Accessibilità della cromatina ed espressione del microRNA nelle cellule progenitrici del nefrone durante lo sviluppo del rene

Per ulteriori informazioni:ali.ma@wecistanche.com

Andrew Cluston^1,2,3, Andrea Bodnar^2,3, Debora Malta Cerqueira^2,3, Yu Leng Phua^2,5,6,Alyssa Lawler^8,9,10, Kristy Boggs⁷, Andreas Pfenning^8,10,Jacqueline Ho^2,3*e Dennis Kostka^1,4*

¹Dipartimento di Biologia dello Sviluppo, Scuola di Medicina dell'Università di Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvania, USA²Rangos Research Center, UPMC Children's Hospital di Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvania, USA³Dipartimento di Pediatria, Divisione di Nefrologia, University of Pittsburgh School of Medicine, PA, USA⁴Department of Computational & Systems Biology e Pittsburgh Center for Evolutionary Biology and Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, USA⁵Divisione di Medicina Genetica e Genomica, Dipartimento di Pediatria, UPMC Children's Hospital di Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA⁶Dipartimento di Patologia, Laboratorio di Genetica Biochimica Clinica, Ospedale pediatrico UPMC di Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA⁷Dipartimento di Pediatria, Divisione di Gastroenterologia, Epatologia e Nutrizione, Scuola di Medicina dell'Università di Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA.⁸Biologia computazionale,⁹Scienze biologiche, e¹⁰Neuroscience Institute, Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, USA

Astratto

I nefroni dei mammiferi provengono da una popolazione dicellule progenitrici del nefronee i cambiamenti nei trascrittomi di queste cellule contribuiscono alla cessazione della nefrogenesi, un importante determinante del numero di nefroni. Per caratterizzare l'espressione di microRNA (miRNA) e identificare presunte regioni regolatorie cis, abbiamo raccolto cellule progenitrici del nefrone dal toporenial giorno embrionale 14,5 e al giorno postnatale zero e saggiata l'espressione di piccolo RNA e la cromatina accessibile alla trasposasi. Abbiamo rilevato l'espressione di 1.104 miRNA (114 con cambiamenti di espressione) e 46.374 regioni accessibili alla cromatina (2.103 con cambiamenti di inaccessibilità). A livello del genoma, i nostri dati evidenziano processi come la differenziazione cellulare, la migrazione cellulare, le interazioni della matrice extracellulare e le vie di segnalazione dello sviluppo. Inoltre, identificano nuovi elementi cis-regolatori candidati per Eya1 e Pax8, entrambi geni con un ruolo nella differenziazione delle cellule progenitrici del nefrone. Infine, associamo i miRNA che cambiano l'espressione, inclusi let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a-2-3p e miR{{ 20}}p, con elementi cis-regolatori candidati e geni bersaglio. Queste analisi evidenziano nuovi presunti loci cis-regolatori per il miRNA nei progenitori del nefrone.

introduzione

L'unità funzionale delreneè il nefrone, che serve a filtrare i rifiuti e mantenere la normale omeostasi di acqua, acido-base ed elettroliti nel corpo. Il numero di nefroni varia ampiamente negli esseri umani (tipicamente tra duecentomila e più di un milione di nefroni (Hughson et al., 2003)) e viene stabilito prima della nascita negli esseri umani (circa il giorno postnatale 2-3 nei topi (Hartman et al. ., 2007; Hinchliffe et al., 1991)). I nefroni non possono rigenerarsi dopo la nascita e la ridotta dotazione di nefroni è associata ad un aumentato rischio di malattie renali croniche e ipertensione (Bertram et al., 2011). Il numero di nefroni, a sua volta, è in gran parte determinato da una popolazione di cellule chiamatecellule progenitrici del nefrone(Cebrian et al., 2014b). Nelle ultime fasi delrenesviluppo, i progenitori del nefrone aumentano la loro propensione a differenziarsi, che gradualmente impoverisce la loro popolazione e segna l'eventuale cessazione della nefrogenesi (Hartman et al., 2007; Rumballe et al., 2011; Volovelsky et al., 2018). La comprensione dei meccanismi che regolano la cessazione della nefrogenesi ha implicazioni significative per la determinazione della dotazione di nefrone e del rischio di successiva malattia renale.

In occasionerenesviluppo, i progenitori Cited1 più /Six2 più nefroni autorinnovanti sono indotti a diventare progenitori Cited1-/Six2 più innescati e successivamente si differenziano in vescicole renali che esprimono Wnt4- in risposta a Wnt9b/ -catenina (McMahon et al., 2016; Rumballe et al., 2011). I cambiamenti trascrizionali intrinseci nei progenitori del nefrone precoci rispetto a quelli tardivi includono geni e percorsi che influenzano l'invecchiamento delle cellule staminali, in particolare mTor e il suo repressore amartin (S. Chen et al., 2015; Volovelsky et al., 2018). In effetti, si pensa che l'hamartin desensibilizzi i progenitori del nefrone ai segnali di auto-rinnovamento e in questo modo contribuisca alla cessazione della nefrogenesi (S. Chen et al., 2015). Coerente con l'idea che i primi progenitori del nefrone abbiano una maggiore tendenza ad auto-rinnovarsi è l'osservazione che l'accessibilità della cromatina è arricchita per i siti di legame dei fattori di trascrizione delle cellule progenitrici del nefrone centrale, inclusi Six2 e Wt1 rispetto ai progenitori del nefrone tardivo (Hilliard et al. , 2019). È stato dimostrato che questi fattori di trascrizione legano sequenze di potenziamento situate in "punti caldi di regolamentazione" nel genoma (O'Brien et al., 2018). L'induzione dei progenitori del nefrone si verifica a causa dell'aumento dei livelli di -catenina, che provocano l'attivazione dei complessi Lef1/Tcf7 su geni pronti per l'attivazione del programma di nefrogenesi (Park et al., 2012), ed è stato suggerito che si complessi con Tcf7l1 e Tcf7l2 per stabilire e mantenere cicli di cromatina regolatori che facilitano l'attivazione genica (Guo et al., 2021).

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Studi recenti hanno implicato i microRNA (miRNA) nella regolazione della cessazione della nefrogenesi. i miRNA sono molecole di RNA corte e non codificanti che prendono di mira le trascrizioni di RNA messaggero (mRNA) per una traduzione ridotta o una maggiore degradazione tramite il complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC) (Bartel, 2009). La proteina Lin28b è un noto repressore della famiglia let-7 dei miRNA (Heo et al., 2008). L'espressione di Lin28b diminuisce nei progenitori del nefrone con il procedere della nefrogenesi e questo coincide con un aumento dell'espressione della famiglia di miRNA let-7 (Yermalovich et al., 2019). Inoltre, l'induzione condizionale dell'espressione di Lin28b nel lignaggio Wt1- provoca la repressione del miRNA let-7, che è sufficiente per prolungare la nefrogenesi (Yermalovich et al., 2019). Non è noto se altri miRNA regolino i tempi della nefrogenesi. Inoltre, mentre sono stati identificati potenziatori che regolano l'espressione di RNA lungo non codificante durante la nefrogenesi (Nishikawa et al., 2019), nessuno ha dimostrato di regolare l'espressione di miRNA nei progenitori del nefrone.

In questo studio, abbiamo cercato di identificare contemporaneamente nuovi miRNA che contribuiscono alla cessazione della nefrogenesi, insieme a potenziali caratteristiche di regolazione cis. Pertanto, per osservare i cambiamenti nell'espressione del miRNA e nell'accessibilità della cromatina tra il giorno embrionale 14.5 (E14.5) e il giorno zero postnatale (P0), abbiamo prodotto set di dati corrispondenti di mRNA-seq e ATAC-seq da primari e non passaticellule progenitrici del nefronein questi due tempi. Abbiamo identificato 114 miRNA che sono espressi in modo differenziale incellule progenitrici del nefronetra questi due punti temporali, nonché 2.103 regioni di mutevole accessibilità della cromatina che chiamiamo regioni ad accesso differenziale (DAR). Le analisi di arricchimento dei bersagli genici previsti di miRNA che cambiano significativamente così come tra le posizioni genomiche dei DAR implicano percorsi che influenzano la differenziazione delle cellule epiteliali, la migrazione cellulare, le interazioni della matrice extracellulare e le principali vie di segnalazione dello sviluppo come Wnt, Notch e TGF-segnalazione . Osserviamo cambiamenti significativi nell'accessibilità nella cromatina e presentiamo più linee di evidenza che implicano due regioni genomiche come potenziatori putativi per i geni Eya1 e Pax8 nelle cellule progenitrici del nefrone. Infine, abbiamo identificato modifiche coerenti dell'accessibilità della cromatina e dell'espressione dei miRNA per 33 coppie di miRNA e DAR, inclusi let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{ {11}}p e miR-9-3p e presentano presunti geni bersaglio espressi nei progenitori del nefrone per miRNA differenzialmente espressi.

Risultati

Isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici del nefrone da E14.5 e P0reni

Cellule progenitrici del nefronesono stati isolati mediante selezione positiva per Itg 8 a E14.5 o a P0 e ogni campione è stato diviso per eseguire mRNA-seq, ATAC-seq e controllo di qualità (Figura supplementare 1 AB). La PCR quantitativa (qRT-PCR) ha confermato che i geni marcatori del progenitore del nefrone Six2 e Cited1 (Huang et al., 2016) sono altamente espressi in campioni isolati del progenitore del nefrone rispetto all'interorene, più dei marcatori per altri tipi cellulari (tra cui gemma ureterale (Caleb) (Cebrian et al., 2{{10}}14a), cellule endoteliali (Pecan) (Kobayashi et al., 2008), stroma renale (Pdgfr) (S. Chen et al., 2015) e vescicola renale (Lhx1) (Brunskill et al., 2014) (Figura supplementare 1 C). Per quanto riguarda il sesso, la lettiera utilizzata per i campioni E14.5 variava da dal 27% al 50% di femmine e le cucciolate per i campioni P0 variavano dal 31% al 75% di femmine. In media, i campioni E14,5 erano per il 38% femmine e i campioni P0 erano per il 49% femmine (Figura supplementare 1 D). Questi invecchiano con attenzione -popolazioni di cellule progenitrici del nefrone abbinate ci hanno permesso di analizzareaccessibilità della cromatinae piccola espressione di RNA nelle stesse fasi di sviluppo in due punti temporali (E14.5 e P0).

I progenitori del nefrone precoci e tardivi hanno profili trascrizionali di miRNA distinti

Il sequenziamento di piccoli RNA ha rilevato 1,104 trascritti di miRNA noti e ha identificato 114 miRNA che mostrano un cambiamento significativo nell'espressione tra i campioni E14.5 e P{{10}} (tasso di falsa scoperta ( FDR)=0.05; tabella supplementare 1). La metà dei miRNA differenzialmente espressi mostra una maggiore espressione a P0 rispetto a E14.5 e l'analisi dei componenti principali evidenzia una maggiore omogeneità nell'espressione di miRNA tra i campioni E14.5 rispetto a P0 (Figura 1A). Il clustering gerarchico rivela un chiaro raggruppamento di miRNA in quelli di espressione crescente e decrescente tra E14.5 e P0, rispettivamente (Figura 1B). I membri della famiglia let-7di miRNA sono tra i miRNA più espressi rilevati e notiamo che tutti i membri della famiglia con cambiamenti significativi mostrano una maggiore espressione a P0 (dati non mostrati). Ciò è in linea con i risultati che mostrano che una riduzione dell'espressione di Lin28b porta a un ampio aumento dell'espressione della famiglia let-7 nel corso della nefrogenesi (Yermalovich et al., 2019). Altri miRNA con un'espressione significativamente più alta a P0 includono miR-429-3p, un membro della famiglia miR-200 noto per influenzare la differenziazione dei podociti (Z. Li et al., 2016) ed entrambi miR{{30 }}a{31}}p e miR-125b-5p. È noto che gli ultimi due di questi reprimono le trascrizioni di Lin28 in diversi ambienti cellulari (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). miRNA con un'espressione significativamente più bassa a P0 include l'angiogenesi- (S. Wang et al., 2008) e la promozione della proliferazione (Schober et al., 2014) miR-126.

Lo strumento DIANA miRPath consente l'analisi del percorso KEGG del miRNA in base ai rispettivi geni target, come previsto da micro T-CDS (Vlachos et al., 2015). Troviamo che i miRNA con i maggiori cambiamenti nell'espressione tra E14.5 e P0 (su o giù) sono quelli che regolano i percorsi con ruoli chiave nella nefrogenesi (Figura 1C, Figura 2 supplementare). Ad esempio, Tgf- viene secreto dalle cellule stromali circostanti per promuovere la differenziazione del progenitore del nefrone (Rowan et al., 2{{50}}18) e notiamo una ridotta espressione tra i miRNA del progenitore del nefrone che prendono di mira gli effettori a valle di il "percorso di segnalazione TGF" (percorso KEGG mmu04350, valore p 1,45e- 6). La "via di segnalazione MAPK" (mmu04010) influenza l'organizzazione e l'adescamento dei progenitori del nefrone per la differenziazione e regola le loro interazioni con la matrice extracellulare (ECM) tramite Itg 8 (Ihermann-Hella et al., 2018). Notiamo un numero significativo di miRNA up-e down-regolati che prendono di mira diversi geni in questa via di segnalazione MAPK (valori p di 3,5e- 6 e 3,0e- 4 rispettivamente per gli elenchi su e giù) . Infine, la via KEGG "Interazione del recettore della matrice extracellulare (ECM)" (mmu04512) è la via più significativamente arricchita identificata e i suoi geni costituenti sono presi di mira in modo molto più significativo dai miRNA che aumentano l'espressione nel tempo (valore p di 7,4e{ {32}} tra i miRNA in aumento rispetto a 1.1e-2 tra i decrescenti). I geni associati all'ECM sono presi di mira da alcuni dei miRNA più espressi e in aumento significativo che rileviamo, inclusi miR-196a-5p, miR-148a{40}}p, miR -125a{42}}p e lascia-7f-5p. In particolare, miR-196a-5p è il miRNA più espresso nei nostri campioni e vede un 8-aumento di volte tra E14,5 e P0. I trascritti genici che erano i bersagli previsti di miRNA (usando TargetScan (Agarwal et al., 2015)) con una maggiore espressione a P0 includono Bach2, un collegamento molecolare proposto tra i percorsi MAPK/AP1 e Six2/-catenina per l'auto-rinnovamento e la differenziazione rispettivamente nei progenitori del nefrone (Hilliard et al., 2019).

Per identificare bersagli putativi di miRNA differenzialmente espressi nei progenitori del nefrone, abbiamo utilizzato l'annotazione computazionale dei miRNA forniti in miRDB (Y. Chen & Wang, 2020) e le interazioni sperimentali annotate miRNA-mRNA dalla base di mortaio (HY Huang et al., 2020), in combinazione con il nostro set di dati di sequenziamento dell'RNA unicellulare E14.5 precedentemente generato (Bais et al., 2020). Pertanto, abbiamo generato un elenco di potenziali interazioni miRNA-mRNA basate sull'espressione differenziale del miR tra E14.5 e P0 nei progenitori del nefrone con un corrispondente cambiamento nell'espressione del gene bersaglio tra progenitori del nefrone autorinnovante e innescato, nonché innescato e differenziare i progenitori del nefrone (Figura 2). La nostra analisi suggerisce che Meis2 e Hmga2 sono potenziali bersagli della famiglia let-7 di miRNA nei progenitori del nefrone (Figura 2), con una ridotta espressione di Meis2 e Hmga2 associata a una maggiore espressione dei membri della famiglia let-7 nel differenziare o invecchiare i progenitori del nefrone. Il fattore di trascrizione Meis2 è fortemente espresso nei progenitori del nefrone e nello stroma renale duranterenesviluppo (Lam et al., 2014), ed è legato alla regolazione della proliferazione cellulare in altri contesti (Abruzzese et al., 2019). Hmga2 è una proteina non istonica che lega la cromatina, è altamente espressa nelle cellule staminali ed è stata associata a una varietà di tumori mesenchimali (Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014). Allo stesso modo, c'è un'espressione Jag1 crescente associata all'espressione decrescente di miR-34b-5p, miR-983p e miR-200a{11}}p nella differenziazione o l'invecchiamento dei progenitori del nefrone (Figura 2). Jag1 è un ligando chiave nella segnalazione di Notch la cui espressione aumenta man mano che i progenitori del nefrone si differenziano (Chung et al., 2016). Tutti i bersagli miRNA previsti o annotati per geni con cambiamenti di espressione tra progenitori nefroni autorinnovanti, innescati e differenzianti sono disponibili in Supplemental.

Figura 1. Cambiamenti sostanziali nell'espressione del miRNA tra E14.5 e P0 progenitori del nefrone. A) L'analisi delle componenti principali mostra che il punto temporale dello sviluppo è un importante contributo alla variazione dell'espressione del miRNA. B) Heatmap raffigurante l'espressione relativa di tutti i miRNA che cambiano significativamente. Le colonne contenenti campioni E14.5 a sinistra sono annotate in verde chiaro e le colonne con campioni P0 a destra sono annotate in verde scuro. C) Arricchimento di geni da specifici percorsi KEGG tra target genici previsti di miRNA up-e down-regolati (barre rosse e blu, rispettivamente). Il valore p minimo incluso è 1e-5.

Figura 2. Interazioni miRNA-mRNA con un possibile ruolo nell'invecchiamento e nella differenziazione delle cellule progenitrici del nefrone. Sono visualizzati miRNA (cerchi) e mRNA (quadrati). I miRNA con un'espressione aumentata tra E14.5 e P0 sono mostrati in rosso, i miRNA che diminuiscono sono mostrati in blu. Geni target annotati (da mirDB e mir TarBase) con un'espressione crescente tra auto-rinnovamento, innescato o differenziantecellule progenitrici del nefrone(Bais et al., 2020) sono mostrati in rosso, mRNA con espressione decrescente in blu. I bordi di mirDB e mirTarDB che non sono coerenti con le modifiche all'espressione osservate sono stati omessi ma sono inclusi nella tabella supplementare 2.

I progenitori del nefrone precoci e tardivi hanno ambienti di cromatina distinti

I dati ATAC-seq dei progenitori del nefrone E14.5 e P0 ci hanno permesso di identificare 46.374 regioni di cromatina accessibile (con un tasso di scoperta irriducibile (Boleu et al., 2015) soglia di {{ 22}}.1, vedere (Figura supplementare 3 C, Tabella supplementare 3), combinata tra campioni e punti temporali. Notiamo che i nostri dati sono conformi alle linee guida ATAC-seq del progetto ENCODE (ENCODE, nd) (Figura supplementare 3 A, B) e che osserviamo un aumento dei tassi di conservazione tra i picchi IDR rispetto a quelli osservati nei controlli randomizzati (Figura supplementare 3 D). Tra gli IDR che riportiamo, 3.576 contengono potenziatori documentati nel VISTA (Visel et al., 2007) e/o FANTOM5 (de Rie et al., 2017) database di potenziatori e 13.495 contengono sequenze di DNA con ruoli regolatori previsti in almeno un tessuto murino o tipo cellulare secondo EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

L'analisi delle componenti principali (aggiustata per le differenze di sesso tra i campioni) ha rivelato un chiaro raggruppamento di campioni per punto temporale dello sviluppo (Figura 3A). Per identificare i loci genomici con cambiamenti nell'accessibilità della cromatina, abbiamo confrontato il segnale ATAC-seq tra i campioni E14.5 e P0. Abbiamo osservato 2,103 DAR, controllando il FDR all'10 percento . Di questi 1.323 (55%) hanno mostrato una maggiore accessibilità a P0 rispetto a E14.5 e il clustering gerarchico ha rivelato una chiara distinzione tra DAR che si aprono e chiudono rispettivamente tra E14.5 e P0 (Figura 3B).

Le impronte dei fattori di trascrizione sono state identificate utilizzando HINT e abbinate alle proteine ​​​​leganti il ​​DNA utilizzando motivi del database HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018). Tra i 431 motivi testati, i DAR contenenti impronte per diverse proteine ​​del fattore di trascrizione associate alla nefrogenesi mostrano un aumento dell'accessibilità tra E14.5 e P{7}}. Tra le impronte che risiedono nei DAR che aumentano in media l'accessibilità, le prime sei appartengono alle impronte dei fattori di trascrizione abbinate a Pax8 (0}}.15), Six2 ({15}}.14), Cebpd (0.13), Six4 (0.13), Jun (0.12) e Fos (0.11). Le impronte annotate nei DAR di chiusura includono i fattori di trascrizione E2F2 ed E2F4, che sono noti per influenzare la progressione del ciclo cellulare (Gaudet et al., 2011) e per promuovere la proliferazione cellulare (D. Wang et al., 2000) in altri contesti cellulari (Figura supplementare 4).

Per valutare il contesto biologico di apertura e chiusura dei DAR, abbiamo utilizzato il Genomic Regions Enrichment of Annotations Tool (GREAT) (McLean et al., 2010) per evidenziare i set di geni con l'arricchimento delle regioni di cromatina mutevoli associate. Con questo approccio, identifichiamo i processi biologici di Gene Ontology (GO) strettamente legati allo sviluppo del progenitore del nefrone: in particolare, il processo più arricchito tra i DAR di apertura è "Regulation of epithelial cell differenziation" (GO:0030856, Binomial Q-value {{3 }}.5e-5) e "Regolazione positiva della differenziazione delle cellule epiteliali" (GO:0030858, valore Q binomiale=5e{9}}) è tra i primi 10 più significativamente arricchiti ( Figura supplementare 5). Entrambi sono coerenti con un aumento della propensione dei progenitori del nefrone a subire transizioni mesenchimali-epiteliali (MET) mentre si differenziano (S. Chen et al., 2015). Altri percorsi significativamente arricchiti includono "Regolazione positiva del percorso di segnalazione di Notch" (GO:0045747, valore Q binomiale=2e{18}}), che è coerente con il ruolo svolto dalla segnalazione di Notch nel promuovere la differenziazione del progenitore del nefrone ( Chung et al., 2016). I 10.083 DAR di chiusura rilevati non hanno rivelato termini GO significativi in ​​base ai criteri di significatività predefiniti di GREAT (vedere Figura 5 supplementare).

Figura 3. Le differenze nell'accessibilità della cromatina caratterizzano E14.5 rispetto a P0cellule progenitrici del nefrone.A) L'analisi delle componenti principali dei campioni ATAC-seq evidenzia i punti temporali dello sviluppo come una delle principali fonti di variazione. B) Heatmap che mostra le regioni IDR che cambiano in modo significativo tra i campioni ATAC-seq. I campioni/colonne E14.5 sono annotati in verde chiaro e i campioni/colonne P0 sono annotati in verde scuro. C) GO Termini del processo biologico arricchiti per le regioni genomiche che si aprono tra E14.5 e P0 secondo GREAT, classificate per valore P binomiale, FDR Minore o uguale a 0.001.

Successivamente, abbiamo esploratoaccessibilità della cromatinain regioni del genoma contenenti promotori e potenziatori di geni con ruoli pubblicati nella differenziazione delle cellule progenitrici del nefrone. Tra questi, il fattore di trascrizione Six2 è fondamentale per mantenere la multipotenza dicellule progenitrici del nefrone(Self et al., 2006) e in tutti i campioni abbiamo osservato la cromatina accessibile che circonda il suo promotore e un noto potenziatore Six2 ~ 50kb a monte del sito di inizio della trascrizione Six2 (TSS) (O'Brien et al., 2018) (Figura 4A, B, aree ombreggiate in blu). Notiamo anche regioni di cromatina accessibile sul promotore e un potenziatore pubblicato per la proteina Gdnf (Figura 4D, E), che è secreta dai progenitori del nefrone per promuovere la ramificazione delle gemme ureteriche (Sanchez et al., 1996; Vega et al., 1996 ). Questo potenziatore si trova a circa 113kb a monte del promotore del gene ed è noto per essere sensibile alla segnalazione di Wnt nel contesto dello sviluppo di progenitori del nefrone (Park et al., 2012). Sebbene il promotore per Gdnf non cambi in modo significativo nel tempo, il potenziatore annotato aumenta significativamente l'inaccessibilità. Notiamo anche regioni di cromatina accessibile che circondano un potenziatore pubblicato attivo nei progenitori del nefrone per Eya1 situato a ~ 325 kb a monte del TSS del gene (Park et al., 2012) (Figura 6 supplementare). Eya1 è un fattore di trascrizione che interagisce con Six2 per mantenere la multipotenza del progenitore del nefrone (J. Xu et al., 2014).

Osserviamo diversi DAR che non si sovrappongono a caratteristiche normative note ma comprendono regioni che si prevede abbiano attività potenziatore per geni specifici in una varietà di tipi di cellule di topo, come annotato in EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020). Oltre al potenziatore pubblicato di Eya1 (Park et al., 2012) (Figura 6 supplementare), un DAR di chiusura in uno degli introni di Eya1 (Figura 5A-B) comprende una regione che si prevede abbia attività potenziatore sul gene Eya1 nel topo progenitore neurale e cellule progenitrici di granulociti-monociti (Gao & Qian, 2020). In linea con una riduzione dell'attività del potenziatore, abbiamo precedentemente osservato che l'espressione di Eya1 è ridotta nel differenziare i progenitori del nefrone utilizzando i dati scRNA-seq E14.5 (Figura supplementare 7) (Bais et al., 2020). Ciò è coerente con i dati ChIP-seq pubblicati nei progenitori del nefrone E16.5 primari che mostrano una mancanza del segno di potenziamento attivo, H3K27ac, e una mancanza di legame da Ctnnb1, Lef1, Six2 e Tcf7 (Figura 5) (Guo et al ., 2021). Questo potenziale potenziatore contiene anche impronte del fattore di trascrizione per Hoxd10 all'interno del suo picco, un fattore di trascrizione essenziale per la differenziazione e l'integrazione dei progenitori del nefrone durante le transizioni mesenchimali-epiteliali (MET) (Yallowitz et al., 2011).

Un DAR che aumenta l'inaccessibilità sul cromosoma 24 si sovrappone a una regione della cromatina con attività potenziatrice prevista per il fattore di trascrizione Pax8 in cellule coltivate da rene di topo, epiteli intestinali e utero (Gao & Qian, 2020). Pax8 è parzialmente ridondante con Pax2, ma almeno uno di questi due fattori di trascrizione è richiesto nei progenitori del nefrone perrenesviluppo (Bouchard et al., 2002; Narlis et al., 2007). In precedenza abbiamo osservato che l'espressione di Pax8 aumenta nella differenziazione e differenziazione dei progenitori del nefrone (Figura supplementare 7) e notiamo un aumento significativo dell'accessibilità in un DAR che comprende questa caratteristica normativa. Questa regione è anche associata a un segno di potenziamento attivo, H3K27ac, e al legame di Ctnnb1, Lef1, Six2 e Tcf7 nei dati ChIP-seq pubblicati dai progenitori primari del nefrone E16.5 (Figura 5) (Guo et al., 2021). Osserviamo una serie di impronte di fattori di trascrizione che rientrano nel picco di accessibilità altamente conservato di questo DAR, di cui due per Sall1, un fattore nucleare noto per influenzare la nefrogenesi (Kanda et al., 2014) e sette impronte strettamente raggruppate per dito di zinco associato a MYC proteina (Maz), un fattore di trascrizione che ha dimostrato di avere effetti dipendenti dal dosaggio surenesviluppo nell'uomo e nei topi (Haller et al., 2018). La tabella supplementare 3 contiene un elenco completo delle regioni accessibili che troviamo, nonché le rispettive statistiche di accessibilità differenziale, annotazioni per geni, esoni e promotori che si sovrappongono ed elenchi di impronte chiave del fattore di trascrizione legate alla nefrogenesi identificate.

Figura 4. Profili ATAC-seq in loci normativi noti e presunti. Per ogni pannello dall'alto verso il basso, le sfaccettature indicano l'arricchimento della piega diaccessibilità della cromatinanei campioni E14.5 e P0, con IDR e DAR identificati come evidenziazioni in blu (IDR immutabile) e verde (DAR di apertura). e rosso (DAR di chiusura). La seguente sfaccettatura descrive le annotazioni dei geni, le posizioni nucleosomiali (grigie) e le regioni prive di nucleosomi (rosse) misurate nei campioni E14.5 e P0 raggruppati e i punteggi di conservazione PhastCon60 (il nero indica 1{{ 12}}0% di conservazione, bianco 0% di conservazione A) Promotore e corpo genico del fattore di trascrizione Six2. B) Enhancer for Six2 edito da Park et. al. C) Potenziatore differenzialmente accessibile per Gdnf con maggiore accessibilità a P0. D) Promotore per Gdnf.

Figura 5. I DAR si sovrappongono a potenziali nuovi potenziatori per i geni legati alla nefrogenesi. A e C) I pannelli raffigurano una mappa della regione di 1 MB che circonda un gene di interesse, con geni codificanti proteine ​​in verde e l'interazione potenziatore/promotore proposta come un anello nero . B e D) Dall'alto verso il basso, i pannelli raffigurano l'arricchimento della piegaaccessibilità della cromatinamisurato nei campioni E14.5 e P0, con IDR evidenziati in verde (apertura) e rosso (chiusura), seguiti da misurazioni ChIP-seq in queste regioni misurate da Guo et. al. nel progenitore del nefrone primariocellule(Guo et al., 2021). Il terzo pannello raffigura le annotazioni geniche (blu) e gli elementi normativi previsti da Enhancer Atlas 2.0 (rosso) e il quarto pannello indica le impronte dei fattori di trascrizione identificate nei dati ATAC-seq. Il quinto pannello raffigura nucleosomi (grigio) e NFR (rosso) e il pannello inferiore indica la conservazione. A) Regione da 1 MB contenente il corpo del gene per Eya1 e un potenziale potenziatore Eya1 di circa 325 kb a monte. B) Una regione di 4,5 kb contenente il potenziale potenziatore Eya1. C) Regione da 1 MB contenente il locus del gene Pax8 e un potenziatore previsto. D) Una regione di 4,5 kb contenente l'enhancer previsto e il suo DAR sovrapposto.

I domini topologicamente associati aiutano a identificare potenziali relazioni potenziatore-miRNA

I domini topologicamente associati (TAD) sono regioni su scala megabase dell'organizzazione della cromatina di ordine superiore che risultano dall'impacchettamento della cromatina nel nucleo nello spazio tridimensionale (Dixon et al., 2012) e le interazioni potenziatore-promotore sono in genere limitate a elementi all'interno dello stesso TAD (Symmons et al., 2014). Abbiamo approssimato i TAD dai progenitori del nefrone utilizzando annotazioni generate da cellule staminali embrionali di topo (ESC) (Y. Wang et al., 2018). Per selezionare possibili regioni regolatrici cis di miRNA, abbiamo correlato i cambiamentiaccessibilità della cromatinacon miRNA differenzialmente espresso all'interno della stessa TAD. Complessivamente, 42.778 regioni accessibili uniche (circa il 92%) si trovano all'interno di TAD annotati e di queste 30626 (circa il 72%) non si sovrappongono a un promotore noto. Ciò include 2.103 DAR, rispettivamente con 1.180 e 923 di apertura e chiusura nel tempo. Quindici DAR di apertura condividono un TAD con uno o più miRNA con un'espressione aumentata tra E14.5 e P0 e nove DAR di chiusura condividono un TAD con uno o più miRNA con espressione ridotta. La Figura 6 riassume questo approccio e illustra le distanze tra i DAR e il loro miRNA abbinato, che vanno da 27 kb a oltre 1 mb (media: 447 kb). La tabella 1 dettaglia gli insiemi di possibili relazioni DAR - miRNA, con un DAR elencato per miRNA abbinato.

Tra le coppie di miRNA-enhancer annotate, ne notiamo tre di particolare interesse. Innanzitutto, è stato identificato un DAR di apertura 120 kb a valle di let-7c-5p e 73 kb a valle di miR-125b-5p, che è associato a un Six2 sito di legame in un set di dati ChIP-seq del progenitore del nefrone E16.5 precedentemente pubblicato (Figura 7A) (Guo et al., 2021). Let-7c-5p è uno dei miRNA let-7 più espressi che rileviamo ed è noto che la famiglia let-7 reprime anche le trascrizioni Lin28b (Slack e Ruvkun, 1997; Zhu et al., 2011). Notiamo che Hmga2 e Meis2 sono anche identificati come potenziali nuovi bersagli della famiglia let-7 nei progenitori del nefrone (Figura 2). miR-125b-5p ha anche dimostrato di reprimere le trascrizioni di Lin28 nei tipi di cellule ematopoietiche e progenitrici di topo (Chaudhuri et al., 2012). In secondo luogo, miR-9-3p è il complemento inverso di miR-9-5p, un miRNA che ha recentemente dimostrato di proteggere darenefibrosi prendendo di mira le vie metaboliche (Fierro-Fernández et al., 2020). Rileviamo una diminuzione maggiore di 10-volte nei trascritti miR-9-3p tra i progenitori del nefrone E14.5 e P0 e abbiamo identificato un potenziale elemento di regolazione a circa 249 kb di distanza (Figura 7B). Osserviamo le impronte dei fattori di trascrizione per Snai1 e Snai2 nel DAR associato, che hanno dimostrato di promuovere transizioni epiteliali-mesenchimali (EMT) (Sundararajan et al., 2019). Infine, abbiamo abbinato miR-181a-2-3p a un possibile locus cis-regolatorio intergenico 131kb a monte sul cromosoma 2, dove notiamo un'impronta del fattore di trascrizione per il fattore di trascrizione Wt1, un regolatore chiave del progenitore del nefrone sopravvivenza (Kreidberg et al., 1993) e legame Six2 in un set di dati ChIP-seq del progenitore del nefrone E16.5 pubblicato (Figura 7C)) (Guo et al., 2021).

Tabella 1. Modifiche all'espressione del miRNA, abbinate a uno o più DAR nello stesso TAD.

Figura 6. Trovare coppie candidate enhancer-target-miRNA. A) Diagramma di flusso che denota come le regioni di accessibilità sono state prioritarie per la possibile regolazione dell'espressione di miRNA. B) Posizioni genomiche di ciascun miRNA schermato rispetto al loro potenziatore candidato (striscia verticale arancione). La scala del loro cambiamento di piega log2 è mostrata sull'asse y e i miRNA con espressione crescente o decrescente sono evidenziati rispettivamente in verde e rosso.

Figura 7. Quattro potenziali coppie di miRNA potenziatore-target. I TAD sono evidenziati in grigio, allineati in base ai punti di partenza e disegnati nella stessa scala per illustrare la dimensione relativa. I geni noti di Ensembl sono mostrati in viola e le regioni più scure indicano gli esoni. L'accessibilità relativa a E14.5 e P0 è mostrata come grafici a barre sopra e sotto la linea nera orizzontale, rispettivamente, così come in grafici inset che illustrano il pileup nel DAR specificato insieme ai dati ChIP-seq pubblicati da Guo et . al. (Guo et al., 2021). Le impronte dei fattori di trascrizione identificate da SUGGERIMENTO sono elencate in banner arancioni. I grafici a barre in pannelli separati a destra indicano l'espressione di miRNA (verde) e gli eventi di inserimento di Tn5 normalizzati nelle regioni potenziatrici proposte (arancione). A) Il membro della famiglia let-7 let-7c-5p è molto espresso incellule progenitrici del nefroneed è abbinato al "picco{0}}" a 119kb di distanza in una regione intergenica. B) miR-9-3p è abbinato a un DAR a 249kb di distanza. C) miR-181a 2-3p si trova a 131kb di distanza dal "picco_5887", un possibile potenziatore intergenico.

Discussione

In questo studio, abbiamo cercato di identificare contemporaneamente nuovi miRNA che contribuiscono alla cessazione della nefrogenesi, insieme a potenziali caratteristiche di regolazione cis. Abbiamo identificato 114 miRNA che sono espressi in modo differenziale nelle cellule progenitrici del nefrone, nonché 2,103 DAR, in E14.5 rispetto a P0reni. Osserviamo molteplici caratteristiche che predicono nuovi presunti potenziatori per i geni Eya1 e Pax8 incellule progenitrici del nefrone. Infine, abbiamo identificato coerenteaccessibilità della cromatinae le modifiche all'espressione di miRNA per 33 coppie di miRNA e DAR, inclusi let-7-5p, miR-125b-5p, miR-181a{5}}p e miR-9-3p e presentano presunti geni bersaglio espressi nei progenitori del nefrone per miRNA differenzialmente espressi. Insieme, i nostri dati dimostrano che i cambiamenti intrinseci ai progenitori del nefrone e dipendenti dallo stadio della nefrogenesi si riflettono nell'ambiente della cromatina della cellula progenitrice e nel suo trascrittoma di miRNA.

Tra i cambiamenti che osserviamo nel trascrittoma del miRNA progenitore del nefrone, notiamo ampi aumenti dell'espressione nella famiglia let{{0}} quando i progenitori invecchiano. Ciò è coerente con i rapporti precedenti: la proteina Lin28b e la famiglia let-7 di miRNA sono reciprocamente antagoniste e formano un interruttore bistabile che governa l'espressione let-7 nei mammiferi (Zhu et al., 2011) e in progenitori del nefrone, il passaggio verso una maggiore espressione let-7 influisce direttamente sui tempi della cessazione della nefrogenesi (Yermalovich et al., 2019). Osserviamo anche una maggiore espressione di miR-125b-5p, noto anche per reprimere l'espressione di Lin28b in altri contesti cellulari (Chaudhuri et al., 2012; Potenza et al., 2017). La famiglia let-7 e il miR-125b-5p sono tra i 114 miRNA espressi in modo differenziale tra E14.5 e P0 nei progenitori del nefrone, il che suggerisce il ruolo dei miRNA nello sviluppo del progenitore del nefrone non si limita a lasciare-7/Lin28b. Ad esempio, i miRNA che diminuiscono nell'espressione includono due membri della famiglia miR-200, che è stato segnalato per svolgere un ruolo nella differenziazione dei podociti (Z. Li et al., 2016):miR-200b -3p e miR-429-3p. Più avanti, osserviamo una diminuzione dell'espressione di miR-126a 5p, noto per promuovere la vasculogenesi (Schober et al., 2014; S. Wang et al., 2008). Ciò può riflettere il lignaggio mesenchimale comune dei progenitori vasculogenici e del nefrone e l'impegno di un sottoinsieme di queste cellule a diventare progenitori del nefrone.

Le analisi del percorso dei bersagli genici previsti per la modifica dei miRNA utilizzando DIANA miRPath (Vlachos et al., 2015) mostrano l'arricchimento della segnalazione MAPK e TGF, entrambi regolatori chiave dei progenitori del nefrone (Hilliard et al., 2019; Ihermann-Hella et al., 2018 ). Diversi altri percorsi KEGG sono anche sovrarappresentati tra i bersagli genici previsti di miRNA sovraregolati, compresi i percorsi relativi alla matrice extracellulare, al citoscheletro di actina e all'adesione focale: tutti gli aspetti cruciali della migrazione cellulare, differenziazione, ramificazione, attaccamento, polarizzazione e proliferazione (Rozario & Desimone, 2010). I geni associati all'ECM sono presi di mira da alcuni dei miRNA più espressi e in aumento significativo che rileviamo, incluso il trascritto più espresso che rileviamo: miR-196a-5p. è noto che miR-196a-5p prende di mira Col1a1, Col1a2 e Col3a1, geni che sono sovraregolati nei progenitori del nefrone carenti di Pax2-che subiscono la transdifferenziazione nello stroma renale (Naiman et al., 2017). Pertanto, l'aumento dell'espressione miR-196a{22}}può avere un ruolo nel rafforzare i confini del lignaggio quando i progenitori invecchiano. Inoltre, identifichiamo nuove potenziali interazioni target miRNA-mRNA che possono contribuire alla cessazione della nefrogenesi, inclusa l'up-regolazione della famiglia let-7 che può colpire Hmga2 e Meis2 (associata alla proliferazione cellulare) (Abruzzese et al ., 2019; Fusco & Fedele, 2007; Lam et al., 2014; Mugford et al., 2009) poiché i progenitori del nefrone invecchiano. Hmga2 non ha alcun ruolo noto inrenesviluppo. Tuttavia, si ritiene che Meis2 abbia una sovrapposizione funzionale con il relativo fattore di trascrizione Meis1, noto per essere richiesto per lo sviluppo del rene (Hisa et al., 2004). Osserviamo anche la down-regulation dei miR (miR-34b-5p, miR-983p e miR-200a-3p) che possono avere come target Jag1, noto per essere sovraregolato e importante nella differenziazione del nefrone (Chung et al., 2016).

Insieme al cambiamento del trascrittoma del miRNA, abbiamo misurato simultaneamente i cambiamenti nell'ambiente della cromatina della cellula progenitrice del nefrone tra E14.5 e P0. Descriviamo due presunti nuovi potenziatori per Eya1 e Pax8, basati su (i) la loro vicinanza a questi promotori genici, (ii) i rispettivi cambiamenti inaccessibilità della cromatinadurante lo sviluppo essendo in linea con i cambiamenti dell'espressione genica pseudotemporale durante la differenziazione, (iii) impronte direnefattori di trascrizione dello sviluppo, (iv) conservazione della sequenza, (v) evidenza della funzione potenziatore in altri tessuti/tipi cellulari da Enhancer Atlas2.0 (Gao & Qian, 2020) e (vi) dati ChIP-seq in E16 .5 progenitori del nefrone per un segno di potenziatori attivi (H3K27ac) e legame del fattore di trascrizione di Ctnnb1, Lef1, Six2 e Tcf7. Osserviamo una diminuzione dell'accessibilità della cromatina per l'enhancer Eya1, che è coerente con il ruolo di Eya1 nella promozione della multipotenza del progenitore del nefrone e con segnalazioni che la perdita di Eya1 provoca l'epitelizzazione precoce della popolazione del progenitore (J. Xu et al., 2014; PX Xu et al., 1999). Pax8 e il suo omologo Pax2 contribuiscono alla specifica del lignaggio dei progenitori del nefrone (Bouchard et al., 2002) e i progenitori del nefrone senza almeno uno di questi geni non saranno sottoposti a MET (Narlis et al., 2007). L'aumentata accessibilità della cromatina che rileviamo per il presunto potenziatore Pax8 è coerente con una maggiore espressione di Pax8 negli epiteli renali quando i nefroni si differenziano.

L'analisi dell'arricchimento (McLean et al., 2010) dei DAR ha rivelato "Regulation of Epithelial Differentiation" come il termine più significativamente arricchito tra le regioni di apertura della cromatina, indicando che i DAR che rileviamo possono contenere caratteristiche regolatorie che guidano o rispondono ai segnali per la differenziazione e lo sviluppo dicellule progenitrici del nefronenei tipi di cellule epiteliali. La segnalazione di notch è tra i termini GO più significativamente arricchiti identificati tra i DAR di apertura e, nei progenitori del nefrone, questo percorso è noto per reprimere l'espressione Six2 e promuovere la differenziazione delle cellule progenitrici del nefrone (Chung et al., 2016). Tra i geni implicati in questo percorso c'è Jag1, un ligando chiave nella segnalazione di Notch la cui espressione è stata segnalata per essere inversamente correlata con l'espressione di Six2 e Hes1 (Chung et al., 2016). Notiamo che Jag1 è un target annotato per tre miRNA con espressione crescente (miR34b-5p, miR98-3p e miR200a-3p, Figura 2). Infine, osserviamo l'arricchimento per i geni associati al rimodellamento e alla morfogenesi dei vasi sanguigni nell'apertura dei DAR, sebbene ciò sembri essere una conseguenza dei geni condivisi tra questi percorsi di sviluppo e la differenziazione delle cellule epiteliali, inclusi Jag1, Eya1, Hes1, Foxc1 e Hey2.

Cambia inaccessibilità della cromatinafracellule progenitrici del nefronesono stati misurati in studi precedenti (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019).

Nel complesso, i nostri risultati sono coerenti con questi studi precedenti, mettendo in evidenza i geni correlati a Notchsignaling e Pax8-. In particolare, tuttavia, ci sono alcune differenze sperimentali in questi studi precedenti rispetto a questo rapporto. L'isolamento dei progenitori del nefrone che esprimono GFP utilizzando una cellula attivata dalla fluorescenza dal topo reporter del transgene Six2- TGC è potenzialmente confuso dalla scoperta che questo allele ha una diminuzione segnalata del numero di nefroni di circa il 45 percento (Hilliard et al. , 2019; Volovelsky et al., 2018). Inoltre, è stato dimostrato che i progenitori del nefrone in coltura (cresciuti con CHIR a basse o alte dosi) hanno trascrittomi distinti dai progenitori primari del nefrone, suggerendo che anche la loro accessibilità alla cromatina sarebbe diversa (Guo et al., 2021; Hilliard et al., 2019). Poiché l'obiettivo del nostro studio era capire in che modo i cambiamenti nel paesaggio della cromatina influiscono sull'espressione del miRNA nei progenitori del nefrone precoci rispetto a quelli tardivi, era necessaria l'analisi dei progenitori primari del nefrone.

Cistanche è migliore per i reni

Combinando questi cambiamenti osservati nell'ambiente della cromatina con i cambiamenti corrispondenti nell'espressione del miRNA, implichiamo diverse nuove coppie putative miRNA-enhancer nella cessazione della nefrogenesi per ulteriori studi. I miRNA miR-125a-5p e let-7c-5p, ad esempio, vedono un aumento significativo dell'espressione tra E14.5 e P0 , e questo è ricapitolato dalla crescente inaccessibilità di un DAR (chr16:77,719,058 77,720,407) nello stesso TAD. Questo DAR è anche associato a un sito di legame Six2 (Guo et al., 2021) e può denotare un potenziatore che influisce sull'espressione di miR-125a-5p e/o let{{18} }c-5p, che a sua volta potrebbe promuovere la differenziazione attraverso la repressione di Lin28b. Allo stesso modo, osserviamo un possibile potenziatore per miR 181a, che è noto per modulare l'espressione della renina nell'uomo (Marques et al., 2015) ed è stato considerato un bersaglio terapeutico per ridurre la nefrotossicità grazie alla sua capacità di reprimere BIRC6 e apoptosi (Liu et al., 2018). Infine, osserviamo un DAR di chiusura associato a miR-9-3p che ha impronte del fattore di trascrizione per le proteine ​​sensibili alla segnalazione Wnt Snai1 e il complemento inverso di Snai2.miR-9-3p, miR-9-5p, è noto per proteggersi darenefibrosi (Fierro-Fernández et al., 2020), Snai1 e Snai2 hanno dimostrato di promuovere metastasi da carcinoma nelle cellule tumorali della pelle del topo (Olmeda et al., 2008) e di promuovere transizioni epiteliali-mesenchimali (EMT) nei pazienti oncologici (Sundararajan et al., 2019), mentre miR-9 è noto per promuovere l'angiogenesi e la migrazione delle cellule endoteliali tumorali (Zhuang et al., 2012). Potrebbe esistere un meccanismo in cui una maggiore segnalazione di Wnt si traduce in una ridotta espressione di Snai1 e Snai2, che a sua volta riduce l'espressione di miR-9-3p per supportare la differenziazione del progenitore del nefrone.

Il nostro studio ha identificato in modo completo i cambiamenti nel paesaggio della cromatina e nel trascrittoma del miRNA dei progenitori del nefrone durante lo sviluppo embrionale e abbiamo identificato le regioni cis-regolatorie candidate e il miRNA che possono svolgere un ruolo nella cessazione della nefrogenesi. Le analisi di arricchimento per entrambi i dati mRNA-seq e ATAC-seq forniscono indizi allettanti sui meccanismi che possono essere coinvolti, come i percorsi che regolano la differenziazione del progenitore del nefrone, inclusi Notch e TGF-. Riportiamo anche due nuovi presunti elementi regolatori per Eya1 e Pax8, geni noti per essere importanti inrenesviluppo e potenziali sequenze regolatorie per i miRNA chiave che sono implicati nella cessazione della nefrogenesi.

Metodi

Ceppi di topo

Le femmine gravide accoppiate nel tempo con CD di tipo selvatico-1 sono state ottenute da Charles River Laboratories, Inc. (Wilmington, MA, USA, RRID: MGI:5659424) erenisono stati raccolti dalle cucciolate al giorno embrionale E14.5 o P0. Tutti gli animali sono stati ospitati nel vivaio presso il Rangos Research Center presso l'UPMC Children's Hospital di Pittsburgh (Pittsburgh, PA, USA) e tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le politiche dell'Institutional Animal Care and Use Committee dell'Università di Pittsburgh. Il sesso di ciascun embrione o cucciolo è stato identificato eseguendo la PCR sul DNA genomico isolato dai ritagli di coda utilizzando i seguenti primer per il gene del cromosoma Y Sry: SryF 5'-GATGATTTGAGTGGAAATGTGAGGTA-3' e SryR 5'-CTTATGTTTATAGGCATGCACCATGTA-3', come precedentemente pubblicato (McFarlane et al., 2013).

Sequenziamento e analisi di piccoli RNA

RNA totale isolato dalcellule progenitrici del nefronerimanenti dopo aver rimosso la frazione cellulare ATAC-seq è stata inviata all'Health Sciences Sequencing Core presso l'UPMC Children's Hospital di Pittsburgh per la preparazione della libreria utilizzando il kit di preparazione della libreria del miRNA QIAseq (Qiagen 3315{{1{18}}}}2). Il sequenziamento single-end delle librerie di mRNA-seq è stato eseguito su Illumina NextSeq500 e le librerie sono state sequenziate a una profondità di circa 50 milioni di letture single-ended per libreria. Le letture sequenziate sono state quindi allineate al genoma mm10 del mouse utilizzando il pacchetto Rsubread (Liao et al., 2019) (versione 2.0.1) e annotate al miRNA noto elencato in miRBase (versione 22) (Kozomara & Griffiths-Jones, 2014) con la funzione featureCounts del pacchetto Rsubread. L'espressione differenziale del miRNA noto è stata misurata utilizzando il pacchetto DESeq2 R (versione 1.26.0) (Love et al., 2014). La frazione di letture allineate annotate su miRNA noto e la frazione di embrioni femminili per campione sono state incluse come cofattori nel modello di test presentato a DESeq2. I miRNA espressi differenzialmente sono stati quindi identificati controllando il tasso di falsa scoperta al 5 percento e la loro direzione di cambiamento (aumento rispetto a diminuzione) è stata determinata in base al loro valore di cambiamento di piega ("crescente" che indica un'espressione più elevata a P0 rispetto a E14.5) . L'arricchimento dei percorsi regolatori tra i bersagli genici previsti di miRNA con un'espressione significativamente crescente e decrescente è stato calcolato utilizzando gli strumenti DIANA miRPath versione 3.0 (Vlachos et al., 2015). Le trascrizioni target previste per miRNA sono state recuperate dai repository TargetScan (Agarwal et al., 2015) e miRDB (Y. Chen & Wang, 2020).

Isolamento del progenitore del nefrone

Renisono stati sezionati da cucciolate di {{0}} embrioni E14.5 o cuccioli P0 e ogni cucciolata è stata considerata un campione. Un rene per campione è stato utilizzato per l'isolamento totale dell'RNA da utilizzare come "controllo del rene intero" nelle analisi successive (vedi sotto). Un totale di tre campioni sono stati raccolti in ogni momento. Le cellule corticali sono state quindi isolate da ciascun campione utilizzando l'ordinamento cellulare attivato magneticamente (MACS) come precedentemente pubblicato (Brown et al., 2011). In breve, i reni sono stati sottoposti a digestione parziale con collagenasi A 2 mM (Roche 11088793001) e pancreatina 3,5 mM (Sigma P1625) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 15 minuti a 37 gradi. La reazione di digestione è stata interrotta utilizzando siero bovino fetale freddo al 100% (FBS) e la sospensione cellulare è stata raccolta e risospesa in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) fredda con inibitore della proteasi di fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) 1 mM (Sigma-Aldrich 10837091001). Le cellule sono state lavate e risospese in un tampone di isolamento ghiacciato costituito da FBS al 2% in PBS, quindi incubate con perline magnetiche (kit Dynabeads FlowComp Flexi, ThermoFisher 11061D) biotinilate ad anticorpi per Integrina alfa 8 (Itg 8, R&D Systems AF4076) utilizzando il kit di etichettatura delle proteine ​​​​della biotina DSB-X (ThermoFisher D-20655). I progenitori del nefrone legati a queste sfere sono stati isolati come precedentemente pubblicato (Hemker et al., 2020) e raggruppati tra i reni per ciascun campione. Un'aliquota di 50,{29}} cellule progenitrici del nefrone è stata immediatamente elaborata attraverso ilaccessibilità della cromatinaprotocollo di preparazione della libreria (vedi sotto) e l'RNA totale è stato estratto dalla sospensione cellulare rimanente utilizzando il kit Qiagen miRNeasy Mini (Qiagen 217004).

Per confermare l'arricchimento dicellule progenitrici del nefronerispetto ad altri tipi di cellule, l'RNA totale è stato isolato dai progenitori del nefrone e dall'interoreni(controllo del rene intero, vedi sopra) e PCR quantitativa a trascrizione inversa (qRT-PCR) per i seguenti marcatori: marcatori progenitori del nefrone Six2 e Cited1 (L. Huang et al., 2016) e per Lhx1, Pdgfr, Pecan e Caleb che segnano la vescicola renale (Brunskill et al., 2014), lo stroma renale (S. Chen et al., 2015), endoteliale (Kobayashi et al., 2008) e gemma ureterale (Cebrian et al., 2014a ) cellule, rispettivamente; vedere anche la figura supplementare 1. Gapdh (Barber et al., 2005) è stato utilizzato come gene di pulizia e la quantificazione relativa è stata calcolata tramite il metodo 2-ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001). I primer per queste trascrizioni sono inclusi nella Tabella 2.

Tabella 2. Primer RT-PCR.

Accessibilità della cromatinapreparazione della biblioteca

Circa 50,000cellule progenitrici del nefronesono stati utilizzati per generare ciascuna libreria di sequenziamento per ATAC-seq utilizzando il Nextera DNA Flex Library Prep Kit (Illumina FC-121-1030) con modifiche secondo un metodo pubblicato in precedenza (Buenrostro et al., 2013). In breve, le cellule sono state sospese in un tampone di lisi non ionico ghiacciato costituito da Tris 10 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM, inibitore della proteasi PMSF 1 mM e Triton X{12}} 0,05% in volume per 10 minuti per lisare le cellule membrane lasciando intatte le membrane nucleari. I nuclei progenitori del nefrone intatto sono stati risospesi in un tampone di trasposizione contenente l'enzima trasposasi e incubati a 37 gradi per 30 minuti. Il DNA genomico libero rilasciato dal processo di trasposizione è stato purificato utilizzando il kit MinElute PCR Purification (Qiagen 28004) e quindi indicizzato utilizzando primer di indice forward (i7) e reverse (i5) del Nextera Index Kit (Illumina FC-121-1011). La legatura dell'indice e l'amplificazione del frammento sono state ottenute utilizzando il programma di ciclo termico di amplificazione PCR del metodo.

Per determinare il numero ottimale di cicli di amplificazione richiesti per la libreria ATAC-seq, è stata eseguita una reazione laterale qPCR utilizzando SsoAdvanced SYBR Supermix (BioRad 1725274) e un 96-well C100 Thermal Cycler (Bio-Rad) per calcolare il normalizzato valore reporter (Rn) per ogni ciclo. Il numero di cicli in cui la reazione ha raggiunto un terzo della sua fluorescenza massima è stato identificato come il numero ottimale di cicli di amplificazione rimanenti e il volume rimanente della reazione di trasposizione ATAC-seq indicizzata è stato sottoposto a quel numero di cicli aggiuntivi nell'amplificazione finale programma. Le librerie finali sono state purificate utilizzando sfere magnetiche Ampure XP (Beckman Coulter A63881).

Accessibilità della cromatinasequenziamento

Il sequenziamento paired-end della libreria ATAC-seq è stato eseguito su un Illumina NextSeq500 dall'Health Sciences Sequencing Core presso l'UPMC Children's Hospital di Pittsburgh, multiplexato con concentrazioni di libreria che dovrebbero produrre 90 milioni di letture paired-end per campione . La qualità delle letture è stata ridotta utilizzando TrimGalore (BabrahamLab, 2014) (versione 0.4.3) in modalità "--accoppiata" e con impostazioni altrimenti predefinite. Le letture sono state allineate al genoma mm10 (Church et al., 2011) utilizzando Bowtie2 (Langmead et al., 2009) (versione 2.3.1) con le impostazioni "--local -q -X 2000 -- m". Le letture risultanti da duplicati PCR dello stesso frammento di DNA sono state contrassegnate utilizzando la funzione MarkDuplicates di Picard Tools (Broad Institute, 2016) (versione 2.10.9) con le impostazioni predefinite. Le letture mappate in modo ambiguo a più di una posizione nel genoma sono state assegnate casualmente a una di queste posizioni se c'erano meno di quattro possibilità e sono state altrimenti eliminate (ENCODE, nd) (utilizzando uno script Python disponibile su https://github. com/kundajelab/atac_dnase_pipelines, (Lee, 2017) con le impostazioni "--paired-end -k"). Samtools (H. Li et al., 2009) (versione 1.3.1) è stato utilizzato per filtrare letture duplicate, non mappate, orfane e mitocondriali, nonché per l'ordinamento e l'indicizzazione dei file BAM. Il controllo di qualità dei dati ATAC-seq ha seguito le linee guida ATAC-seq del progetto ENCODE (ENCODE, nd) e le librerie di campioni sono state sottocampionate casualmente in modo che ciascuna contenesse 31 milioni di letture paired-end al fine di normalizzare le differenze nelle dimensioni delle librerie.

Cistanche può prevenire l'infezione renale

Identificazione delle regioni cromatiniche accessibili

I file BAM contenenti letture ATAC-seq filtrate sono stati convertiti in formato BED paired-end utilizzando Bedtools' (Quinlan & Hall, 201{{20}}) (versione 2.26.0) 'bombed ' funzione con le impostazioni "- bed pe -mate1". Le regioni di cromatina accessibile sono state identificate utilizzando l'algoritmo di chiamata del picco ampio dello strumento Model-based Analysis of ChIP-seq (MACS2, versione 2.1.1.20160309) (Zhang et al., 2008), con impostazioni "--format BEDPE {{ 18}}g mm -p 0.01 --ampio --shift 37 --dimensione del testo 75 --tenere sott'occhio tutto il --modello". Per identificare le regioni accessibili ad alta confidenza, sono stati eseguiti confronti a coppie (di ciascuna combinazione di replicati da un determinato momento) ed è stato calcolato il tasso di scoperta irreproducibile (IDR) (Q. Li et al., 2011) utilizzando un Implementazione Python (GitHub https://github.com/nboley/idr) (Boleu et al., 2015) con impostazioni "--input-file-type wide peak --rank p.value {{ 35}}soft-IDR-soglia 0.1 --letto tipo file di output". In particolare, per ogni punto temporale è stato inviato un file BED concatenato di tutte le regioni accessibili tramite l'argomento "--peak-list" per ciascun confronto (ad esempio, quando si confrontano due campioni E14.5, tutti i picchi ampi E14.5 vengono utilizzati tutti e tre i replicati). Le regioni di accessibilità che erano coerenti da IDR in almeno due confronti replicati a coppie (con una sovrapposizione minima del 20 percento) sono state combinate in un insieme unificato di regioni accessibili ad alta confidenza ("regioni IDR").

Cambiamenti nelle regioni di cromatina accessibili

L'accessibilità di ciascuna regione IDR all'interno di un dato campione è stata quantificata contando il numero di eventi di trasposizione che si verificano durante la normalizzazione del contenuto della sequenza GC tra i campioni. Ciò è stato ottenuto utilizzando uno script personalizzato (disponibile nel repository del software allegato, vedere i dati supplementari). Le modifiche a questa accessibilità sono state quindi determinate confrontando questi valori in diversi punti temporali utilizzando il pacchetto software Limma-voom (versione 3.42.2) (Ritchie et al., 2006). Per tenere conto del sesso dell'embrione, la frazione di embrioni femminili in ciascun campione è stata inclusa come cofattore nei modelli lineari utilizzati per l'analisi dell'accessibilità differenziale ed è stata rimossa come effetto batch nelle visualizzazioni utilizzando la funzione di rimozione dell'effetto batch del pacchetto Limma. Si riteneva che le regioni della cromatina (DAR) diversamente accessibili si aprissero significativamente (maggiore accessibilità tra E14.5 e P0) o chiudessero (diminuzione dell'accessibilità tra E14.5 e P0) quando si controllava il tasso di false scoperte al 10 percento . Le analisi di arricchimento funzionale delle regioni genomiche di apertura e chiusura sono state determinate inviando le rispettive coordinate allo strumento di arricchimento delle annotazioni delle regioni genomiche (GREAT, disponibile all'indirizzo http://great.stanford.edu/public/html/) (McLean et al., 2010 ). Le annotazioni di potenziatori noti e previsti sono state recuperate dai repository FANTOM5 (Andersson et al., 2014), VISTA (Visel et al., 2007) e EnhancerAtlas 2.0 (Gao & Qian, 2020).

Impronte dei fattori di trascrizione

Le impronte dei fattori di trascrizione sono state identificate raggruppando tutti i file BAM dallo stesso punto temporale, quindi eseguendo il software Hmm-based Identification of TF Footprints (HINT) di Regulatory Genomics Toolbox (versione 0.12.3), in particolare il modello di footprint per ATAC -seq data (disponibile su www.regulatory-genomics.org) (Z. Li et al., 2018). Questo software è stato eseguito con le impostazioni "impronta di destra --organismo=mm10 --at-seq --paired-end". Le impronte sono state quindi annotate con motivi di rilegatura del mouse noti dal database HOCOMOCO 11 (Kulakovskiy et al., 2018) utilizzando la funzione di corrispondenza dei motivi di HINT con le impostazioni "analisi del motivo a destra che corrisponde a --organismo=mm10". Sono state escluse le impronte con punteggi HINT inferiori a 10. Infine, sono stati misurati i modelli di attività differenziali tra le impronte abbinate al motivo utilizzando la funzione differenziale del programma RGT-HINT, con le impostazioni "differenza del suggerimento a destra --organismo=mm10 --bc {{27} }NC 12 --profili di output". I livelli di attività che cambiano significativamente sono stati identificati sulla base di un valore di p cutoff di 0,05 (metodo di Friedman-Nemeny).

Cistanche può migliorare la funzione renale

Configurazione nucleosomica

Le letture allineate dallo stesso punto temporale sono state raggruppate in un unico file BAM e il pacchetto NucleoATAC (versione 0.3.4) è stato utilizzato per identificare modelli nelle lunghezze di lettura indicativi sia di diadi nucleosomiali legate che di regioni prive di nucleosomi ( NFR) (Schep et al., 2015). Questo software è stato eseguito utilizzando le impostazioni predefinite. I nucleosomi sono stati annotati come la regione di 146 bp centrata attorno a ciascuna diade di nucleosomi chiamata.

Espressione di RNA unicellulare

I dati sull'espressione genica unicellulare sono stati elaborati per un manoscritto precedente (BioRxiv https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.09.16.300293v1) (Bais et al., 2020) e sono stati recuperati da Gene Expression Omnibus (GEOIDE GSE158166). I dati elaborati incorporati nella figura 7 supplementare includono tipi cellulari, livelli di espressione genica, incorporamenti a bassa dimensione (tSNE) e annotazioni pseudotime relative alla traiettoria stabilita tra i cluster di progenitori di nefroni in proliferazione e differenziazione. I dati sono stati consultati e organizzati utilizzando il pacchetto SingleCellExperiment R (Lun & Risso, 2019).

Interazioni miRNA-mRNA nell'invecchiamento e nel differenziamento delle cellule progenitrici del nefrone

Geni con espressione mutevole tra auto-rinnovamento, innescato e differenziantecellule progenitrici del nefronesono stati ottenuti dalle tabelle supplementari 3 e 4 pubblicate da Bais et al. (FDR< 0.1="" for="" all="" genes,="" 99="" genes="" total).="" mirtarbase="" v8.0="" for="" the="" mouse="" was="" downloaded="" (https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/~mirtarbase/mirtarbase_2022/cache/download/8.0/mmu_mt="" i.xls)="" while="" mirdb="" version="" 6.0="" predictions="" were="" obtained="" from="" the="" mid="" b="" website="" (y.="" chen="" &="" wang,="" 2020);="" high-quality="" mirna-to-target-gene="" predicted="" interactions="" with="" a="" minimum="" score="" of="" 90="" were="" considered.="" annotated="" mir="" target="" genes="" and="" differentially="" expressed="" genes="" were="" then="" intersected="" using="" the="" r="" programming="" environment="" to="" generate="" figure="" 2="" and="" supplemental="" table="">

Sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina nei progenitori primari del nefrone

I dati sul sequenziamento dell'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP-seq) per il legame -catenina, Lef1, Six2 e Tcf7 nei progenitori primari del nefrone sono stati recuperati dai file BedGraph all'interno del repository GEO (GSE131119) per Guo et al., 2021. I valori del segnale di arricchimento della piega sono stati mediati attraverso campioni replicati.

Screening per elementi regolatori che influenzano l'espressione di miRNA

Per individuare potenziali potenziatori di miRNA, abbiamo annotato miRNA e DAR con i domini topologicamente associati (TAD) in cui si trovano sulla base di annotazioni mm10 da cellule staminali embrionali di topo, scaricate dal 3D Genome Browser (disponibile all'indirizzo http://3dgenome .fsm.northwestern.edu/) (Y. Wang et al., 2018). Regioni diaccessibilità della cromatinae miRNA erano considerati potenziatori candidati: coppie di miRNA se occupavano lo stesso TAD e mostravano cambiamenti coerenti nell'accessibilità e nell'espressione (aumento dell'accessibilità con l'aumento dell'espressione del miRNA e viceversa). I DAR sono stati considerati come possibili "caratteristiche di regolamentazione" solo se non si sovrapponevano a un promotore noto o all'estremità dell'esone. Le potenziali coppie di miRNA e presunti elementi regolatori avevano la priorità se 1) rientravano nello stesso TAD e 2) presentavano cambiamenti significativi tra E14.5 e P0 (aumento dell'espressione di miRNA e aumento dell'accessibilità della regione IDR e viceversa) .

Ringraziamenti

Shelby Hemker e Abha Bais hanno contribuito al design sperimentale. Il sequenziamento per ATAC-seq e mRNA-seq è stato eseguito dall'Health Sciences Sequencing Core presso l'UPMC Children's Hospital di Pittsburgh.

Interessi conflittuali

Nessun interesse in competizione dichiarato

Finanziamento

AC è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institute of Diabetes and Digestive eReneMalattie sotto il National Institute of Health (T32DK061296-17). DK è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Istituto nazionale di scienze mediche generali nell'ambito dell'Istituto nazionale di salute (R01GM115836). JH è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases nell'ambito del National Institute of Health (R01DK103776 e 125015). Il DMC è stato supportato da un premio per lo sviluppo professionale della rete di studio sulla sindrome nefrosica (NEPTUNE) e da una borsa di studio post-dottorato del Consiglio consultivo di ricerca dell'ospedale pediatrico di Pittsburgh. YP è stato sostenuto da sovvenzioni dell'UPMC Children's Hospital di Pittsburgh e del North American Mitochondrial Disease Consortium.

Disponibilità dei dati

I potenziatori del mouse previsti sono stati recuperati da FANTOM5 (DOI: 10.1038/nature12787; file disponibile qui), Vista (DOI: 10.1093/var/gkl822; file disponibile qui) e EnhancerAtlas (DOI: 10.1093/var/gkz980; file del mouse disponibili qui) banche dati. Il genoma del mouse mm10 e le sue annotazioni sono stati scaricati tramite il progetto Illumina genomes (disponibile qui). Il file over-chain per il sollevamento delle coordinate da mm9 a mm10 è stato recuperato dal browser del genoma UCSC (DOI: 10.1101/gr.229102; file disponibile qui). Le annotazioni TAD da cellule staminali embrionali di topo sono state recuperate dal 3D Genome Browser (DOI: 10.1186/s13059-018-1519-9; file disponibile qui). I target di trascrizione del miRNA previsti sono stati recuperati da TargetScan (DOI: 10.7554/eLife.05005, file disponibile qui) e da miRDB versione 6 (DOI: 10.1093/var/gkz757, file disponibile qui). I dati ATAC-seq, comprese le posizioni IDR/DAR, le annotazioni e i risultati dell'arricchimento differenziale, sono disponibili su GEO (GSE168339), così come i dati mRNA-seq inclusi le annotazioni e i risultati dell'espressione differenziale (GSE168342). Il codice del computer utilizzato per elaborare e analizzare i dati e per generare cifre è disponibile all'indirizzo https://bitbucket.org/clagstonA/mirna{32}}enhancers

Bibliografia

Abruzzese, MP, Bilotta, MT, Fionda, C., Zingoni, A., Soriani, A., Petrucci, MT, Ricciardi, MR, Molfetta, R., Paolini, R., Santoni, A., & Cippitelli, M (2019). Il fattore di trascrizione omeobox MEIS2 è un regolatore della sopravvivenza delle cellule tumorali e dell'attività degli IMiD nel mieloma multiplo: modulazione da parte degli inibitori delle proteine ​​​​Bromodomain ed Extra-Terminal (BET). Morte cellulare e malattia, 10(4). https://doi.org/10.1038/s41419-019-1562-9

Agarwal, V., Bell, GW, Nam, JW e Bartel, DP (2015). Previsione di siti target di microRNA efficaci negli mRNA di mammiferi. ELife. https://doi.org/10.7554/eLife.05005

Andersson, R., Gebhard, C., Miguel-Escalada, I., Hoof, I., Bornholdt, J., Boyd, M., Chen, Y., Zhao, X., Schmidl, C., Suzuki, T ., Ntini, E., Arner, E., Valen, E., Li, K., Schwarzfischer, L., Glatz, D., Raithel, J., Lilje, B., Rapin, N., … Sandelin, A. (2014). Un atlante di potenziatori attivi attraverso tipi di cellule e tessuti umani. Natura, 507(7493), 455–461. https://doi.org/10.1038/nature12787

Babaham Lab. (2014). Taglia a bizzeffe. In Bioinformatica. http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_a bizzeffe

Bais, AS, Cerqueira, DM, Clugston, AS, Ho, J. e Kostka, D. (2020). Il sequenziamento dell'RNA unicellulare rivela l'attività differenziale del ciclo cellulare nelle popolazioni cellulari chiave durante la nefrogenesi. BioRxiv. https://doi.org/https://doi.org/10.1101/2020.09.16.300293

Barber, RD, Harmer, DW, Coleman, RA e Clark, BJ (2005). GAPDH come gene housekeeping: analisi dell'espressione dell'mRNA di GAPDH in un pannello di 72 tessuti umani. Genomica fisiologica. https://doi.org/10.1152/physiolgenomics.00025.2005

Bartel, DP (2009). Riconoscimento del bersaglio del microRNA e funzioni di regolamentazione. Cella, 136(2), 215–233. https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.01.002.MicroRNA

Bertram, JF, Douglas-Denton, RN, Diouf, B., Hughson, MD e Hoy, WE (2011). Numero di nefrone umano: implicazioni per la salute e la malattia. Nefrologia pediatrica, 26(9), 1529–1533. https://doi.org/10.1007/s00467-011-1843-8

Boleu, N., Kundaje, A., Bickel, PJ e Li, D. (2015). Tasso di scoperta irriproducibile (2.0.3). https://github.com/nboley/idr

Bouchard, M., Souabni, A., Mandler, M., Neubüser, A. e Busslinger, M. (2002). Specifica del lignaggio Nephric di Pax2 e Pax8. Geni e sviluppo. https://doi.org/10.1101/gad.240102

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Da: diario pre-prova

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