="" has="" potent="" inhibitory="" activity="" against="">

Figura 4. Spettri NMR 1H di (A) 3-acido caffeilchinico, (B) {3}}acido caffeilchinico e (C) 5- acido caffeilchinico e spettri NMR 13C di (D) {{ 6}}acido caffeilchinico, (E) {7}}acido caffeilchinico e (F) 5- acido caffeilchinico

Verifica dell'efficacia anti-melanogenesi dell'acido 5-caffeilchinico.

Per verificare l'effetto inibitorio dell'acido {{0}}} dell'acido caffeilchinico contro la melanogenesi, abbiamo determinato l'effetto inibitorio della sintesi della melanina dell'acido 5-commerciale dell'acido caffeilchinico mediato da -MSH. Il trattamento con concentrazioni inferiori di 0.1 e 0.2 mM 5-acido caffeilchinico ha leggermente aumentato la sintesi di melanina e l'attività intracellulare della tirosinasi, mentre concentrazioni più elevate di 0,5 e 1 mm del composto hanno invertito la melanogenesi mediata da MSH e attività della tirosinasi intracellulare (Figura 6A, B) in cui i risultati sono coerenti con il rapporto precedente.14

L'acido caffeilchinico è un composto fenolico formato dal legame estere tra l'acido caffeico e l'acido L-chinico. È noto che i derivati ​​dell'acido caffeoilchinico hanno attività anti-melanogenesi e anti-tirosinasi, nonché attività di scavenging dei ROS. La tirosinasi è un metalloenzima multifunzionale contenente rame con cationi rame bivalenti.1 I derivati ​​dell'acido caffeilchinico possono inibire l'attività della tirosinasi chelando un catione rame responsabile del mantenimento dello stato attivo della tirosinasi. Per prevedere l'interazione tra 5-acido caffeilchinico e tirosinasi, è stato eseguito uno studio di docking computazionalemolecolare utilizzando il programma Maestro. La posa migliore per il composto, la totirosinasi ancorata, è illustrata nella Figura 6C, D. Lo studio sull'aggancio molecolare ha rivelato che 5-l'acido caffeilchinico interagisce con lo ione rame a una distanza di 2,43 Å e stabilisce una serie di π−π accatastamento con His 259, Asn 260, His 85 e His 263 residui e un legame H con Arg 268. Inoltre, l'energia di legame tra tirosinasi e 5- acido caffeilchinico era -4,425 kJ/mol. Questi risultati indicano che 5-l'acido caffeilchinico potrebbe inibire l'attività della tirosinasi mediante chelazione del rame. Per verificare il meccanismo inibitorio della melanogenesi da parte del 5-acido caffeilchinico, abbiamo determinato la capacità di chelazione del rame dell'acido 5- caffeilchinico. La capacità di chelazione del rame dell'acido 5- caffeilchinico è stata aumentata in modo dipendente dalla concentrazione (Figura 6E). Questo risultato suggerisce che 5-l'acido caffeoilchinico inibisce la sintesi della melanina tramite la chelazione di un catione di rame che interagisce con la tirosinasi.

Figura 5. Effetti dei tre derivati ​​dell'acido caffeilchinico sull'attività di scavenging dei radicali, anti-tirosinasi in vitro e anti-melanogenesi nelle cellule B16F10.

MATERIALI E METODI

Materiali

L. thunbergianus è stato acquistato dal mercato online www.jirisangol.com (Corea) ed essiccato in condizioni ambientali prima dell'uso in questo studio. Reagenti, come 2,2′-zinco bis(3-etil-benzotiazolina{5}}acido solfonico (ABTS) e 3-(4,5-dimetiltiazol-2- yl)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT), un ormone stimolante i melanociti (-MSH) ed enzimi, come la tirosinasi dei funghi, sono stati ottenuti da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Il persolfato di potassio (K2S2O8), il violetto di pirocatecolo e la 3,4-diidrossi-L fenilalanina (L-DOPA) sono stati acquistati da Alfa Aesar (Haverhill, MA, USA).

Estrazione e Frazionamento di L. thunbergianus.

L. thunbergianus essiccato (80 g) è stato polverizzato utilizzando un polverizzatore (HBL-3500S, Samyang Electronics, Corea) ed estratto con il 70 percento di EtOH tre volte (800 ml, ogni volta ) a 70 gradi per 3 giorni. L'estratto risultante è stato filtrato sotto vuoto utilizzando la carta Advantecfilter n. 1 e 2 (Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Giappone) e concentrato utilizzando un evaporatore rotante Hei-Vap Advantage (Heidolph, Germania) per ottenere 17,2 g dell'estratto EtOHcrude. Questo estratto grezzo è stato sospeso in dH2O (180 mL) e successivamente frazionato con Hex, CH2Cl2, EtOAc e n-BuOH per produrre Hex (1,51 g, 8,8 percento), CH2Cl2 (0,88 g, 5,1 percento), EtOAc (3,95 g, 23,0 percento) e n-BuOH (3,02 g, 17,6 percento), come precedentemente descritto.15 Gli estratti e le frazioni risultanti sono stati liofilizzati e conservati a -80 gradi prima dell'uso.

Determinazione di ABTS Free Radical ScavengingActivity.

Per valutare l'attività antiossidante degli estratti di L.thunbergianus e delle sue frazioni solvente, è stata determinata l'attività di scavenging del radicale ABTS, come descritto in precedenza.16 Per generare il radicale ABTS, 10 mL di 7 mMABTS è stato miscelato con 176 μL di 140 mM potassioperossidisolfato in dH2O e incubato al buio a temperatura ambiente (RT) per 16 h prima dell'uso. La soluzione radicale ABTS è stata diluita con metanolo assoluto per ottenere un'assorbanza di circa 0,7 a 734 nm. Aliquote di 100 μL di ciascun estratto o frazioni nell'intervallo di concentrazione indicato di 2-200 ug/mL sono state aggiunte a 100 μL della soluzione radicale ABTS diluita e incubate per 10 minuti al buio a temperatura ambiente. L'assorbanza è stata quindi misurata a 732 nm utilizzando un lettore di micropiastre multimodale SpectraMaxM5 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). L'attività di scavenging dei radicali ABTS è stata calcolata come segue

Attività di scavenging radicale ABTS (percentuale) =1−(Campione/Acontrollo)×100 (1)

Inibizione della tirosinasi in vitro.

L'effetto inibitorio degli estratti di L.thunbergianus e delle sue frazioni di solvente sull'attività della tirosinasi è stato valutato dalla quantità di dopacromosintetizzato dalla reazione catalitica della tirosinasi.2a,17In breve, 50 μL di ciascun estratto o frazione nell'intervallo di concentrazione indicato sono stati miscelati con 50 μL di 50 U/mL tirosinasi fungina in soluzione salina tamponata con fosfato 50 mM (PBS; Na2HPO4 8,1 mM, KH2PO4 1,2 mM, pH 6,8, 2,7 mMKCl e NaCl 138 mM) in una piastra a pozzetti 96- e incubata per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi, 100 μL di L-DOPA 1 mM sono stati aggiunti a ciascun pozzetto, seguiti da incubazione per altri 10 minuti a 37 gradi. L'assorbanza della soluzione risultante è stata misurata a 475 nm utilizzando il lettore di micropiastre multimodale SpectraMax M5.

Coltura cellulare.

B16F10 cellule di melanoma murino erano coltivate con il mezzo di aquila modificato di Dulbecco (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, USA) integrato con il 10% di siero bovino fetale inattivato termicamente (Gibco), 100 unità/mL di penicillina e 100 ug/mL di streptomicina (Gibco) a 37 gradi sotto il 5% di CO2 umidificata.

Vitalità cellulare.

La vitalità delle cellule B16F10 è stata determinata utilizzando un test MTT, come descritto in precedenza.18 In breve, le cellule B16F10 sono state seminate in 24-piastre a pozzetti a una densità di 1 × 104 cellule per pozzetto. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con le concentrazioni indicate di estratti o frazioni di L. thunbergianus per 48 h. Le cellule sono state quindi incubate con una soluzione di MTT per 4 h e i cristalli di formazano ridotti sono stati sciolti in DMSO. La soluzione risultante è stata trasferita su 96-piastre a pozzetti e l'assorbanza è stata misurata a 540 nm utilizzando il lettore di micropiastre multimodale SpectraMax M5.

Determinazione delle specie di ossigeno reattive intracellulari (ROS).

Il livello di ROS intracellulare è stato misurato utilizzando un kit di test ROS cellulare DCF/H2DCFDA (ab113851, Abcam), secondo le istruzioni del produttore. In breve, le cellule B16F10 sono state seminate in 48-piastre a pozzetti a una densità di 2 × 104 cellule per pozzetto. Dopo una coltura di 24 ore, le cellule sono state trattate per 1 ora con le concentrazioni indicate di L. thunbergianus extractor frazioni di solvente in mezzi di coltura contenenti albumina di siero bovino (BSA) allo 0,1% senza rosso fenolo. Le cellule sono state quindi incubate con 100 μM di perossido di idrogeno per 30 minuti. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state trattate con 25 μMH2DCFDA in PBS per 45 minuti. Il livello di ROS è stato analizzato da un lettore di micropiastre (Synergy H1, Biotek, Vermont, USA) dotato di filtro a fluorescenza a 485/545 nm (lunghezza d'onda di eccitazione/emissione). L'intensità di fluorescenza relativa media del controllo è stata equiparata al 100 percento, con condizioni di trattamento calcolate proporzionalmente.

Determinazione del contenuto di melanina.

Il contenuto di melanina è stato determinato, come descritto in precedenza, con alcune modifiche.19 Le cellule di melanoma sono state coltivate in una piastra a sei pozzetti per 24 ore. Sono stati trattati con le concentrazioni indicate dell'estratto di L. thunbergianus o sue frazioni solvente per ulteriori 48 h in presenza di 100 nM -MSH. Dopo due lavaggi con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco raffreddata addizionata di cloruro di calcio e cloruro di magnesio (D-PBS, Gibco), le cellule risultanti sono state staccate mediante incubazione con una soluzione di tripsina-EDTA. Dopo la centrifugazione a 1000 rpm per 3 minuti, il pellet cellulare è stato sciolto in 150 μL di NaOH 1 M contenente il 10% di DMSO per 1 ora a 60 gradi per 1 ora. Il contenuto di melanina è stato determinato dall'assorbanza a 405 nm utilizzando il lettore di micropiastre.

L'estratto di Cistanche inibisce la melanina.

Determinazione dell'attività cellulare della tirosinasi in cellule di melanoma.

L'attività della tirosinasi nelle cellule B16F10 è stata esaminata in base alla quantità di dopacromo prodotto dalla reazione catalitica della tirosinasi intracellulare.20 In breve, le cellule di melanoma sono state coltivate in una piastra a sei pozzetti per 24 h, seguite da un trattamento con diverse concentrazioni dell'estratto di L.thunbergianus o del suo solvente frazioni per ulteriori 48 hin la presenza di 100 nM -MSH. Dopo aver lavato due volte il D-PBS freddo, le cellule sono state lisate in 200 μL di tampone del test di radioimmunoprecipitazione (RIPA) (Sigma-Aldrich) contenente inibitori della proteasi e della fosfatasi. Dopo la centrifugazione del lisato cellulare raccolto da ciascun pozzetto a 15,{13}}g per 15 min, 100 μL del supernatante sono stati miscelati con 100 μL di L-DOPA 1 mM in PBS (pH 6,8) seguita da incubazione per 30 minuti a 37 gradi . L'assorbanza del dopacromo è stata misurata a 475 nm utilizzando il lettore di micropiastre. I dati sono stati normalizzati con la concentrazione proteica determinata dal dosaggio dell'acido bicinconinico.

Isolamento e caratterizzazione di composti bioattivi mediante HPLC.

L'HPLC è stata eseguita su YL{{0}}(Young Lin Instrument, Corea), dotato di una colonna TC-C18 (4,6 mm, 250 mm e 5 μm, Agilent, USA), incongiunzione con un sistema a gradiente composto da solvente A(0,2 percento di acido formico) e solvente B (MeOH). La pendenza solventratio è stata impostata su 0-5 min, 15 percento B; 5-1{57}} min, 15-20 percento B; 10-15 min, 20-30 percento B; 15-30 min, 30-40 percento B; 30-37 min, 40-60 percento B; 37-40 min, 60-100 percento B; 40-45 min, 100 percento B; 45-50 minuti, 100-15 percento B; e 50-55 min, 15 percento B. Per identificare gli ingredienti nelle frazioni di solvente, la fase mobile è stata consegnata a una velocità di flusso di 1 ml/min e il rilevamento dell'eluizione è stato effettuato a 330 nm. Per raccogliere le frazioni insolventi degli ingredienti bioattivi, la fase mobile è stata erogata a una velocità di flusso di 15,0 ml/min e il rilevamento dell'eluizione è stato effettuato a 330 nm utilizzando prep-HPLC (YL-9100 s, Young Lin Instrument, Korea ), dotato di una colonna prep-C18 (4,6 mm, 212 mm,10 μm, Agilent, USA), in combinazione con un sistema a gradiente composto da solvente A (0,2% di acido formico) e solvente B(MeOH). Il rapporto del solvente della pendenza è stato impostato su 0-10 min, 10% B; 10-20 min, 10-15% B; 20-40 min, 15 percento B; 40-60 min, 15-20 percento B; e 60-70 min, 30 percento B.

Modellazione molecolare.

La struttura cristallina della fungotirosinasi per la modellazione molecolare era un'agaricustirosinasi (PDB fa: 2Y9X) ottenuta dalla Protein DataBank (PDB). L'enzima è stato preparato utilizzando il flusso di lavoro di preparazione di proteinwizard incorporato nel Maestroprogram (Maestro, versione 11.9.011, Schrödinger, LLC, NewYork, NY, USA, 2019). L'acqua e tutte le altre molecole presenti nei file PDB sono state rimosse. L'aggancio molecolare è stato eseguito utilizzando il protocollo di adattamento indotto (IFD) (protocollo Schrödinger Suite 2019 Induced Fit Docking), come riportato in precedenza.21

Capacità di chelazione del rame.

La capacità di chelazione del rame dei composti isolati da L. thunbergianus è stata determinata in base al rapporto precedente.22 Ciascun derivato dell'acido caffeilchinico (10 μL) nella concentrazione indicata è stato miscelato con 280 μL di tampone acetato di sodio 50 mM (pH 6,0), 6 μL di soluzione di violetto di pirocatecolo 4 mM preparata nello stesso tampone e 10 μL di 1 ug/μL di CuSO4·5H2O. La scomparsa del colore blu è stata osservata misurando l'assorbanza a 632 nm utilizzando il lettore di micropiastre multimodale SpectraMax M5. L'acqua è stata utilizzata come controllo invece di un campione. L'attività chelante del rame percentuale è stata calcolata dall'assorbanza a 632 nm, che è la seguente

capacità di chelazione del rame (percentuale)=1− (un campione/un controllo)×100 (2)

Analisi statistica.

Tutti i dati in questo studio sono stati espressi come media ± deviazione standard (DS) da tre esperimenti indipendenti. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Le differenze tra i valori medi del gruppo di controllo e quelli esposti sono state analizzate utilizzando un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA) seguita dal post hoctest di Dunnett. La soglia di significatività statistica per tutte le analisi era p < 0.05="" (a="" due="">

CONCLUSIONI

In questo studio, abbiamo dimostrato che l'estratto di L. thunbergianus elimina i radicali ABTS e mostra un potente effetto inibitorio sulla biosintesi della melanina senza citotossicità significativa. L'ingrediente abioattivo esistente in L. thunbergianus e che inibisce la melanogenesi è stato isolato nella frazione n-BuOH. Inoltre, abbiamo scoperto che i tre derivati ​​dell'acido caffeilchinico sono composti principali che esistono nella frazione n-BuOH e che l'acido 5- caffeilchinico è un ingrediente importante per sopprimere la melanogenesi nelle cellule di melanoma inibendo l'attività della tirosinasi cellulare. Qui, abbiamo isolato un inibitore del composto naturale 5-acido caffeilchinico dall'estratto di L.thunbergianus per prevenire l'iperpigmentazione e rivelato il suo meccanismo di inibizione alla base della melanogenesi. Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che 5-l'acido caffeilchinico e la frazione n-BuOH isolata da L. thunbergianus potrebbero essere utili nei cosmetici come agenti sbiancanti per la pelle.

fettine di cistanghe