Effetti della cistanche sull'apoptosi Neuroni dopaminergici indotti dalla neurotossina 1-metil-4 -fenilpiridinio (MPP)

Contatto: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Tian Jiyu, Chen Jianzong

(Centro di ricerca sulla medicina tradizionale cinese e sulla materia medica cinese dell'ospedale di Xijing, FMMU, Xi'an 710032)

Astratto

Obbiettivo: Per indagare gli effetti diCistanche sulla cellula di apoptosi dei neuroni dopaminergici della coltura primaria indotta da 1-metil-4- fenilpiridinio (MPP plus ). Metodo: Per preparare il siero di coniglio composto daCistancheutilizza il metodo della farmacologia sierica. Quindi analizzare gli effetti di Cistanche sulla cellula di apoptosi dei neuroni DAMPP piùmodelli indotti mediante morfologia, citometria a flusso, colorazione TUNEL.Risultato: Trattamento di 200μmol/LMPP piùper 24 ore o più apoptosi indotta nei neuroni DA. DopoMPP piùtrattato, il rapporto di apoptosi del gruppo contenente un dosaggio equivalente del siero di Cistanche è del 6,3 per cento, il gruppo diMPP piùtrattata da sola è del 30,2 per cento. Il numero di cellule di apoptosi del gruppo B e C è significativamente inferiore al gruppo E (P<0.05).>Conclusione: Il siero contenutoCistancheapoptosi protetta neuroni DA indotti daMPP più.

Parole chiave: Cistanche;1-metil-4-fenilpiridinio (MPP più ); neuroni dopaminergici; apoptosi

Attualmente, la terapia principale permorbo di Parkinsonè la terapia sostitutiva dei preparati a base di levodopa composta (L-dopa), che non possono controllare lo sviluppo della malattia. Con il progredire della malattia, il dosaggio viene aumentato e, in generale, entro 3-5 anni, l'effetto curativo diminuisce, i sintomi motori fluttuano e compaiono discinesie farmaco-indotte. Studi recenti hanno scoperto che la L-dopa ha l'effetto di indurre l'apoptosi sui neuroni coltivati ​​in vitro[1, 2], e quindi è stato proposto che l'effetto neurotossico della dopamina endogena porti alla perdita di neuroni dopaminergici inmorbo di Parkinson. Uno dei motivi [3]. Nella pratica clinica a lungo termine, abbiamo usato la medicina cinese pernutrendo fegato e renicombinato con preparati a base di levodopa per il trattamento della malattia di Parkinson e ha ottenuto buoni risultati [4-6]. Questo esperimento ha esplorato l'effetto protettivo della medicina tradizionale cinese sull'apoptosi dei neuroni dopaminergici e il suo meccanismo a livello molecolare e cellulare.

1. Materiali e metodi

1.1 Materiali

supporto DMEM,1-metil-4-fenilpiridinio, MPP plus, siero bovino fetale acquistato dalla società Gibco.Citarabina, poli-l-lisina, PLLsono stati acquistati dalla Sigma Company. 24-piatto di coltura per pozzetti, 25 cm2

Boccette di plastica per colturesono stati acquistati dalla NUNC Company.La medicina cinesesiamo stati usati è stato acquistato da Xi'an Decoction Piece Factory. Gli animali che abbiamo utilizzato sono forniti dal centro animali della scuola.https://www.xjcistanche.com/products

1.2 Preparazione e raggruppamento sperimentale di siero medicato

Cistanche è preparato come polvere liofilizzata per la conservazione e diluito con acqua distillata quando utilizzato. Il siero animale è stato preparato dal coniglio bianco dalle grandi orecchie della Nuova Zelandasiero, tutti maschi sani, del peso di 2.5-3.0 kg. La dose equivalente di animali viene convertita in base alla superficie corporea e divisa casualmente nel siero del gruppo di controllo in bianco; 1/2 dose equivalente di siero del gruppo (dose sondata di Cistanche materia prima medicinale 0,8 g/kg); gruppo di dose equivalentesiero(La dose di sonda gastrica è Cistanche cistanche materiale medicinale originale 1,6 g/kg); 2 volte la dose equivalente disiero(la dose di sonda gastrica è di materiale medicinale originale Cistanche 3,2 g/kg). Somministrazione gastrica due volte al giorno per un totale di 3 giorni, 1 ora dopo l'ultima sonda gastrica, salasso carotideo, notte a 4 gradi, centrifugazione a 2500 r/min per 25 minuti, attenta separazione del siero, inattivazione a 56 gradi per 30 minuti e aspirazione attraverso una membrana filtrante da 0,22 μm Filtrare i batteri e conservare a -20 gradi . Nelle stesse condizioni, un siero di controllo di coniglio bianco è stato preparato mediante sonda gastrica con un volume uguale di soluzione fisiologica normale. L'esperimento è stato diviso in 5 gruppi. Il gruppo A era un coniglio biancosierogruppo di controllo della cultura; Il girone B era asierocoltura più MPPgruppo di trattamento contenente 2 volte la dose equivalente; Il girone C era asierocoltura più MPPgruppo di trattamento contenente una dose equivalente; Il gruppo D era un gruppo di controllo della coltura del siero contenente 1/2 dose equivalente di coltura del siero più il gruppo di trattamento con MPP; Il gruppo E è una coltura di siero di coniglio in bianco più il gruppo di trattamento MPP.

Vantaggio Cistanche

1.3 Coltivazione di neuroni dopaminergici del mesencefalo

Tre ratti SD di 14 giorni di gravidanza sono stati selezionati e uccisi mediante iniezione diretta di embolia gassosa nel cuore; i ratti embrionali sono stati prelevati in condizioni asettiche e posti in una capsula di Petri riempita con una soluzione di ghiaccio D-Hanks. Il tessuto cerebrale del ratto fetale è stato sezionato e separato allo stereomicroscopio. Il metodo di riferimento [7] è stato leggermente migliorato. Le meningi e il tessuto vascolare sono stati staccati e i tessuti nelle aree A8, A9 e A10 del mesencefalo ventrale sono stati separati. Aggiungere 1 ml di pancreatina allo 0,125% e metterlo in un'incubatrice a 37 gradi per circa 20 minuti, aggiungere una quantità adeguata di terreno di coltura contenente il 10% di siero bovino fetale per terminare la digestione e utilizzare l'aspirazione

Pipettare la provetta in una sospensione cellulare uniforme, centrifugare a 1500r/min per 5 minuti a temperatura ambiente, rimuovere con cura il supernatante, pipettare 15 volte con una pipetta a collo sottile e lasciar riposare per 5 minuti. Nella 24-piastra di coltura per pozzetti di lisina, aggiungere il mezzo di coltura a ciascun pozzetto per regolare la densità cellulare a 2 × 105 cellule/mL, aggiungere il mezzo di coltura a 0,5 mL per pozzetto e aggiungere la citarabina dopo 3 giorni di coltura ( la concentrazione finale è 10μmol/L), inibisce la crescita dei non neuroni.

1.4 Colorazione immunocitochimica della tirosina idrossilasi (TH).

Utilizzando il metodo SABC, il diluente anticorpale contiene sieroalbumina bovina 1 g/100 ml (Boster Company, Wuhan), 0,3 percento di Triton-100 (Sigma, USA), NaN3 80mg/ 100 ml, diluiti con PBS a 100 ml, regolare il pH a 7,6. La coltura è stata terminata il 7° giorno, lavata con D-PBS per 5 minuti 3 volte, la paraformaldeide al 4 percento appena preparata è stata fissata a temperatura ambiente per 30 minuti e lavata con D-PBS per 5 minuti 3 volte; con soluzione di perossido di idrogeno 1:1:8, metanolo e PBS Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, risciacquare con D-PBS per 5 minuti, aggiungere il 5% di siero di capra bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente, risciacquare con D-PBS per 5 minuti e aggiungere l'anticorpo TH di capra anti-topo diluito con diluente anticorpale (diluizione 1:1000, Calbiochem)), per una notte a 4 gradi, risciacquare con D-PBS per 3 min 3 volte, aggiungere IgG anti-ratto di topo biotinilato diluito con l'anticorpo diluente (diluito 1:200, Sigma USA), agire a temperatura ambiente per 4 ore, risciacquare con D-PBS per 3 min 3 volte, aggiungere il complesso HRP diluito con diluente anticorpale per 2 ore a temperatura ambiente e risciacquare con D-PBS per 3 minuti 3 volte. Sciacquare il diluente DAB per 3 minuti, aggiungere il reagente cromogenico DAB pronto all'uso (Wuhan Boster Company) nelle cellule e osservare il colore al microscopio invertito.https://www.xjcistanche.com/

1.5 Manipolazione della droga

Le osservazioni morfologiche dei neuroni in coltura sono state effettuate quotidianamente al microscopio a contrasto di fase e le variazioni sono state registrate con fotografie. Dopo la coltura per 12 ore, le cellule sono state osservate al microscopio invertito e i farmaci sono stati aggiunti appena prima della confluenza. Il contenuto di siero di ciascun gruppo era del 10%. Dopo la coltura per 3 giorni, MPP plus è stato aggiunto alla concentrazione finale di 200 μmol/L. Dopo l'incubazione in un'incubatrice a 37 gradi e 5% di CO2 per 24 ore, eseguire varie ispezioni.

Cistanche

1.6 Rilevazione con citometria a flusso

Il trattamento farmacologico era lo stesso di prima. Dopo che ciascun gruppo è stato trattato, le cellule PC12 aderenti sono state digerite con 0.125% di tripsina e le cellule sono state prelevate a circa 1 × 106 PBS. Le cellule sono state lavate due volte e sono stati aggiunti 490 μL di tampone legante e le cellule sono state accuratamente miscelate e sono stati aggiunti 5 μL di annessina V. FITC e 10μL di PI disciolto nella sospensione cellulare, mescolare delicatamente, mettere la provetta a 4 gradi, incubare per 10 minuti al buio e testare sul citometro a flusso COULTER EPICS (Beckman Coulter, USA).

1.7 Etichettatura finale in situ (TUNEL) per rilevare l'apoptosi cellulare

L'etichettatura finale del DNA in situ dei neuroni in coltura utilizza il kit di rilevamento dell'apoptosi di Boster (MK1022) e i passaggi sono i seguenti: Prendere le cellule dei neuroni dopaminergici di ciascun gruppo dopo il trattamento con MPP plus (il vetrino prima della coltura primaria è pre-coltivato con trattamento polimerico con lisina), fissato con 4{{30}} g/L di paraformaldeide per 1 ora, acido acetico fresco al 3% (pH2,5) a temperatura ambiente per 10 minuti, neutralizza la fosfatasi alcalina, aggiungere 0,1 mol/L di TBS (pH7,5) 1:200 digestione della proteinasi K appena diluita a 37 gradi per 20 secondi, aggiungere 1 μL di TdT e DIG-d-UTP a ciascun vetrino e 18 μL di soluzione tampone per 2 ore a 37 gradi; aggiungere 50μL di soluzione bloccante a ciascun vetrino, a temperatura ambiente per 30 minuti; Aggiungere 50μL di anticorpo anti-digossigenina biotinilato diluito con soluzione bloccante; reagire per 30 minuti in una scatola bagnata a 37 gradi; aggiungere 50μL di SABC-AP diluito con 0,1mol/L TBS a ciascun vetrino; BCIP/NBT (0,1 mol di pH9,5 /L TBS diluito 1:20) è stato aggiunto al campione per sviluppare il colore per 30 minuti; allo stesso tempo, un controllo alternativo (tampone TdT è stato utilizzato al posto della miscela TdT/biotina-dUTP) per microfotografia e microscopio a contrasto di fase invertito (200 ×) Osservare le cellule apoptotiche. Contare le cellule positive al microscopio a contrasto di fase, contare 5 campi per pozzetto in ogni gruppo, per un totale di 6 pozzetti.

2. Risultati sperimentali

2.1 Osservazione morfologica di neuroni in coltura

Osservato dal microscopio a contrasto di fase OlympusIX70: 5 ore dopo l'inoculazione, la maggior parte delle cellule aderisce alla parete, le cellule sono sparse, il corpo cellulare è rotondo, il nucleo è invisibile e l'indice di rifrazione è forte. Dopo la coltura per 24 ore, le protuberanze cellulari sono cresciute e gradualmente allungate. A 48 ore, la maggior parte delle cellule sporgeva con protuberanze filamentose ramificate. La morfologia cellulare era diversa, bipolare, tripolare e multipolare, e gradualmente formava una rete sparsa. Il corpo cellulare era ingrandito, rotondo ed ellittico. Dopo MPP più lesione, le cellule si sono prima gonfiate, l'indice di rifrazione è aumentato, le cellule erano in uno stato degenerativo e alla fine le cellule si sono ridotte e sono cadute. Dosi diverse di siero contenente la medicina cinese composta hanno effetti protettivi su MPP e lesioni. Dopo che la coltura è stata colorata con cellule immunitarie TH, si è visto che le cellule TH-positive erano marroni con crescita di neuriti. Dopo aver aggiunto la dose equivalente del siero della medicina tradizionale cinese, la proporzione di TH-positivoneuronipuò raggiungere il 55 percento -60 percento .

2.2 Analisi dei risultati del test di citometria a flusso (vedi Figura 1)

La fosfatidilserina (PS) situata all'interno della membrana cellulare nella fase iniziale dell'apoptosi migra verso l'esterno della membrana cellulare. La proteina legante la fosfatidil V (Annessina V) è una proteina legante i fosfolipidi calcio-dipendente, che ha un'elevata affinità per la PS. Pertanto, l'annessina V può essere utilizzata come sonda per rilevare la PS esposta sulla superficie della membrana cellulare. Allo stesso tempo, combinato con il metodo di esclusione PI per il doppiocolorazionedelle cellule apoptotiche, le cellule apoptotiche possono essere rilevate mediante citometria a flusso. Nel quadrante in basso a destra della Fig.1 (FITC plus /PI-), vengono visualizzati i dettagli dell'apoptosi di ciascun gruppo. La proporzione di cellule, il tasso di apoptosi di ciascun gruppo era del 4,1 percento, 5,8 percento, 6,3 percento, 28,6 percento, 30,2 percento.

2.3 Analisi dei risultati della colorazione TUNEL

Quelle con particelle blu-viola nel nucleo sono cellule positive, cioè cellule apoptotiche. La proporzione di cellule apoptotiche in ciascun gruppo è stata contata al microscopio ottico. Il numero di cellule apoptotiche per campo visivo in ciascun gruppo era: Gruppo A 2,13±{3}}.34; Gruppo B 4.92±0.67; Gruppo C 6,20±1,47; Gruppo D 10,33±1,51; Gruppo E 12,74±2,51. Dopoanalisi del test t,i gruppi B e C sono stati confrontati con il gruppo E (P<0.05). the="">risultatisono sostanzialmente coerenti con ilrisultati della citometria a flusso.

3. Discussione

morbo di Parkinsonappartiene alla categoria della "sindrome da tremore" nella medicina cinese. La medicina tradizionale cinese ritiene che l'esordio del PD sia principalmente una serie di manifestazioni del graduale esaurimento del fegato e dei reni negli anziani e della perdita di nutrimento del meridiano del midollo cerebrale. Il trattamento principale è quello dinutrire il fegato e i reni, calma il fegato ed elimina il vento. La medicina tradizionale cinese può svolgere lo scopo di "riducendo la tossicità e aumentando l'efficacia"nel trattamento diParkinson, ma al momento il suo meccanismo d'azione non è molto chiaro. Un gran numero di prove sperimentali nella medicina moderna indicano che lo stress ossidativo è uno dei fattori che causano la morte delle cellule nervose PD [3]. Gli studi hanno scoperto che i glicosidi totali del cistanche possono rimuovere efficacemente vari radicali liberi reattivi dell'ossigeno e proteggere il DNA dall'ossidazione causata dall'OH[8]. L'estratto di cistanche tubuloside B può attenuare la citotossicità indotta daMPP più,indeboliscono l'accumulo di specie reattive dell'ossigeno nella cellula e hanno un effetto antagonista sull'apoptosi e sullo stress ossidativo indotto daMPP più[9]. La medicina tradizionale cinese può attivare e rafforzare il proprio percorso di segnale protettivo, resistere ai danni esterni e ripristinare il suo equilibrio. Questo è uno degli obiettivi della modernizzazione della medicina tradizionale cinese. Dopo la terapia sostitutiva della dopamina, le persone ora apprezzano generalmente la terapia neuroprotettiva, che è chiamata la seconda rivoluzione nel trattamento della malattiamorbo di Parkinson. In questo esperimento, le cellule nervose dopaminergiche del mesencefalo isolate sono state coltivate con la medicina cinese contenente siero e si è scoperto che Cistanche ha un certo effetto neuroprotettivo. In questo esperimento, sono stati utilizzati due metodi di rilevamento della citometria a flusso e della colorazione TUNEL per scoprire contemporaneamente che il siero del gruppo a dose equivalente e il siero del gruppo a dose 2 volte equivalente della coltura di siero medicato Cistanche possono ridurre il nervo dopaminico del mesencefalo primario in coltura causato daMPP piùIl numero di cellule apoptotiche ha un certo effetto protettivo sulle cellule apoptotiche. La medicina tradizionale cinese può proteggere i neuroni dopaminergici dai danni nella fase iniziale, che è una misura più importante di altre terapie. In questo senso, il trattamento olistico della medicina cinese è la cura per la causa principale e può essere considerato uno dei trattamenti neuroprotettivi che le persone apprezzano attualmente.

Riferimenti

1. Ziv I, Zilkha-Falb R, Offen D, et al. La levodopa induce l'apoptosi nelle cellule neuronali in coltura: un possibile acceleratore della degenerazione nigrostriatale nel morbo di Parkinson? Mov Disord, 1997, 12(1):17

2. Jenner PG, Brin MF. Neurotossicità della levodopa: studi sperimentali contro rilevanza clinica. Neurologia,1998,50(6 Suppl 6): S39

3. Maruyama W, Naoi M. Morte cellulare nel morbo di Parkinson. J Neurol, 2002,249 (Suppl 2): ​​II6

4. Chen Jianzong, Jiang Wen, Shi Jian, et al. Osservazione clinica sul trattamento del morbo di Parkinson con la funzionalità epatica e renale: una relazione di 60 casi. Journal of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 1999, 22(3): 14

5. Chen Jianzong, Chen Xiaoli, Li Junchang, ecc. Osservazione clinica su 40 casi di morbo di Parkinson trattati con il metodo del nutrimento di fegato e reni. Ricerca in Medicina Cinese, 1998, 14(3): 10

6. Chen Jianzong, Jiang Wen, Wu Baron, et al. Pingchan n. 1 liquido orale nel trattamento di 40 casi di morbo di Parkinson. Journal of Anhui College of Traditional Chinese Medicine, 1999, 18(2): 9

7. Shimoda K, Sauve Y, Marini A, et al. Un'elevata resa percentuale di cellule tirosina idrossilasi-positive da coltura cellulare mesencefalica di ratto E14. Brain Res, 1992.586 (2): 319

8. Wang Xiaowen, Jiang Xiaoyan, Wu Liya Yiming, et al. Scavenging in vitro dei radicali liberi ed effetti protettivi sul danno al DNA indotto da OH causato dai glicosidi totali della cistanche. Giornale farmaceutico cinese, 2001, 36(1): 29

9. Sheng G, Pu X, Lei L, et al. Tubuloside B dalla salsa Cistanche Salva le cellule neuronali PC12 dall'apoptosi e ossidativa indotta da ioni metil-4-metil-4- metilpiridinio.Stress.Planta Med,2002,68(11):966