Studio sui profili chimici e sui metaboliti di Cistanche Deserticola grezza e lavorata nei ratti da UPLC-Q-TOF-MSE

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Astratto

Sfondo: L'elaborazione della materia medica cinese è una tecnica farmaceutica distinta e unica nella medicina tradizionale cinese (MTC) utilizzata per ridurre gli effetti collaterali e aumentare o addirittura modificare l'efficacia terapeutica delle erbe crude. I cambiamenti nei componenti essenziali indotti da una procedura di lavorazione ottimizzata sono i principali responsabili della maggiore efficacia delle piante medicinali. L'effetto tonificante del rene-yang del vino di riso cotto a vaporeCistanche desertiche(C.deserticola) era più forte della C.deserticola cruda (CD).

Metodi: Un'analisi di confronto è stata effettuata utilizzando l'UPLC-Q-TOF-MS' con la piattaforma informatica UNIFl per determinare l'influenza dell'elaborazione. Sono stati condotti studi in vitro per la caratterizzazione dei costituenti e permetabolitiin vivo. I componenti chimici sono stati determinati in CD e nei suoi prodotti trasformati. Le analisi statistiche multivariate sono state condotte per valutare le variazioni tra di loro mentre OPLS-DA è stato utilizzato per il confronto a coppie.

Risultati: I risultati di questo studio hanno rivelato notevoli variazioni nei glicosidi feniletanoidi (PhG) eiridodidopo l'elaborazione. Un totale di 97 composti sono stati rilevati negli estratti di CD e nel suo prodotto trasformato. I PhG con il 4-gruppo O-caffeoile nella parte 8-O- - D-glucopiranosile, come acteoside, cistanoside C, campneoside Il, osmanthuside sono diminuiti dopo essere stati elaborati, mentre i PhG con 6' Il gruppo -O-caffeoile nella parte 8-O- -D-glucopiranosile, come isoacetoside, isocistanoside C, isocampneoside l, isomartinoside è aumentato, specialmente nel gruppo CD-NP. Anche l'intensità dell'echinacoside e del cistanoside B la cui struttura possiede la frazione 6'-O- -D-glucopiranosile è aumentata. Nello studio in vivo, sono stati rilevati 10 componenti prototipo e 44 metaboliti nel plasma, nelle feci e nelle urine di ratto. I risultati ottenuti hanno rivelato che l'elaborazione porta alla notevole variazione dei costituenti chimici del CD e ha influenzato la disposizione dei composti in vivo, e i processi metabolici di fase Ⅱ sono le cascate chiave di ciascun composto e la maggior parte dei metaboliti sono associati all'echinacoside o acteoside.

Conclusioni: Questa è la prima ricerca comparativa globale di CD grezzi ed elaborati. Questi risultati si aggiungono alla nostra comprensione dell'impatto dell'elaborazione del CD e forniscono dati importanti per future indagini sull'efficacia.

Parole chiave: Cistanche deserticola, Processing, UPLC-Q-TOF-MS5, Profili chimici, Metaboliti in vivo

introduzione

L'elaborazione della materia medica cinese (CMM) ha dimostrato una significativa applicabilità nella pratica clinica della medicina tradizionale cinese (MTC) ed è stata considerata un trattamento praticabile per diversi secoli. Questa è una tecnologia farmaceutica unica che è stata derivata dalla teoria della MTC. Dopo l'elaborazione, sono state identificate differenze significative nell'aspetto, nei costituenti chimici, nelle caratteristiche e nel significato medicinale di tutti i tipi di MTC, portando a supporre che l'elaborazione potrebbe migliorare l'efficacia o ridurre gli effetti tossici della MTC.

Per centinaia di anni,Cistanche desertiche(Rou Cong Rong in cinese, CD) è comunemente usato nella pratica clinica della MTC per integrare le funzioni del rene. Aiuta anche nell'idratazione dell'intestino che porta al rilassamento intestinale [1].Cistancheè stato registrato per la prima volta a ShenNongBencaoJing. Si trova comunemente in habitat aridi e semi-aridi in tutta l'Eurasia e il Nord Africa, inclusi Iran, Cina, India e Mongolia [2]. La lavorazione del CD è stata effettuata mediante cottura a vapore con vino di riso a pressione normale, metodo di preparazione documentato nella farmacopea cinese (Jiucongrong in cinese, di seguito denominato "CD-NP"). E la cottura a vapore CD con vino di riso ad alta pressione è un metodo di preparazione più efficace (di seguito chiamato "CD-HP") [3, 4]. Diversi studi hanno rivelato che gli effetti farmacologici del CD sono diversi dai suoi prodotti trasformati [5]. Il CD può tonificare lo yang dei reni e rilassare l'intestino, mentre dopo essere stato cotto a vapore dal vino di riso, l'effetto di ricostituire lo yang dei reni sarebbe rafforzato. Nel nostro studio precedente, è stato scoperto che il CD-NP potrebbe migliorare la tonificazione del rene e supportare lo yang e alleviare l'effetto dell'inumidimento dell'intestino e della defecazione [6-8]. Nella pratica clinica, i prodotti trasformati sono la forma più comunemente utilizzata.

Fino ad oggi, diversi studi hanno analizzato i componenti chimici del CD, seguiti dall'isolamento e dall'identificazione di più di 100 composti [9-11], come i glicosidi del feniletanolo (PhGs),iridodi, lignani e oligosaccaridi come suoi principali costituenti chimici. È stato anche riportato che ci sono molte attività farmacologiche dei PhG tra cui immunomodulatoria, neuroprotettiva, epatoprotettiva, antinfiammatoria, antiossidante, ecc.[12-14]. Gli iridodi possiedono attività antinfiammatorie [15, 16]. È stato anche rivelato da studi precedenti che alcuni componenti chimici hanno mostrato variazioni durante la lavorazione [17-20]. Sulla base di questi rapporti, si può presumere che la post-elaborazione, le variazioni nella composizione chimica portino a vari effetti farmacologici, che devono essere ulteriormente esplorati.

Nel presente studio, è stato eseguito un metodo sensibile ed efficace, ovvero cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata con TOF-MSE (UPLC-Q-TOF-MSE) per l'analisi comparativa e sono stati eseguiti studi in vitro per analizzare qualitativamente gli estratti di CD, CD-NP e CD-HP per chiarire i loro profili chimici. In generale, le sostanze chimiche esogene con un'elevata esposizione negli organi bersaglio sono state considerate componenti efficaci. Pertanto, nei ratti, CD e suoi prodotti trasformati sono stati somministrati rispettivamente per via orale, seguita dalla loro caratterizzazione. Lo studio esistente rivela per la prima volta uno studio comparativo (sia in vitro che in vivo) di CD grezzi e trasformati. I risultati ottenuti amplierebbero la nostra comprensione per quanto riguarda l'effetto dell'elaborazione CD, che potrebbe essere utile per ulteriori studi.

Materiali e metodi

Materiali

I composti standard di ajugol (180120) e 2'-acetil-acetoside (M0601AS) sono stati forniti da Chendu Pure Chem-Standard Co., Ltd (Chengdu, Cina). Cistanoside F(MUST-17022620), echinacoside (D1105AS), cistano-side A(M0906AS) e isoacteoside(M0106AS) sono stati forniti dalla società Must (Sichuan China); acteoside (O0618AS), salidroside (J0526AS), catalpol (S0728AS), geniposide (A0407AS) e acido geniposidico (MB6001-S) sono stati acquisiti da Dalian Meilun Bio.Co., Ltd(Dalian, Cina).8-acido ossiloganico epide (B31123) era ottenuto da Shanghai Yuanye Biological Technology Co., Ltd, Cina. Metanolo e acetonitrile erano di grado MS e sono stati ottenuti da Merck KGaA, Darmstadt, Germania. L'acido metanoico (CH, O,) di grado HPLC è stato fornito da Merck KGaA (Darmstadt, Germania). L'acqua, utilizzata nello studio esistente, è stata elaborata tramite il sistema Milli-Q (18,2 MQ, Millipore, Ma, USA). Il vino di riso è stato fornito da Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Cina).

Il cistanch deserticola è stato raccolto da Neimenggu wangyedi cistanche Co.Ltd. I campioni sono stati identificati dal Prof. Yanjun Zhai (scuola di farmacia, Liaoning University of MTC). I campioni sono stati inviati alla Liaoning University of Traditional Chinese Medicine.

Animali

Ratti maschi Sprague–Dawley (grado SPF) con 180–220 g di peso corporeo totale sono stati forniti da Liaoning Changsheng biotechnology Co. Ltd. (Laboratory Animal Resource Center of Liaoning Province, numero di licenza: SCXK-2015–0001). Questi ratti sono stati alloggiati in una stanza di riproduzione con temperatura e umidità ben mantenute, cioè 20–26 gradi, 50–70 percento per una settimana. I ratti sono stati nutriti con il solito cibo di laboratorio e acqua prima della sperimentazione. Gli animali hanno digiunato durante la notte, tuttavia l'acqua ad libitum è stata fornita prima della sperimentazione. I topi sono stati eseguiti con un 10 percento di anestetico cloralio idrato. Il Comitato istituzionale per l'etica animale dell'ospedale provinciale di medicina cinese di Liaoning ha approvato tutti i protocolli sperimentali (25.3.2019, 2019015).

Preparazione dell'estratto CD, CD‑NP e CD‑HP

CD-NP, CD-HP sono stati elaborati dallo stesso lotto di Cistanch deserticola. Per preparare CD-NP, pezzi CD secchi (5 mm di spessore, 100 g) sono stati idratati con vino di riso (30 mL) e sono stati cotti a vapore a 100 gradi per 16 ore, seguiti da essiccamento a 55 gradi tramite forno di essiccazione. Mentre il CD-HP è stato preparato mediante infiltrazione di pezzi di CD secchi (5 mm di spessore, 100 g) con vino di riso (30 mL), seguita da cottura a vapore a 1,25 pressione atmosferica per 4 h. e poi essiccato in un forno di essiccazione a 55 gradi.

In un pallone graduato da 100 ml, un grammo della polvere è stato setacciato attraverso il setaccio n. 4, seguito dall'aggiunta del 50 percento di metanolo (50 ml) e quindi ben coperto e miscelato. Questa miscela è stata pesata, seguita da mezz'ora. macerazione. Dopo la macerazione, la miscela è stata ultrasonicata (potenza 250 W, frequenza 35 kHz) per 40 min, seguita da raffreddamento e pesata nuovamente. La perdita di peso è stata reintegrata con il 50 percento di metanolo, opportunamente miscelata e lasciata a riposo, seguita da filtrazione del surnatante e quindi utilizzando il filtrato ottenuto come soluzione di prova.

Analisi MSE dei componenti attivi

Preparazione di sostanze standard: tubuloside-A (3.02 mg), echinacoside (3.00 mg), 2'-acetilacteoside (2,34 mg), acteoside (2,45 mg), isoacteoside (0,61 mg), cistanoside-F (2,14 mg), salidroside (3,39 mg), geni poside (2,84 mg), ajugol (1,58 mg), catalpol (2,39 mg), acido geniposidico (2,56 mg) e 8-epideossiloganico acido (2,34 mg) sono stati aggiunti in un matraccio tarato da 10 mL, aggiunto volume costante di metanolo su scala, confgurato in una corrispondente soluzione di riferimento di concentrazione. Ciascuno dei 100 μL è stato configurato in una soluzione di riferimento mista.

Condizione di analisi MS: il valore della massa è stato corretto prima dell'esperimento ed è stata utilizzata la modalità con ioni negativi. L'intervallo di massa era compreso tra 50 e 1200 Da e il campione è stato iniettato attraverso una pompa di iniezione del flusso. La velocità del cono era di 100 L/h, la portata del solvente era fissata a 800 L/h. Le tensioni del capillare e del cono sono state fissate di conseguenza a 2500 e 40 V. La temperatura della sorgente ionica e del gas solvente era rispettivamente di 100 gradi e 400 gradi e la frequenza di acquisizione del segnale era 0,5 S-1.

Analisi UPLC-Q-TOF-MS dell'estratto CD (15–16 min), dal 65% al ​​55% A (16–18 min). La portata era di 0,3 ml min−1, mentre la temperatura della stanza dell'autocampionatore e della colonna era di 30 gradi e 8 gradi separatamente. Il volume di iniezione era 1,0 μL.

La valutazione spettrometrica di massa è stata effettuata tramite Waters XEVO G{{0}}XS QTOF MS (Waters Corporation, Milford, MA, USA), comprendente una sorgente ESI. La portata di azoto gassoso è stata fissata a 800 L·hrs−1 con una temperatura di 400 gradi, la temperatura della sorgente è stata fissata a 100 gradi e il gas del cono è stato fissato a 50 L h−1. La tensione del cono e del capillare è stata regolata di conseguenza a 40 e 2000 V. L'energia di collisione della rampa è stata utilizzata nell'intervallo 20–30 V. I dati centroide di tutti i campioni sono stati ottenuti da 50 a 1200 Da, con un 5-tempo di scansione di 0,5 s su un tempo di analisi di 10 minuti . LockSpray TM è stato impiegato per la convalida della precisione della massa. Te [M–H]− ione di leucina encefalina (200 pg·μL-1 portata di infusione 10 μL min-1) a m/z 554,2615 è stato utilizzato come massa di blocco. Il software Te MassLynx V4.1 (Waters Co., Milford, USA) è stato impiegato per la massa precisa, la composizione degli ioni precursori e il calcolo degli ioni frammento.

Analisi dei dati nella piattaforma Masslynx

Inoltre, è stata creata una biblioteca interna comprendente il nome del composto, la sua struttura e la formula molecolare (in mol.) sulla base della letteratura. Tutti i composti sono stati annotati in un modello speciale, realizzato in Excel. Inoltre, sul PC locale sono stati salvati anche i file mol (Chemdraw Ultra 8.0, Cam-bridge soft, USA) e i file Excel di tutte le singole strutture dei composti. Il consolidato foglio Excel contenente dati importanti è stato importato direttamente nella biblioteca scientifica dell'UNIFI

UNIFI 1.8.2, Waters, Manchester, Regno Unito è stato impiegato per la valutazione delle caratteristiche strutturali, in particolare per i frammenti caratteristici e la frammentazione della SM. È stata impostata un'area di picco minima di 500 per il rilevamento del picco 2D. Durante la rivelazione dei picchi 3D, sono state scelte una bassa intensità di picco di energia di oltre 300 conteggi e un'intensità di picco di energia elevata di oltre 80 conteggi. L'errore di massa è risultato essere fino a ± 10 ppm per i composti noti e la tolleranza del tempo di ritenzione è stata impostata nell'intervallo di ± 0, 1 min. Abbiamo selezionato gli addotti negativi contenenti -H, più HCOOH. L'elaborazione dei dati grezzi ottenuti dalla SM è stata effettuata tramite un software UNIFI semplificato per individuare rapidamente i componenti chimici che soddisfacevano gli standard con il database autocostruito e la libreria interna di medicina tradizionale.

Successivamente, per verificare la struttura chimica di ciascun composto bersaglio, gli isomeri sono stati distinti per i loro caratteristici modelli di frammentazione della MS che sono stati rivelati negli studi riportati e confrontando i tempi di ritenzione degli standard di riferimento.

Analisi metabolomica basata sull'analisi statistica multivariata

Prima di elaborare i dati grezzi, sono stati impostati i parametri, come massa compresa tra 150 e 1200 Da, intervallo di tempo di ritenzione (da 0 a 20 min), intensità di soglia ( 2000 conteggi), tolleranza di massa cioè,5 MDA, mentre la finestra di tempo di massa e di ritenzione era rispettivamente di 0,20 min e 0,05 Da. Nell'elenco successivo del database, l'identificatore degli ioni era la coppia RT-m/ rispetto ai loro tempi di eluizione. Gli stessi valori per RT e m/z in vari lotti di campioni sono stati considerati come lo stesso composto.

È stata condotta un'analisi statistica multivariata per valutare biomarcatori efficaci che hanno contribuito notevolmente alle variazioni tra i diversi gruppi. Durante l'analisi, l'analisi delle componenti principali (PCA) è stata utilizzata per indicare le differenze massime e il riconoscimento dei modelli per ottenere una panoramica e una classificazione. OPLS-DA è uno strumento di modellazione che fornisce la visualizzazione del caricamento dei componenti predittivi OPLS-DA per facilitare la valutazione del modello. Importanza variabile per la proiezione (VIP) è stata utilizzata per valutare la valutazione delle varie componenti, e ilmetabolitiwith VIP values>1.0 e valore P<0.05 were="" regarded="" as="" effective="" markers.="" furthermore,="" a="" permutation="" test="" was="" conducted="" for="" providing="" reference="" distributions="" for="" the="" r²/o²values="" that="" could="" show="" the="" statistical="">

I ratti da esperimenti sugli animali sono stati classificati casualmente in quattro gruppi (n=6 per ciascun gruppo), seguiti dalla somministrazione orale di vari estratti: (1) Gruppo di controllo in bianco: ai ratti è stata somministrata una soluzione salina normale (2 ml/100 g) ; (2) Gruppo CD: ai ratti è stato somministrato un estratto CD (2 mL/100 g); (3) Gruppo CD-NP: ai ratti è stato somministrato un estratto CD-NP (2 mL/100 g); (4) Gruppo CD-HP: ai ratti è stato somministrato un estratto CD-HP (2 mL/100 g). L'ulteriore categorizzazione di tutti i gruppi è stata effettuata in tre sottogruppi per plasma, urina e feci, di conseguenza. Due ore dopo, a ciascun ratto è stata somministrata per via orale la stessa e uguale quantità di estratti.

Dopo la somministrazione, la raccolta dei campioni di sangue è stata effettuata a 1.0 h, 2.0 h e 4.0 h in provette di polietilene eparinizzate da 1,5 ml (dalle vene orbitali) , seguita da centrifugazione (a 4500 rpm) di tutti i campioni per 15 min.

Per i campioni di urina e feci, i ratti sono stati tenuti in gabbie metaboliche, quindi è stata effettuata la raccolta di campioni di urina e feci per 24 ore dopo la somministrazione. La centrifugazione dei campioni di urina è stata eseguita a 4500 rpm per 15 minuti, mentre i campioni di feci sono stati essiccati all'ombra, macinati in polvere, quindi sono stati prelevati 0,2 g e aggiunti a 0,5 ml di soluzione fisiologica soluzione, ultrasuoni per 5 min e centrifugato a 12,{9}} rpm per 15 min. Tutti i campioni biologici sono stati mantenuti a -80 gradi fino all'analisi.

Preparazione di campioni biologici. L'aggiunta di campioni di plasma, urina e feci è stata effettuata con 3 volumi di metanolo, seguita da vortex per 3 min. Successivamente, la centrifugazione (a 12,{3}} rpm) delle miscele è stata eseguita per 10 minuti, seguita dal trasferimento del surnatante nella provetta EP e quindi essiccata mediante azoto a 37 gradi. Inoltre, è stata effettuata l'aggiunta di 200 μL di soluzione di HCN–H2O (50 percento). Dieci, il vortice è stato utilizzato per la miscelazione (1 min), seguita dalla centrifugazione (a 12,{11}} rpm) per 5 min. Il supernatante (5 μL) dei campioni trattati è stato iniettato nel sistema UPLC-Q-TOF-MSE.

Condizione cromatografica liquida e spettrometria di massa L'analisi permetabolitiè stata eseguita anche dallo strumento Waters UPLC attraverso un'interfaccia ESI. Le separazioni sono state effettuate utilizzando una colonna Acquity UPLC HSS T3 (100 mm×2,1 mm, 1,8 µm), la fase mobile era lo 0,1% di acido formico (A): Acetonitrile (B), il la condizione di eluizione del gradiente era 0-3 min (99,8 percento →98 percento A).3-5 min(98 percento →95 percento A),5-8 min(95 percento →90 percento A), { {18}} min (90 percento → 85 percento A),12-17 min (85 percento → 70 percento A), 17-22 min (70 percento → 60 percento A), 22-23 min (60 percento → 58 percento A), 23-25 min (58 percento A),25-32 min (58 percento → 45 percento A) e 32-37 min (45 percento → 35 percento A ),0,4 ml min{40}} era la portata. La temperatura per la colonna e per la stanza dei campioni è stata fissata rispettivamente a 40 gradi e 8 gradi. Sono state utilizzate le condizioni di spettrometria di massa sopra menzionate.

Strategia per l'analisi sistematica dei metaboliti nei biocampioniIl software UNIFI (1.8.2) è stato utilizzato per l'elaborazione dei dati. La funzione di confronto binario è stata utilizzata per l'identificazione dei metaboliti efficaci. I metaboliti valutati non erano presenti nel campione di controllo equivalente o esistono a basse intensità ioniche. La soglia di intensità relativa è stata fissata a 3 o 5 ed è stato possibile valutare i metaboliti che soddisfacevano i criteri sottolineati. I metaboliti comuni e prevedibili sono stati quindi determinati mediante EIC. Per la ricerca dei metaboliti a due fasi è stata applicata la funzione NLF. Ad esempio, nel software UNIFI, i parametri possono essere impostati a 176.0321 per la ricerca di possibili coniugati dell'acido glucuronico. Post-elaborazione, una perdita neutra può essere impostata nel metodo o identificata. MassFragment è stato utilizzato per determinare o caratterizzare le strutture dei metaboliti rilevati, la funzione di interpretazione spettrale di UNIFI è la funzione principale utilizzata per analizzare la frammentazione secondaria dei componenti principali. Questa funzione può essere utilizzata per la verifica rapida del percorso di frammentazione se ragionevole.

Risultati

Regola della frammentazione di massa dei glicosidi feniletanoidi e degli iridoidi

I glicosidi feniletanoidi sono i principali costituenti chimici del CD. Le soluzioni standard di isoacteoside,

Sono stati presi cistanoside F, tubuloside A, echinacoside, acteoside e 2'-acetil-acteoside, seguiti da un diverso livello di energie di collisione (Tabella 1), e quindi sono state ottenute le corrispondenti mappe MS2 (Fig. 1).

L'analisi spettrometrica di massa ha rivelato che i glicosidi feniletanoidi hanno modelli di frammentazione dello spettro di massa simili, le vie di scissione nella modalità di ioni negativi includono principalmente (1) Scissione del legame estere: perdita del gruppo caffeoile neutro (C, H, O162.03) e acetile neutro gruppo (C, H, O,42.00);(2) Scissione glicosidica: perdita di residui di ramnosio neutri (C.HIO, 146.05) e residui di glucosio neutro (CgHO,162.05). Dalla spettrometria di massa ad alta risoluzione, è stato possibile distinguere caffeoil(162.03) e residuo di glucosio (162.05).

Sono state prese soluzioni standard di iridoidi ajugol, catalpol, acido geniposidico, geniposide e 8-epide acido ossiloganico, seguite da diverse energie di collisione e sono state ottenute le corrispondenti mappe MS (Fig. 2).

I glicosidi iridoidi hanno modelli di frammentazione dello spettro di massa simili, i percorsi di scissione nella modalità di ioni negativi includono principalmente (1) Scissione glicosidica: perdita di residuo di glucosio neutro (CHoO, 162.05); (2) Perdita di CO neutra, (43.99) e H , O(18.01).

Identificazione dei composti in estratti CD, CD-NP e CD-HP

Analisi UPLC-QTOF-MSE

È stata effettuata l'ottimizzazione delle condizioni cromatografiche. Successivamente, i composti di CistancheHerba sono stati valutati in modalità di ioni sia negativa che positiva con CE alti e bassi. I risultati ottenuti hanno rivelato che la compatibilità della modalità negativa era maggiore rispetto alla modalità positiva per questi composti. La Figura 3 mostrava il cromatogramma MS basic peak ion (BPI) tracciato con picchi numerati. L'intensità di ciascuno ione rilevato nell'analisi UPLC-Q-TOF-MS è stata normalizzata rispetto all'intero conteggio degli ioni per la generazione di una matrice di dati che comprendeva il valore m/z, l'area del picco normalizzata e il tempo di ritenzione.

La valutazione dei componenti da CD e dei suoi prodotti trasformati su piattaforma UNIFl

Un totale di 97 composti sono stati identificati con la modalità -SEM (n=6) da CD e dal suo prodotto trasformato (Tabella 2), inclusi glicosidi feniletanoidi (PhG), iridoidi, lignani e oligosaccaridi. I componenti 95,91 e 94 sono stati rilevati di conseguenza in CD, CD-NP e CD-HP. Tra questi, 64 erano feniletanoidi, 13 erano iridoidi e 20 altri tipi di composti sono stati determinati. C'era una somiglianza nella composizione chimica del CD e del suo prodotto trasformato, tuttavia, la quantità dei componenti è risultata diversa tra CD e il suo prodotto trasformato.

Variazioni nei componenti chimici dei prodotti trasformati Il software Simca-P 13.0 è stato utilizzato per analizzare la matrice di dati multivariata. Prima della PCA, tutte le variabili erano centrate sulla media e su scala paretiana, seguite dall'identificazione di potenziali variabili discriminanti. In un grafico del punteggio PCA, ogni punto mostrava un singolo campione. I campioni che mostravano somiglianza nei loro componenti chimici sono stati sparsi l'uno accanto all'altro, mentre quelli che mostravano variazioni nei loro componenti sono stati divisi. Come visto in PCA (Fig.4), il gruppo di CD-HP è stato separato dai gruppi di CD e CD-NP.

To distinguish CD from CD-HP and CD-NP, OPLS-DA, permutation test, S-plot, and VIP value were developed. (Figs.5, 6,7)The obtained results revealed that many components were key characteristic components of each product. The screening condition was the VIP>1 e P<0.05. from="" the="" date="" of="" the="" s-plot,="" the="" characteristic="" components="" were="" evaluated,="" which="" were="" commonly="" existing="" in="" the="" three="">

Dalla Fig.8, abbiamo trovato l'intensità di acteoside(54), cistanoside C(74), campneoside I(43), osmanthuside (75) e 2'-actylacteoside(80) aventi il ​​gruppo 4'-O-caffeoile in la parte 8-O- -D-glucopiranosile (vedi Fig. 9) è diminuita dopo essere stata elaborata dal vino di riso, mentre l'intensità dell'isoacetoside(60), è castanoside (71), iso-campneoside I (69), l'isomartynoside (86) avente il gruppo 6'-O-caffeoile (vedi Fig. 9) è aumentato, specialmente per il gruppo CD-NP. Sebbene il tubuloside B (72) abbia un gruppo 6'-O-caffeoile, lo stesso dell'isoacteoside, l'intensità è diminuita a causa del suo gruppo 2'-acetile. L'intensità dell'echinacoside(38) e del cistanoside B aventi gruppi 6'-O- -D-glucopiranosil è aumentata, ma l'intensità del tubuloside A (55) è diminuita anche a causa del suo gruppo 2'-acetile.

Il nostro team di ricerca ha anche studiato la stabilità termica dell'acteoside e dell'isoacteoside e ha scoperto che l'acteo-side era instabile in acqua, metanolo e soluzione di vino di riso giallo e poteva essere convertito in isoacteoside in parte in condizioni di riscaldamento. Ma la termostabilità dell'isoacteoside era migliore, specialmente nella soluzione di vino di riso giallo. La Figura 10 mostrava i possibili cambiamenti di PhG in CD durante l'elaborazione:

Identificazione dei metaboliti nei ratti Dai dati della spettrometria di massa ad alta risoluzione, sono stati analizzati e confrontati il ​​peso molecolare accurato e la composizione elementare dei metaboliti e dei composti protomolecolari. Poiché gli stessi tipi di composti nella MTC hanno mostrato somiglianza nelle modificazioni metaboliche, le correlazioni dei costituenti fitochimici in vitro possono estendersi ai loro metaboliti in vivo. Nel frattempo, sulla base dei percorsi di biotrasformazione convenzionali, è stato dedotto un ragionevole cambiamento del peso molecolare. Infine, i metaboliti sono stati identificati analizzando gli spettri di massa MSE dei metaboliti e la via di frammentazione dei proto-composti nello spettro di massa [21, 22]. Rispetto al campione bianco, i suoi componenti sono stati identificati in vivo sulla base delle informazioni fornite dal cromatogramma-spettro di massa, dalla possibilità di una reazione metabolica, dalle caratteristiche della struttura del composto e dalla regola di frammentazione del suo spettro di massa. Vedere la tabella 3.

Identificazione dei metaboliti correlati ai glicosidi del feniletanolo

Per l'elaborazione è stata utilizzata la piattaforma UNIFI. La Figura 11 mostrava il cromatografo TIC di urina, feci e plasma per CD e i suoi prodotti trasformati. Rispetto ai campioni bianchi, nei ratti sono stati identificati un totale di 54 metaboliti, inclusi 10 componenti prototipo e 44 metaboliti, di cui 24, 49 e 6 erano nelle feci, nelle urine e nel plasma, di conseguenza.

Sulla base di massa accurata, cascata di frammentazione e perdite neutre prevedibili per biotrasformazione, sono stati valutati provvisoriamente un totale di 35 metaboliti associati ai glicosidi feniletanoidi. I metaboliti correlati dei glicosidi feniletanoidi hanno modelli di frammentazione dello spettro di massa simili, come il tipico frammento decaffeoile m/z 461.1605, quindi ulteriormente idrolizzato da legami glicosidici ed esteri in vivo e metabolizzato in idrossitirosolo (HT)(m/ z153.0504, C.HO.4.73 min) e acido caffeico(CA)(m/z179.0389, CH, O0.77 min), vedere Fig.12A.

M11 indicato [MH]~a m/ 153,0504 con formula ie,C.HO, e identificato come HT. M16 ha presentato [MH]- a m/z 329.0851, che era 176 Da elevato rispetto a quello di HT, rivelando che potrebbe essere un metabolita glucuronidato di HT. Il [MH]-di M26 era a m/z 343.1037,14 Da superiore a quello di HT-glucuronide. Pertanto, M26 è stato identificato come glucuronide metilato HT. M17 è stato identificato come HT-solfato in base al suo [MH]-at m/z 233.0112,80 Da sopra l'HT, che potrebbe essere ulteriormente metilato, quindi ha prodotto M22, che ha mostrato m/z 247.0278, indicando che era HT- metabolita solfato metilato. M7 (m/167.0335) e M5(m/z 167.0762) sono stati considerati rispettivamente prodotti di ossidazione e HT metilato (Fig.12B).

M1 indicava [MH]- a m/z 179.0389, la formula molecolare chiarita era CH-O e identificata come acido caffeico (CA). M25 ha rivelato [MH]- a m/ 355.0704, che erano 176 Da elevati rispetto a quello di CA, mostra che potrebbe essere un metabolita glucuronidato di CA. M27 aveva m/z 258,994, che era 80 Da superiore a quello di CA, quindi l'abbiamo chiarito come solfato di CA e potrebbe produrre M35 (m/z 273,0064). Poiché M4 fornisce [MH]7 a m/z 193.0524,14 Da superiore a CA, è stato identificato come metabolita metilato CA. M39 era il metabolita di deidrossilazione del CA, con m/z 163,04, e poteva essere solfato in M32 (m/z 242,9951).

M33(m/z 181.0491, C.HO,9,06 min) era il prodotto di riduzione di CA, ovvero acido 3,4-diidrossi-benzenepropionico, che poteva essere metilato in M19 (m /z 195.0623, C10H12O4, 0,93 min). M33 può essere disidratato in M43, ovvero 3- HPP (m/z 165,0558, C9H10O3, 11,29 min) e M31 (m/z 341,0942, C15H17O9, 8,90 min) e M29 (m/z 245,0125, C9H10O6S, 8,52 min) erano i prodotti glucuronidati e solfati (Fig. 12C).

Per i metaboliti associati ai glicosidi feniletanoidi, le principali cascate metaboliche sono state le reazioni metaboliche di fase II, cioè la glucuronidazione, la metilazione e la solfatazione. Le cascate metaboliche proposte di feniletanoidi sono illustrate in Fig. 13.

Identificazione dei metaboliti correlati agli iridoidi

Analizzando la composizione elementare dei metaboliti, la frammentazione dell'MSE e la letteratura associata, sono stati valutati provvisoriamente un totale di 19 metaboliti associati agli iridoidi. I glicosidi iridoidi sono stati idrolizzati dai legami glicosidici per formare i loro corrispondenti agliconi. Il m/z 185.117 era per M8, 162 Da inferiore a ajugol, che è stato prodotto dalla perdita di residuo di glucosio.

M40(m/z 199,0641, Rt 10,91 min) era il prodotto deglicosilato di catalpol. M45 m/z 169,0487, Rt 12,15 min) era inferiore a 30 Da quello del metabolita catalpol deglicosilato ed è stato identificato come rimozione di una molecola del metabolita CH, O. M34(m/z 151,0352, Rt 9,08 min), era un'ulteriore perdita di H, O metabolita.

M44(m/z 211,0665, Rt 11,31 min) era un metabolita deglicosilato del geniposide e M37(m/z 197,0833, Rt 15,03 min) era deglicosilazione dell'acido 8-epideossiloganico. Le reazioni metaboliche per gli iridoidi potrebbero essere rivelate come metabolismo di fase I della deglicosilazione (Fig. 12D).

Confronto del profilo metabolico nel plasma, nelle urine e nelle feci tra CD e suoi prodotti trasformati

Sono stati confrontati 2 prototipi nel plasma, 7 nelle urine e 3 nelle feci. C'erano 7 prototipi assorbiti in CD, 7 prototipi assorbiti in CD-NP e 8 prototipi in CD-HP. M21 è stato rilevato solo nel gruppo feci di CD-NP e M38 e M51 sono stati rilevati solo nei gruppi di urina di CD-HP. Rispetto ai metaboliti, i metaboliti identici nel plasma, nelle urine e nelle feci erano rispettivamente 4, 42 e 21. Sono stati assorbiti 34 metaboliti nel gruppo CD, 39 nel gruppo CD-NP e 40 nel gruppo CD-HP. M5, M7, M40 e M52 sono stati rilevati solo nei gruppi CD-NP, mentre M24, M4l e M48 sono stati rilevati solo nei gruppi CD-HP.

Sono state osservate variazioni nell'assorbimento e nel metabolismo dei composti attivi in ​​diversi prodotti trasformati di CD. Dalla Fig.14, abbiamo scoperto che l'intensità della coniugazione con solfato HT (M17) era la più alta nelle urine, seguita da 3-coniugazione con solfato HPP (M29), coniugazione con solfato HT metilato (M22), solfato CA deidrossilato coniugazione (M32) e coniugazione 3,4-diidrossibenzene acido propionico solfato (M19). Il contenuto di prodotti metabolici nel gruppo trattato era maggiore rispetto al gruppo CD, in particolare per M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2. Il loro gruppo precursore 6'-O-caffeoile nella parte 8-O- -D-glucopiranosile, composti come l'idrossitirosolo hanno proprietà antitumorali, s antinfiammatorie, antibatteriche, antivirali e antimicotiche [ 23]. L'acido caffeico possiede attività antinfiammatorie, antitumorali e antivirali [24]. Era coerente con l'uso clinico del CD e dei suoi prodotti trasformati.

Discussione

La CD è una MTC e i suoi principali componenti bioattivi, inclusi PhG, iridoidi e polisaccaridi, sono stati documentati da vari studi di ricerca. Nella pratica clinica della MTC, i prodotti trasformati di CD sono stati ampiamente utilizzati rispetto a quelli grezzi. La composizione chimica sarà modificata durante la lavorazione, il che può portare a cambiamenti negli effetti medicinali (Fig. 14).

I PhG sono un tipo di composto fenolico caratterizzato da una struttura -glucopiranoside recante una parte idrossi-feniletilica come l'aglicone. Questi composti spesso comprendono acido caffeico e ramnosio attaccati al residuo di glucosio tramite legami estere o glicosidici rispettivamente. Nel presente studio, le analisi qualitative di CD, CD-NP. e CD-HP sono stati eseguiti e sono stati identificati un totale di 97 composti, inclusi glicosidi feniletanoidi (PhG), iridoidi, ecc. I risultati ottenuti hanno mostrato variazioni nella composizione chimica prima e dopo la lavorazione. L'intensità dei PhG aventi il ​​gruppo 4'-O-caffeoile nella parte 8-O- - D-glucopiranosile, come l'acteoside, il cistanoside C, il campneoside II, il lato dell'osmanto è diminuita dopo essere stati elaborati, mentre i PhG insieme a

come isoacetoside, isocistanoside, isocampneoside I, isomartinoside sono aumentati, specialmente nel gruppo CD-NP. Anche l'intensità dell'echinacoside e del cistanoside B la cui struttura possiede la frazione 6'-O- -D-glucopiranosile è aumentata. I PhG aventi un gruppo 2'-acetile spesso diminuivano a causa della reazione di idrolisi durante il processo, come il tubuloside B, 2-acetilacteoside.

Lo studio dei metaboliti assorbiti in vivo è stato condotto dopo somministrazione orale di CD e dei suoi prodotti trasformati. I processi metabolici della fase II erano le cascate chiave e la maggior parte dei metaboliti erano solfato, glucuronide e coniugati metilati. I glicosidi del feniletanolo hanno un basso assorbimento e utilizzo per via orale. Sono difficili da assorbire nel sangue e agiscono come progenitori per svolgere i loro ruoli dopo l'attivazione metabolica in vivo. Feniletanoidi prodotti nel feniletano-nolaglicone, come l'idrossitirosolo (HT) e l'acido caffeico (CA) e il suo derivato 3- acido idrossifenilpropionico (3- HPP), questi metaboliti possono essere più facilmente assorbiti nel plasma e avere un migliore effetto medicinale.

CD e suoi prodotti trasformati. La coniugazione con solfato HT (M17) ha la più alta intensità nelle urine, seguita da 3-coniugazione con solfato HPP (M29), coniugazione con solfato HT metilato (M22), coniugazione con solfato CA deidrossilato (M32) e 3,{{ 7}}coniugazione del solfato dell'acido diidrossibenzenepropionico (M19). Il contenuto di prodotti metabolici nel gruppo trattato era maggiore rispetto al gruppo CD, in particolare per M22, M29, M27, M16, M19, M1, M2.

In generale, i componenti che hanno un'elevata esposizione negli organi bersaglio potrebbero essere efficaci. Una quantità sufficiente di feniletanoidi e loro derivati ​​è stata valutata e determinata in vitro. L'acteoside è il composto caratteristico, il cui contenuto è diminuito dopo essere stato trasformato dal vino di riso, e il contenuto di isoacteoside, isocistanoside C, isocampneoside I è aumentato di conseguenza. I prodotti di degradazione dei PhG, come i derivati ​​CA e HT, potrebbero essere valutati nei biocampioni e la lavorazione del vino di riso può aumentare l'assorbimento dei metaboliti in vivo.

Conclusione

In questo studio, sono stati rilevati 97 composti negli estratti di CD e nel suo prodotto trasformato. La degradazione di alcuni glicosidi è avvenuta a temperatura elevata e, di conseguenza, sono stati sintetizzati alcuni nuovi isomeri e complessi. In uno studio in vivo, i componenti prototipo (10) ei metaboliti (44) sono stati determinati o valutati provvisoriamente nel plasma, nelle feci e nelle urine di ratto. I processi metabolici di fase II erano le cascate chiave, la maggior parte dei metaboliti erano associati a echinacoside o acteoside, come HT, CA e loro derivati ​​3-acido idrossifenilpropionico 3-HPP. Questi metaboliti possono essere assorbiti più facilmente nel plasma e avere un migliore effetto medicinale. I risultati ottenuti hanno mostrato che la composizione chimica del CD era diversa e influenzava la disposizione del composto in vitro e in vivo.

Abbreviazioni

PhGs: glicosidi feniletanoidi; CD: Cistanche deserticola; CMM: Materia Medica cinese; MTC: Medicina Tradizionale Cinese; CD-NP: Gistanche deserticola Lavorata al vapore con vino di riso a pressione normale; CD-HP: Cistanche deserticola Lavorata al vapore con vino di riso ad alta pressione; UPLC-Q-TOF-MS: cromatografia liquida ad altissime prestazioni accoppiata con TOF-MS; PCA: Analisi delle componenti principali; VIP: Importanza variabile per la proiezione;CA: Caffeicacid; HA: Idrossitirosolo.

Ringraziamenti

Non applicabile.

Contributi degli autori

LZ, LBN, SJ hanno partecipato alla stesura del manoscritto. RJ, LPP ha assistito con gli esperimenti sugli animali e ha redatto e finalizzato tutte le figure e le tabelle. ZC, HY. ITZ ha assistito alla progettazione e alle prestazioni di questo studio e ha esaminato il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

Finanziamento

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (concessione n. 81874345) e dalla Fondazione di scienze naturali della provincia di Liaoning (concessione n. 2020-MS-223).

Disponibilità di dati e materiali

I set di dati utilizzati e/o analizzati durante lo studio in corso sono disponibili presso l'autore corrispondente su ragionevole richiesta.

Dichiarazioni

Approvazione etica e consenso a partecipare

L'approvazione etica per l'utilizzo di animali da esperimento per questo studio è stata ottenuta dal Comitato etico medico dell'Università di medicina tradizionale cinese di Liaoning (numero di approvazione: 2018YS(DW)-044-01), tutte le procedure sperimentali in questo studio erano conformi agli standard etici di il Comitato Etico medico dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Liaoning.

Consenso alla pubblicazione

Non applicabile.

Interessi conflittuali

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse da rivelare.

Dettagli dell'autore

"Dipartimento di farmacia, Università di medicina tradizionale cinese di Liaoning, Dalian, Liaoning, Cina". Istituto di ricerca sui farmaci del gruppo Monos, Ulaanbaatar 14250, Mongolia.

Ricevuto:31 maggio 2021 Accettato:17 settembre 2021 Pubblicato online: 28 settembre 2021

Zhe Li1, Lkhaasuren Ryenchindorj2, Bonan Liu1, Ji Shi1*, Chao Zhang1, Yue Hua1, Pengpeng Liu1, Guoshun Shan1 e Tianzhu Jia1

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Nota dell'editore

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