Cistanche deserticola polisaccaridi attenua la nefropatia diabetica nei topi colpendo la flora intestinale e inibendo la via di segnalazione del recettore 4/fattore nucleare-κB

Riassunto: l'obiettivo di questo studio era di studiare l'effetto ameliorato ePotenziale meccanismo di cistanche deserticola polisaccaridi (CDP)SUNefropatia diabetica (DN)nei topi. Il modello di topo DN è stato stabilito dall'alimentazione della dieta ad alto contenuto di grassi (HFD) combinata con un'iniezione intraperitoneale di streptozotocina (STZ). Trentasei topi maschi C57BL/6N sono stati divisi casualmente in sei gruppi (n=6 ciascuno). Tutti i gruppi sono stati somministrati per via orale con acqua distillata (controllo e modello), dapagliflozin o CDP per 4 settimane. Cambiamenti negli indici fisiologici, funzione renale,fattori infiammatorie sono stati valutati il ​​microbiota intestinale. I risultati hanno mostrato che i CDP hanno migliorato significativamente la condizione generale e attenuato ilCambiamenti istopatologici renali, Eridotto i livelli di glicemia, proteina urinariaEfattori infiammatorinei topi DN. Inoltre, i CDP hanno influenzato l'equilibrio del microbiota intestinale, ha aumentato l'abbondanza di batteri benefici e una riduzione dei potenziali batteri patogeni, che a loro volta hanno migliorato la funzione della barriera intestinale. I CDP hanno anche inibito l'attivazione del recettore 4/fattore nucleare-κB (TLR4/NF-κB) e ridotto il rilascio di lipopolisaccaride (LPS). In conclusione, i CDP mostrano un effetto migliorativo sul DN nei topi influenzando il microbiota intestinale e inibendo le vie di segnalazione infiammatoria. Questa scoperta offre nuove intuizioni sul trattamento di DN.

 

Parole chiave: cistanche deserticola polisaccarides;Nefropatia diabetica; barriera intestinale; flora intestinale; Recettore a pedaggio 4; Fattore nucleare-κB

 

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Nefropatia del diabete (DN)è la principale causa della malattia renale allo stadio terminale e minaccia seriamente la vita e la salute dei pazienti [1]. Gli studi hanno confermato che lo squilibrio della flora intestinale svolge un ruolo patogeno importante nel processo di diabete che si sviluppa in DN [2-3]. La teoria "Asse intestinale" ritiene che i cambiamenti nel microambiente intestinale possano influenzare la progressione della malattia renale cronica regolando direttamente i metaboliti della flora intestinale [2-3]. La flora intestinale svolge un ruolo importante nella regolazione della funzione renale nei modelli di topo DN [4-5]. Ricerche approfondite su "Asse intestinale" contribuirà a chiarire la patogenesi del DN e a scoprire nuovi obiettivi per la prevenzione e il trattamento.
Cistanche Deserticola è una pianta medicinale e commestibile tradizionale, nota anche come Deserticola di cistanche, Dijing, Jinsun, ecc., Comunemente nota come Dayun, e ha la reputazione di "ginseng del deserto" [6]. Secondo la farmacopea della Repubblica popolare cinese, la cistanche Deserticola è il gambo carnoso secco con foglie squamose di cistanche deserticola YC MA o C. tubulosa (Schenk) Wight, una pianta del genere Cistanche nella famiglia Orobaceae.
Tra questi, la cistanche Deserticola ha una lunga storia di essere usata sia come medicina che come cibo. La cistanche deserticola è dolce, salata e calda ed entra nei meridiani renali e dell'intestino crasso. Ha gli effetti della tonificante Yang renale, a beneficio dell'essenza e del sangue e inumidire l'intestino e alleviare la costipazione [7-8]. I polisaccaridi sono uno dei principali ingredienti attivi della cistanche deserticola. Il contenuto di polisaccaridi nell'estratto di acqua di cistanche deserticola è relativamente alto. È composto principalmente da monosaccaridi come glucosio, galattosio, ramnosio, arabinosio e fruttosio. Ha molti effetti farmacologici come la regolazione dell'attività immunitaria, l'anti-invecchiamento, il miglioramento dell'apprendimento e la memoria, la protezione dei nervi, resistere al danno epatico, anti-virus e anti-tumor [9-12]. Precedenti studi del gruppo di ricerca hanno dimostrato che l'estratto di acqua di cistanche deserticola ha un potenziale effetto terapeutico sul DN [13]. Sulla base di questo, questo esperimento ha preso la flora intestinale e la risposta infiammatoria come punto di partenza per studiare l'effetto dei polisaccaridi deserticola di cistanche (CDP) sul miglioramento del DN nei topi e sul ripristino della funzione renale, al fine di fornire una base scientifica per il ruolo dei CDP nel trattamento di DN.

1 Materiali e metodi

1.1 Animali, materiali e reagenti

36 6- Settimana C57BL/6J Topi maschili sono stati acquistati dal Centro Experiment per animali della Xinjiang Medical University, licenza di produzione animale n.: SCXK (Xin) 2023-0006; Risoluzione etica n.: IACUC -20210331-04.
Desert CDPS (frazione di massa polisaccaridica ＞ 80%, numero batch: 2306019) SHAANXI XINTANYU Company; Dapagliflozin (DAPA; numero batch: 2108119) Astrazeneca Pharmaceuticals Co., Ltd.; proteina totale delle urine (proteina totale delle urine, UTP; numero batch: c 035-2-1), azoto urea (azoto urea nel sangue, bun; numero batch: c 013-2-1), creatinina (creatinina, cre; cre; numero batch: c 011-2-1), uric acido (uricacid, ua; batch: c {c {{{6 Nanjing Jiancheng Bioingegneriering Institute; LipopolySaccharide (LPS; Numero batch: yx -121619 m), interleukin -6 (il -6; numero batch: yx-e20012), il -1 (numero batch: yx-e2053), trasformando il fattore di crescita (tgf-; batch numero: batch -e: batch none fattore di necrosi tumorale- (TNF-; numero batch: yx-e20220) kit shanghai youxuan biological Co., Ltd.; Kit di chemiluminescene (ECL) avanzato Beijing Pulilai Gene Technology Co., Ltd.; Streptozotocina (STZ; numero batch: 20230503), dieta ad alto contenuto di grassi (dieta grasso 60% di dieta ricca di grassi, numero di materiale: boaigang12492m) Beijing Boaigang Biotechnology Co., Ltd.
L'alimentazione di base (contenente 22% di farina di mais, cuscinetto del 12%, residuo di olio 18%, 8% di pasto di pesce, 12% di pasto di soia, 0. 17% sale, 0. 25% Vitamine, {9}}. Xinjiang Medical University.

 

1.2 Strumenti e attrezzature

AE240 Equilibrio analitico, Mettler-Toledo Instrument Co., Ltd., Svizzera; Dhg -9053 Un forno di asciugatura di riscaldamento elettrico, Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., Ltd.; DK-S22 BACCHIO ACQUA COSTANTI COSTANTI, SHANGHAI JINGHONG SPERIGIMENT STRUMENT Co., Ltd.; 3-18 KS Centrifuga ad alta velocità ad alta velocità, Sigmaaldrich, USA; BS -380 analizzatore biochimico completamente automatico, Shenzhen Mindray Biomedical Electronics Co., Ltd.; Slicer EM KMR3, HI1220 Slicer, microscopio digitale di Leitz Optilux, Leica, Germania; Sistema di imaging di chemiluminescenza a fluoro, ProteinSimple, USA.

1.3 Metodi

1.3.1 Esperimento sugli animali

36 topi maschi C57BL/6J sono stati alimentati nel laboratorio SPF della Xinjiang Medical University e alimentati liberamente. L'esperimento è stato condotto dopo 7 giorni di alimentazione adattiva. Sei topi sono stati selezionati casualmente come gruppo normale (di controllo) e dati una dieta di base. Il resto dei gruppi sperimentali è stato alimentato una dieta ricca di grassi e tenuto in gabbie separate. Il peso corporeo è stato testato una volta alla settimana. I topi erano liberi di mangiare e bere acqua. Dopo 6 settimane di alimentazione a dieta ricca di grassi, i topi del gruppo sperimentale sono stati iniettati con STZ 4 0 mg/kg per via intraperitoneale per 5 giorni consecutivi oltre alla dieta ricca di grassi gratuita ogni giorno. Il glicemia a digiuno dopo la modellazione era di 11,1 mmol/L, che era considerato un modello di diabete di successo. Trenta topi con modellazione di successo sono stati divisi in modo casuale in cinque gruppi, con sei topi in ciascun gruppo, vale a dire il gruppo del modello (Dieta ad alta grasso distillata, modello di grasso), gruppo DAPA (DAPA 4 mg/kg + dieta ad alto contenuto di grassi, dieta DAPA, a basso contenuto di kg di cdps, cdps a basso contenuto di kg, cdps a basso contenuto di kg) cdps a basso contenuto di kg di cdps, cdps-mg) CDPS ad alto dosaggio (200 mg/kg + dieta ricca di grassi, CDPS-H). Al gruppo di controllo (acqua distillata + dieta normale) è stata somministrata una quantità uguale di acqua distillata. Ogni topo è stato gavaggiato a 0,1 ml/10 g, una volta al giorno allo stesso tempo, per un totale di 4 settimane. Il peso corporeo e i cambiamenti di glucosio nel sangue dei topi sono stati registrati settimanalmente.

1.3.2 Determinazione dell'indice

Dopo 4 settimane di somministrazione di gavage, campioni di urina (24 h) e feci fresche sono stati raccolti attraverso gabbie metaboliche alla fine della 4a settimana e memorizzati rispettivamente a livello -20 e -80. I topi sono stati a digiuno ma non annaffiati per 12 ore. Il giorno successivo è stato misurato il peso corporeo a digiuno dei topi. I topi sono stati anestetizzati mediante iniezione intraperitoneale di 3 ml/kg di soluzione di idrate clorali al 10%. Il sangue è stato raccolto dalle orbite e centrifugato in una centrifuga (4 gradi, 3 500 r/min) per 15 minuti. Il surnatante è stato aspirato, confezionato e memorizzato in un frigorifero -80 per un uso successivo. Il siero è stato misurato per BUN, CRE, UA, IL -6, IL -1, TGF-, TNF- e LPS secondo il kit. L'urina è stata misurata per 24 ore UTP secondo il kit.

 

1.3.3 Osservazione morfologica e patologica di reni e intestino

1.3.3.1 Determinazione del coefficiente renale

Dopo la raccolta di sangue, i topi sono stati anestetizzati a morte per overdose e i reni e i colpi sono stati completamente rimossi e immediatamente sciacquati con soluzione salina pre-raffreddata, drenati su carta da filtro e pesati. Il coefficiente renale è stato calcolato secondo la seguente formula: coefficiente renale/%= × 100 m1m, dove M1 è il peso umido di rene/g; M è il peso corporeo del topo/g.

 

1.3.3.2 Osservazione patologica dei reni

I reni del topo sono stati fissati in fissativo paraformaldeide al 4%, disidratato dal gradiente di soluzione di etanolo, trasparente dal xilene, incorporato in paraffina, a fette (spessore 2 μm), dewaxd da xilene e idratato da etanolo gradiente e poi stabilì con ematilina ed eosina (H & e), in gradico-s-s (PASON) Sigillato e le immagini sono state raccolte e osservate al microscopio.

 

1.3.3.3 Osservazione patologica intestinale

L'intestino di topo è stato fissato con fissativo paraformaldeide al 4%, disidratato con gradiente di soluzione di etanolo, trasparente con xilene, incorporato in paraffina, a fette (spessore 2 μm), dewax con xilene e idratato con gradiente di etanolo, quindi colorato con H&E e alcian blu (AB)-PA per guarnizione e guarnizione sotto uno xilene e idratato per l'osservazione per osservazione.

 

 

1.3.4 Analisi della composizione della flora intestinale

Il contenuto del colon dei topi nel gruppo di controllo, nel gruppo modello e nel gruppo CDPS-H è stato rilevato dal sequenziamento del gene 16S rRNA ad alto rendimento. L'estrazione del DNA e la costruzione della biblioteca e il sequenziamento dei microrganismi nel contenuto del colon sono stati completati da Lianchuan Biotechnology Co., Ltd., e i dati ottenuti sono stati analizzati sulla piattaforma cloud di Lianchuan.

 

1.3.5 Rilevazione dell'espressione proteica renale e legata al colon

Le proteine ​​renali e del tessuto del colon di topo sono state estratte e la proteina è stata quantificata dal metodo di quantificazione della proteina dell'acido bicinchoninico. Dopo la denaturazione della proteina, la proteina è stata immagazzinata in un frigorifero -20 gradi. 10% di elettroforesi su gel di dodecil solfato-polyacrilammide, trasferimento di membrana di difluoruro di polivinilidene, la membrana è stata collocata in una soluzione salina tamponata Tris con tween -20 (TBST) serbatoio di incubazione e bloccata a temperatura ambiente. Rilevamento
The primary antibodies to Toll-like receptors (TLR) 4, nuclear transcription factor (NF)-κB p65, p-NF-κBp65, and -actin in kidney tissue (antibody diluted 1:2 000 (V/V) with TBST solution) and occludin and zonula occludens-1 (Zo -1) nel tessuto del colon (anticorpo diluito 1: 1 000 (v/v) con soluzione TBST) sono stati incubati a 4 gradi durante la notte. Diluizione TBST, anticorpo secondario (anticorpo
diluito con soluzione TBST 1∶ 2 000 (v/v)), incubata a temperatura ambiente per 1 ora, lavata con TBST 3 volte e quindi rilevato aggiungendo reagente luminescente ecl e l'imaging gel è stato usato per rilevare l'espressione della proteina. -Actina è stata utilizzata come riferimento interno e il valore del grigio proteico è stato analizzato dal software ImageJ. L'espressione proteica di ciascun gruppo è stata espressa come valore relativo del valore grigio del gruppo di controllo.

 

1.4 Statistiche dei dati

Tutti i risultati dei dati sono stati espressi come ± s e SPSS 21. 0 è stato utilizzato per l'analisi statistica. Per i dati continui, se hanno seguito una distribuzione normale, è stata utilizzata l'analisi a senso unico della varianza per il confronto tra gruppi. Se la differenza tra i gruppi era statisticamente significativa, il metodo della Turchia è stato ulteriormente utilizzato per il confronto a coppie; Se i dati seguivano una distribuzione normale, il test di Kruskal-Wallis H è stato utilizzato per il confronto tra gruppi. Quando c'era una differenza statistica tra i gruppi, il metodo di differenza meno significativa di Durbin è stato ulteriormente utilizzato per confronti multipli. P <0. 05 indicava che la differenza era statisticamente significativa.

 

 

2 risultati e analisi

2.1 Effetto dei CDP sulla glicemia, peso corporeo e coefficiente renale di C57BL/6J

Come si può vedere dalle tabelle da 1 a 3, rispetto al gruppo di controllo, il glicemia a digiuno dei topi nel gruppo modello è stato significativamente aumentato (P<0.01), and the kidney coefficient was significantly increased (P<0.01); compared with the Model group, CDPs- The body weight of mice in group H increased significantly after 4 weeks of administration (P＜0.05), and blood sugar began to decrease after 3 weeks of administration (P＜0.05). The kidney coefficient of mice in each intervention group decreased, and the CDPs-H group was the lowest (P<0.01); the body weight of mice in the Control group was larger than that of each group, indicating that CDPs can slow down the swelling of the kidneys of DN mice, thereby Reduce the kidney coefficient.

 

Tabella 1 Effetti dei CDP sulla glicemia dei topi (n=6)

Gruppo	Tempo/settimana
	0	1	2	3	4
Controllare	7.98±0.55	7.32±0.40	7.58±0.50	7.38±0.87	7.28±0.34
Modello	10.62±2.79#	20.32±2.69#	24.47±4.18#	24.92±3.98#	20.33±2.96#
CDPS-L	16.03±2.97	21.83±4.81	20.13±6.97	23.30±3.77	21.25±1.65
CDPS-M	13.17±3.59	22.6±5.88	19.35±4.45	22.6±4.87	18.38±1.20
CDPS-H	11.07±1.74	21.53±3.71	21.57±6.19	17.43±2.05**	15.87±0.90**
Dapa	10.28±4.75	21.12±4.96	17.72±2.00**	17.35±2.00**	14.55±1.06**

Unità: mmol/l

 

Tabella 2 Effetti dei CDP sull'indice renale dei topi (n=6)

 

Gruppo	Controllare	Modello	CDPS-L	CDPS-M	CDPS-H	Dapa
Peso renale/peso corporeo	0.98±0.04	1.69±0.17##	1.42±0.12	1.37±0.10*	1.28±0.10**	1.18±0.10**

 

Tabella 3 Effetti dei CDP sulla massa corporea dei topi (n=6)

 

Gruppo	Tempo/settimana
	0	1	2	3	4
Controllare	28.57±0.82	28.75±0.97	28.70±0.79	29.10±1.24	29.32±1.35
Modello	24.53±1.25##	24.92±1.20##	24.35±1.39##	24.82±1.22##	24.73±1.56##
CDPS-L	25.75±0.69	24.77±0.91	24.83±0.99	25.10±0.83	25.42±0.97
CDPS-M	25.10±0.56	25.00±0.54	24.68±0.48	25.13±0.62	25.25±0.58
CDPS-H	25.38±0.28	25.43±0.49	25.52±0.62	25.73±0.50	26.08±0.34*
Dapa	25.13±1.02	25.52±0.98	25.97±1.00*	26.25±0.63*	26.63±0.78*

 

 

2,2 Effetto dei CDP sulla funzione renale dei topi C57BL/6J

Come mostrato nella Tabella 4, rispetto al gruppo di controllo, le concentrazioni BUN, CRE e UA nel siero e la concentrazione di massa UTP a 24 h nelle urine dei topi nel gruppo modello sono state significativamente aumentate (P<0.01); compared with the Model group, CDPs-M and CDPs-H can significantly reduce the concentrations of BUN, Cre, and UA in serum and the 24-hour UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01). CDPs-L can significantly reduce the concentrations of BUN and UA in mouse serum. and 24 h UTP mass concentration in urine (P＜0.05, P＜0.01).

 

Tabella 4 Effetti dei CDP su BUN, CRE, UA e 24 H UTP nei topi DN (n=6)

Gruppo	Concentrazione BUN (MMOL/L)	Concentrazione CRE (μmol/L)	Contensione del contenuto UTP 24H (mg/ml)	Concentrazione di UA (μmol/L)
Controllare	47.51±7.32	12.80±1.36	1.32±0.12	103.9±18.59
Modello	157.97±30.57##	44.85±4.36##	2.38±0.37##	500.43±81.06##
CDPS-L	112.70±16.76*	40.72±3.62	1.37±0.12**	264.07±14.85**
CDPS-M	82.31±14.68**	35.37±6.21*	1.06±0.17**	247.62±11.22**
CDPS-H	64.58±8.64**	30.00±2.87**	0.65±0.17**	222.71±37.52**
Dapa	76.98±10.47**	28.82±3.72**	0.37±0.10**	129.87±17.69**

 

 

2.3 Effetto dei CDP sui fattori infiammatori e la concentrazione di massa LPS nel siero di topi C57BL/6J

 

Come mostrato nella Tabella 5, rispetto al gruppo di controllo, i livelli sierici di TNF-, IL -1, IL -6, TGF- e LPS nei topi nel gruppo modello sono stati significativamente aumentati (P<0.01); compared with the Model group, Each dose of CDPs can reduce the levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, TGF-β and LPS in serum, CDPs-M
L'effetto del gruppo CDPS-H era significativo (P ＜ 0. 0 5 o P ＜ 0. 01) e l'effetto del gruppo CDPS-H era significativo (P ＜ 0,01).

Tabella 5 Effetti dei CDP su fattori infiammatori e LPS nei topi (n=6)

 

Gruppo	Concentrazione di massa (PG/ML)
	Tnf-	Il -1	Il -6	TGF-	LPS
Controllare	111.23±5.47	125.85±11.41	112.27±10.28	152.25±7.28	116.17±15.07
Modello	167.90±16.91##	184.53±21.03##	195.57±31.88##	209.36±16.17##	173.51±15.72##
CDPS-L	144.57±10.15*	160.46±11.84*	169.10±20.32	189.03±8.02*	151.41±9.40*
CDPS-M	133.62±13.24**	154.30±17.39*	150.47±19.28*	171.25±14.35**	135.33±23.92**
CDPS-H	119.30±7.31**	140.54±16.11**	127.12±10.94**	169.47±10.57**	124.98±16.38**
Dapa	114.79±10.48**	135.17±14.37**	120.90±9.32**	159.11±10.92**	113.34±13.14**

 

 

2,4 Effetto dei CDP sulla patologia renale dei topi C57BL/6J

Come mostrato nella Figura 1, dopo la colorazione H&E, è stato scoperto che la struttura glomerulare e la morfologia dei topi nel gruppo di controllo erano normali e chiari, la membrana basale era liscia, la morfologia glomerulare era regolare, l'interstizio renale era normale, i tubuli renali erano organizzati in modo ordinato e non vi era infiltrazione cellulare. Rispetto al gruppo di controllo, il volume glomerulare dei topi nel gruppo modello è stato ingrandito, la membrana basale è stata ispessita, le cellule infiammatorie sono state infiltrate attorno a esso e i tubuli renali sono stati disordinati e dilatati; Rispetto al gruppo modello, i gruppi di somministrazione di CDPS avevano diversi gradi di miglioramento sui reni del topo. Il volume glomerulare dei topi nei gruppi CDPS-M e CDPS-H è stato significativamente ridotto, lo spessore della membrana basale è stato ridotto, solo una piccola quantità di cellule infiammatorie sono state infiltrate e i tubuli renali si sono ripresi in modo significativo e sono stati strettamente disposti. Dopo 4 settimane di intervento CDPS, le condizioni patologiche di cui sopra sono state tutte ripristinate a vari gradi.

La colorazione del Masson ha mostrato che i tubuli renali dei topi nel gruppo di controllo erano disposti normalmente e che i glomeruli erano in forma normale, non è stata osservata proliferazione di fibre di collagene e che erano visibili membrane basali tubolari; Una grande quantità di collagene colorato è stata osservata nel tessuto interstiziale renale dei topi nel gruppo modello e il tessuto fibroso interstiziale è stato bundle e proliferato reticolare; Il volume glomerulare dei topi nel gruppo CDPS-M è stato ridotto e sono stati alleviati i sintomi della proliferazione dei tessuti fibrosi; I tubuli renali dei topi nel gruppo CDPS-H sono stati disposti più regolarmente ed è stata osservata una piccola quantità di proliferazione di fibre di collagene.

I risultati della colorazione PAS hanno mostrato che i glomeruli dei topi nel gruppo di controllo erano normali in volume e intatti nella struttura; I topi nel gruppo modello avevano un danno renale, il volume glomerulare era più grande del normale e la forma era irregolare e veniva depositata la matrice mesangiale; Rispetto al gruppo modello, il danno renale dei topi in ciascun gruppo trattato con la droga è stato alleviato e, con l'aumento della dose, la forma e le dimensioni glomerulari tendevano a essere normali e il grado di deposizione di matrice mesangiale è stato ridotto. I risultati suggeriscono che i CDP possono alleviare il danno ai tessuti renali nei topi DN.

 

Fig. 1 Effetto dei CDP sui cambiamenti istopatologici renali nei topi DN esaminati da H&E, Masson e colorazione PAS (× 400)