I polisaccaridi di Cistanche Deserticola hanno un effetto neuroprotettivo

per ulteriori informazioni:Ali.ma@wecistanche.com

Yue Liu, et al

Astratto:

L'ictus ischemico è una malattia ad alta morbilità e mortalità.Cistanchedeserticopolisaccaridi(CDP) possiedono un'ampia gamma di effetti benefici, tra cui l'epatoprotezione e l'omeostasi immunitaria. Per quanto ne sappiamo, l'effetto protettivo del CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)sui neuroni danneggiati dalla deprivazione/riperfusione di ossigeno-glucosio (OGD/RP) non è stato studiato. In questo studio, OGD/RP ha danneggiato un modello cellulare PC12. In breve, CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)({{0}}.05, 0,5 e 5 ug/ml) è stato somministrato prima della riperfusione. L'effetto protettivo del CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)è stato quindi valutato sulla base della vitalità cellulare, della perdita di lattato deidrogenasi (LDH), [Ca2 più] I, potenziale di membrana mitocondriale (MMP) e apoptosi cellulare, e lo stato redox dopo la riperfusione è stato valutato saggiando specie reattive dell'ossigeno (ROS), catalasi ( CAT), glutatione perossidasi (GSH-Px) e capacità antiossidante totale. Sulla base del fatto che la proteina associata al morbo di Parkinson DJ-1 partecipa all'antiossidazione endogena e si comportaneuroprotettivoeffetti dopo l'ischemiastroke, abbiamo studiato l'interazione tra CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)e DJ{{0}}. L'espressione di DJ-1 è stata rilevata mediante analisi ELISA e Western blot e la traslocazione di DJ-1 è stata valutata mediante immunofluorescenza. I risultati hanno mostrato che il CDP (0.05, 0,5 e 5 ug/ml) attenuava la morte delle cellule PC12, preservava l'MMP e l'omeostasi del calcio; inibito lo stress ossidativo e diminuita l'apoptosi cellulare. Inoltre, il CDP (5 ug/ml) ha stimolato notevolmente la secrezione e l'espressione di DJ{10}}. Nel complesso, i risultati hanno suggerito che CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)esercita unneuroprotettivoeffetto contro il danno indotto da OGD/RP inibendo lo stress ossidativo e regolando il percorso DJ-1

Parole chiave:Cistanche deserticola, Polisaccaridi, Neuroprotettivo, Deprivazione/riperfusione di ossigeno e glucosio, Stress ossidativoDJ-1

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1. Introduzione

L'ictus ischemico è la seconda causa di mortalità e la prima causa di disabilità a lungo termine a livello globale [1]. Si prevede che i decessi per ictus saliranno a 7,8 milioni nel 2030 [2]. In Cina, da 58 a 142 su 100,000 le persone muoiono di ictus ogni anno. Pertanto, devono essere sviluppate strategie efficaci per invertire il danno da ischemia-riperfusione. Numerose evidenze supportano che lo stress ossidativo è un fattore importante che promuove lo sviluppo e la progressione dell'infarto cerebrale durante la riperfusione[3,4]. Pertanto, scoprendo efficaceneuroprotettivoagenti in grado di ridurre i ROS e sopprimere lo stress ossidativo ha suscitato un notevole interesse nella ricerca. La proteina associata al morbo di Parkinson DJ-1 media la neuroprotezione stimolando l'espressione genica anti-apoptotica e antiossidante [4,5]. DJ-1 può essere traslocato nei mitocondri dallo stress ossidativo e dalla stimolazione dei mitogeni e può essere secreto nella matrice extracellulare in condizioni patologiche, come cancro al seno, melanoma e lesioni OGD/RP [6]. Inoltre, DJ-1 è utile nel targeting terapeutico per la neurodegenerazione ischemica a causa del suo ruolo critico nell'antiossidazione [4,7]. Negli ultimi 10 anni, diversi gruppi hanno confermato che DJ-1 lo ha fattoneuroprotettivoeffetti sui modelli di ischemia cerebrale in vivofocale e sui modelli OGD/RP in vitro [6–9]. Nel frattempo, alcuni farmaci, tra cui la ciclosporina A e il fenilbutirrato di sodio, annullano la morte delle cellule neuronali tramite la sovraregolazione di DJ-1 ictus da ischemia [9,10 ].

Cistanchedesertico, la pianta secca integrale diCistanchedeserticoYCMa e Cistanche tubulosa Wight, è prodotto principalmente nelle aree desertiche del nord e nord-ovest della Cina [11]. C. deserticola è commestibile ed è stato onorato come il 'Ginseng dei deserti'. Nella prescrizione di agopunti, è usato come trattamento per malattie renali croniche, impotenza sessuale, infertilità femminile, leucorrea, metrorragia e costipazione senile [12].C. deserticola polisaccaridi, un importante componente attivo isolato daCistanche desertico. CDP, modula la funzione immunitaria e l'equilibrio lipidico e fornisce protezione contro l'invecchiamento, l'ossidazione e il danno epatico. Inoltre, CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)previene il danno da ischemia-riperfusione nel cuore e nel fegato [13,14]. Studi recenti hanno riportato che CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)sono atossici[12,15,16] e altri fitochimici estratti da C. Deserticola, inclusi echinacoside, isoacteoside, acteoside e salidroside, mostranoneuroprotettivoeffetti [11,12]. Tuttavia, il potenziale utilizzo della CDP per il miglioramento del danno da ictus ischemico non è stato segnalato.

Nel presente studio, ipotizziamo che CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)inibisce lo stress ossidativo per la neuroprotezione. I potenziali effetti protettivi della CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)i danni da ictus da inischemia sono stati esaminati utilizzando PC12cellule OGD/RP danneggiate. Sono state quindi esplorate le interazioni sottostanti associate a DJ-1.

2. Metodi

2.1. Coltura cellulare e modello OGD/RP

Le cellule PC12 sono state coltivate in terreno RPMI 1640 contenente il 10 percento di FBS a 37 gradi in un incubatore normossico contenente il 5 percento di CO2. Il mezzo è stato sostituito ogni 48 h. È stato preparato il modello OGD/RP. Le cellule PC12 sono state lavate ed esposte alla soluzione salina bilanciata di Earle. Quindi, le cellule sono state trasferite in una camera anaerobica contenente il 5 percento di CO2 e il 95 percento di N2 a 37 gradi per 4 ore e quindi lasciate sottoporre a riossigenazione. Durante questa fase, lo stesso volume di mezzo di coltura è stato aggiunto alle cellule. Dopo la riossigenazione, le cellule sono state poste su un incubatore normossico per 24 ore.

2.2. Somministrazione di farmaci

CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)è stato acquistato da Yuanye Biological Technology Co.,Shanghai, Cina (C23J7Y18405, > 98% di purezza). La nimodipina, un farmaco preventivo di prima linea per l'ictus ischemico, è stata utilizzata come composto di controllo positivo [17-19]. L'iniezione di nimodipina proveniva dalla Bayer Company. Le cellule sono state divise casualmente in sei gruppi, vale a dire il controllo, il veicolo (OGD/RP), Nimo (5 ug/ml), CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)(0,05 ug/ml), CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)(0,5 ug/ml) e CDP (5 ug/ml). Nimodipina e CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)sono stati aggiunti prima della riperfusione. Il gruppo di controllo è stato coltivato in un terreno normale e incubato in condizioni normossiche.

2.3. Vitalità cellulare: saggi MTT e NRU

Le cellule PC12 (6 × 103 per pozzetto) sono state seminate in una 96-piastra di coltura per pozzetti. Le cellule sono state trattate in conformità con i requisiti di ciascun gruppo. MTT (Solarbio, Cina) è stato aggiunto alle cellule ad una concentrazione di 5 mg/ml e incubato per 4 ore a 37 gradi. Il formazan è il prodotto di riduzione della succinato deidrogenasi nelle cellule viventi [20]. DMSO è stato aggiunto per la dissoluzione del formazan blu generato. L'assorbanza a una lunghezza d'onda di 490 nm è stata rilevata con Microplate Reader (Thermo, USA) dopo che le cellule sono state agitate per 10 minuti a 25 gradi. I risultati della vitalità cellulare si sono manifestati come percentuale del gruppo di controllo [21].

Il test di assorbimento del rosso neutro (NRU) è stato eseguito secondo il protocollo precedentemente pubblicato [22]. Al termine dei periodi di riperfusione, alle cellule è stato aggiunto il rosso neutro (Solarbio, Cina) a una concentrazione di 50 ug/ml. La miscela è stata incubata per 3 h. Quindi, le cellule sono state lavate via rapidamente con una soluzione contenente 0,5% di formaldeide e 1% di cloruro di calcio. Le cellule sono state successivamente aggiunte ad una miscela contenente 1% di acido etilico e 50% di anidrosetanolo. Le piastre sono state lette con un'assorbanza di 540 nm dopo che le cellule sono state agitate per 20 minuti a 37 gradi. I risultati della vitalità cellulare si sono manifestati come percentuale del gruppo di controllo.

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2.4. Valutazione della citotossicità

LDH è un enzima citoplasmatico che catalizza l'ossidazione del topiruvato lattato. LDH viene rapidamente rilasciato nel fluido extracellulare quando la membrana cellulare è danneggiata. Pertanto, il rilevamento dell'LDH viene solitamente eseguito per la valutazione della citotossicità. [23]. La procedura sperimentale ha seguito le istruzioni del kit commerciale fornite dal kit di analisi LDH (Jiancheng, Cina). L'assorbanza di ciascun campione è stata rilevata a 440 nm con un lettore di micropiastre. La percentuale di morte cellulare è stata calcolata utilizzando la seguente formula: Vitalità ( percentuale )=(trattamento OD - trattamento ODT in bianco)/(attività LDH max OD - attività LDH max OD in bianco) × 100 percento.

2.5. Rilevazione della concentrazione intracellulare di Ca2 più

La concentrazione intracellulare di Ca2 plus è stata misurata con Fluo-3/AM [15]. Le cellule PC12 sono state lavate con PBS tre volte e quindi incubate con 2 μM di Fluo-3/AM (Beyotime, Cina) per 30 minuti a 37 gradi al buio. Le cellule sono state quindi lavate con PBS tre volte per lo spurgo del colorante extracellulare. L'intensità della fluorescenza del Fluo-3/AM è stata determinata su un microscopio confocale a scansione laser (Olympus, Giappone). Il pacchetto software Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer e ImageJ sono stati utilizzati per il calcolo dei valori della scala di grigi

2.6. Misurazione di MMP

JC-1 (5,5′,6,6′-Tetracloro-1,1′,3,3′-tetraetil-imidacarbocianina; Beyotime, Cina) è una comoda sonda sensibile alla tensione generalmente utilizzata per la colorazione cellule e valutare MMP [24]. Le cellule PC12 sono state lavate due volte con PBS freddo e quindi incubate con una miscela contenente il 50 percento di mezzo e il 50 percento di liquido di lavoro per 15 minuti a 37 gradi al buio. Quindi, la miscela è stata scartata e sostituita da un mezzo fresco. Le immagini di fluorescenza rossa e verde sono state acquisite mediante microscopia confocale a scansione laser. La proporzione relativa dei segnali di fluorescenza rossa e verde è stata utilizzata per la misurazione MMP [25]. Pacchetto software Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer e ImageJ sono stati utilizzati per il calcolo dei valori della scala di grigi.

2.7. Saggio di rilevamento dell'apoptosi, Hoechest33342 e analisi di citometria a flusso

Hoechst33342, un colorante legante il DNA, è stato utilizzato per l'esame dell'apoptosi cellulare [26]. Dopo la riperfusione, le cellule PC12 sono state lavate con PBS tre volte e incubate con Hoechst33342 (Beyotime, Cina) a una concentrazione di 5 ug/ml per 15 minuti a 37 gradi al buio. Quindi, le cellule sono state osservate al microscopio confocale a scansione laser. Le cellule teapoptotiche hanno mostrato un'intensa fluorescenza blu e condensazione del nucleo. Per ogni esperimento di colorazione, sono stati catturati e quantificati tre campi casuali. Olympus FV10-ASW 4.1 Viewer e ImageJ sono stati utilizzati per il calcolo dei valori della scala di grigi. Le percentuali delle cellule apoptotiche sono state calcolate mediante la seguente formula: importo apoptotico/importo totale × 100 percento [27].

2.8. Misurazione della generazione di ROS

La sonda fluorescente 2′,7′-diclorofluoresceina-diacetato (DCFH-DA;Jiancheng, Cina) può penetrare nelle membrane cellulari e può essere idrolizzata in DCFH non fluorescente. Il DCFH viene ossidato dai ROS intracellulari in DCF fluorescenti [29]. Dopo la riperfusione, le cellule sono state lavate due volte con PBS e quindi incubate con DCFH-DA ad una concentrazione finale di 10 μM per 45 minuti a 37 gradi al buio. La fluorescenza è stata osservata mediante spettrofotometro afluorescenza con una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 535 nm.

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2.9. Determinazione degli indicatori di stress ossidativo: livelli CAT, GSH-Px e T-AOC

Le cellule sono state raschiate e risospese in PBS. Le sospensioni cellulari ottenute sono state sonicate 45 volte su ghiaccio e centrifugate a 1000 giri/min per 10 minuti a 4 gradi. I supernatanti sono stati trattenuti e utilizzati per il rilevamento [24]. Il contenuto proteico totale del supernatante cellulare è stato misurato con un kit di reagenti per il dosaggio delle proteine ​​BCA (KeyGEN, Cina). Le attività dei livelli di CAT, GSH-Px e T-AOC sono state misurate secondo le istruzioni dei produttori (Jiancheng, Cina). L'assorbanza di ciascun campione è stata rilevata con un lettore di micropiastre.

2.10. Misurazione della concentrazione extracellulare di DJ-1

Le cellule PC12 (6 × 103 per pozzetto) sono state seminate in 96-piastre di coltura di pozzetti. Dopo la riperfusione, il surnatante cellulare è stato raccolto e analizzato dal kit ELISA DJ-1/PARK-7 (Raybio, USA ) secondo le istruzioni del produttore [9]. L'assorbanza di ciascun campione è stata rilevata con Microplate Reader a una doppia lunghezza d'onda di 450 nm o 540 nm.

2.11. Analisi Western blot

Le proteine ​​cellulari sono state estratte con tampone di lisi ghiacciato secondo le istruzioni dei produttori (KeyGEN, Cina). La concentrazione proteica è stata determinata con un kit di reagenti per il dosaggio delle proteine ​​BCA. Uguali quantità di lisati proteici (20 ug) da ciascun gruppo sono state risolte in elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide al 12% e successivamente trasferite su una membrana di nitrocellulosa. La membrana è stata incubata con PBS contenente il 5% di latte scremato per 2 ore a temperatura ambiente e quindi sondata con anticorpi anti-PARK7/DJ-1 (ab76008, Abcam; diluizione 1:1000) durante la notte a 4 gradi. Quindi, la membrana è stata lavata tre volte con PBST e incubata con anticorpi secondari di capra anti-coniglio IgG (SA00001-2, Proteintech Group; diluizione 1:5000) a temperatura ambiente per 2 ore. Come controllo è stato considerato l'anticorpo anti- -Tubulina(10759-1-AP, Proteintech Group; diluizione 1:1000). Le bande proteiche sono state visualizzate da reagenti di reazione a chemiluminescenza (ECL) potenziati. Le densità delle bande sono state misurate con il software di analisi QuantityOne v.4.6.9.

2.12. Analisi immunocitochimica

Le cellule PC12 sono state fissate in paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente dopo il trattamento di riperfusione [9]. Dopo che l'eccessiva paraformaldeide è stata rimossa, le cellule sono state incubate in PBS contenente 0,3 percento di Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, le cellule sono state lavate con PBS tre volte prima di essere incubate con siero di capra normale al 5% per 1 ora. Le cellule sono state quindi incubate con catena monoclonale anti-ATP sintasi di topo di coniglio (MABS1304, EMD Millipore, diluizione 1:200) per la colorazione dei mitocondri e successivamente incubate con anticorpo anti-PARK7/DJ-1 (diluizione 1: 100) per il sondaggio di proteine ​​DJ-1. Le cellule sono state lavate e incubate con IgG-Alexa 488 di capra anti-coniglio (verde; A11034, Invitrogen; diluizione 1:1000) e IgG-Alexa 594 di capra anti-topo (rosso; A11032; Invitrogen; diluizione 1:1000) per 90 min. Infine, le cellule sono state lavate tre volte con PBS e montate su vetrini con un mezzo di montaggio contenente DAPI. Le immagini immunofluorescenti sono state visualizzate utilizzando un microscopio confocale a scansione laser.

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2.13. Dati/analisi statistica

Tutti i valori sono stati mostrati come media ± DS. Il significato è stato determinato da un'analisi della varianza unidirezionale (ANOVA), seguita dal test di confronto multiplo di Dunnett. p < .05="" è="" stato="" considerato="" come="" significatività="" statistica.="" i="" dati="" sperimentali="" sono="" stati="" analizzati="" utilizzando="" il="" software="" statistico="" spss="">

3. Risultati

3.1. CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)inibito il danno cellulare indotto da OGD/RP

Le cellule PC12 esposte a OGD/RP hanno mostrato una significativa diminuzione del numero. La forma cellulare è stata modificata e la membrana cellulare è stata rotta. Nel test MTT, le vitalità cellulari nel CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)i gruppi ({{0}}.05, 0,5 e 5 ug/ml) erano rispettivamente del 58,91 percento ± 5,40 percento, 61,13 percento ± 3,81 percento e 68,57 percento ± 3,24 percento, p <.05 (fig.="" 1a)="" e="" quello="" con="" il="" veicolo="" aveva="" il="" 51,68="" percento="" ±="" 3,89="" percento.="" questi="" valori="" indicavano="" che="">(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)ha protetto le cellule dal danno OGD/RP e ha ridotto la morte cellulare. Inoltre, la vitalità cellulare nel gruppo Nimo era del 77,02% ± 5,22%, che è quasi uguale a quella del CDP da 5 ug/ml(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)gruppo trattato.

Nel test NRU, le vitalità cellulari nel CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)gruppi ({{0}}.05, 0,5 e 5 ug/ml) erano rispettivamente del 52,03 percento ± 4,72 percento, 58,49 percento ± 2,50 percento e 69,17 percento ± 3,91 percento (Fig. 1B) e quello con il veicolo aveva il 47,14 percento ± 2,88 percento. I valori indicavano l'effetto protettivo della CDP dipendente dalla concentrazione.

A differenza di un veicolo (44,73 percento ± 3,30 percento), il rilascio di LDH è stato significativamente ridotto nel CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)gruppi. In CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)gruppi ({{0}}.05, 0,5 e 5 ug/ml), i tassi di perdita di LDH erano rispettivamente del 32,41% ± 3,70%, 27,13 ± 2,79% e 23,13% ± 4,59%, p < 0,01="" (fig.="" 1c).="" inoltre,="" i="" tassi="" di="" perdita="" di="" ldh="" nel="" gruppo="" nimo="" erano="" del="" 21,99%="" ±="" 4,02%,="" che="" era="" quasi="" uguale="" a="" quello="" del="" gruppo="" trattato="" con="" cdp="" da="" 5="">

3.2. CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)attenuato aumento indotto da OGD/RP di [Ca2 più]i

I livelli intracellulari di Ca2 plus nelle cellule PC12 sono stati aumentati a 4146,60 ± 195,97 dopo la lesione OGD/RP in contrasto con il gruppo di controllo (373,62 ± 75,69). Il CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)i gruppi ({{0}}.05, 0,5 e 5 ug/ml) potrebbero diminuire in modo dose-dipendente il livello intracellulare di Ca2 plus a 2921,25 ± 222,19, 2015,85 ± 230,53 e 1768,43 ± 426,12, rispettivamente (Fig. 2A e C ). Inoltre, il livello di Ca2 plus nel gruppo trattato con 5 ug/ml CDP è diminuito a un livello paragonabile a quello del gruppo Nimo (1591,19 ± 213,21).

3.3. CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)dissipazione attenuata indotta da OGD/RP di MMP

Rispetto al gruppo di controllo (1,67 ± 0.89), il gruppo del veicolo (0.48 ± 0.10) ha mostrato più fluorescenza FL verde rispetto a FL rossa fluorescenza (Fig. 2B e D). I rapporti tra la fluorescenza FL rossa e verde sono stati ridotti a 1,11 ± 0,26 e 1,18 ± 0,16 nel CDP da 0,5 e 5 ug/ml(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)rispettivamente dei gruppi trattati, p < .01.="" la="" fluorescenza="" fl="" verde="" è="" stata="" significativamente="">

3.4. CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)impedito l'apoptosi cellulare indotta da OGD/RP

Le cellule che esibivano cromatine condensate o nuclei frammentati sono state classificate come cellule apoptotiche [30]. I risultati del test Hoechst33342 hanno rivelato la comparsa di nuclei condensati dopo OGD/RP (Fig. 3A e C). Un'elevata intensità di fluorescenza FL è stata osservata nei nuclei del gruppo veicolo. L'intensità della fluorescenza FL dei nuclei è stata indebolita nel CDP da 5 ug/ml(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)gruppo trattato. Abbiamo analizzato il tasso apoptotico nelle cellule PC12 mediante citometria di compagni utilizzando la doppia colorazione FITC-Annexin V/PI (Fig. 3B e D). Il gruppo di controllo aveva un tasso di apoptosi cellulare del 4,16% ± 0,24%, mentre il gruppo del veicolo aveva il 22,98% ± 0,66%. Nel gruppo trattato con 5 ug/ml di CDP, il tasso di apoptosi cellulare era del 7,86 percento ± 1,16 percento.

3.5. CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)accumulo di ROS intracellulare indotto da OGD/RP attenuato e stato redox preservato

Gli effetti della CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)sullo stress ossidativo sono stati dimostrati sulla base della generazione di ROS, delle attività di GSH-Px, CAT e dei livelli di T-AOC. I livelli di ROS nelle cellule PC12 danneggiate da OGD/RP sono aumentati e sono diventati significativamente superiori a quelli del gruppo di controllo (p <.01). nel="" frattempo,="" i="" livelli="" di="" ros="" nel="">(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)i gruppi ({{0}}.05, 0,5 e 5 ug/ml) sono diminuiti in modo dose-dipendente (p <.01; fig.="" 4a).="" inoltre,="" cdp="" ha="" anche="" aumentato="" significativamente="" i="" livelli="" di="" t-aoc="" (p=""><.05; fig.="" 4b),="" cat="" (p=""><.05; fig.="" 4c)="" e="" gsh-px="" (p=""><.05; fig.="" 4d)="" rispetto="" al="" veicolo="" gruppo.="" le="" attività="" degli="" antiossidanti="" endogeni="" nella="">(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)i gruppi sono aumentati.

3.6. CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)ha stimolato la secrezione di DJ-1 e ha migliorato l'espressione di DJ-1

Sono state rilevate variazioni di concentrazione di DJ-1 nel surnatante cellulare e sono state rivelate le possibili relazioni tra DJ-1 e CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi). Il rilascio di DJ-1 è stato osservato dalle cellule PC12 danneggiate da OGD/RP (Fig. 5). DJ-1 è stato notevolmente sovraregolato nel CDP da 5 ug/ml(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)-trattato (38,66 ± 8,44 pg/ml) ed è aumentato significativamente rispetto a quello nel gruppo veicolo (18,33 ± 3,80 pg/ml, p <.01) e nel gruppo di controllo (9,67 ± 3,96 pg/ml, p <.01) .

Per studiare gli effetti della CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)sull'espressione intracellulare di DJ-1, abbiamo misurato i livelli di proteine ​​DJ-1 mediante Western blotting. I livelli di espressione della proteina DJ-1 sono aumentati significativamente 24 ore dopo la riperfusione. Al contrario, il post-trattamento con CDP da 5 ug/ml ha migliorato significativamente la sovraespressione di DJ-1 rispetto al gruppo del veicolo (p <.01, fig.="">

3.7. CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)traslocazione migliorata del DJ-1 nei mitocondri

Le cellule PC12 sono state colorate con anticorpi anti-PARK7/DJ-1 e anti-ATP sintasi-catena (Figg. 7 e 8). L'anticorpo anti-ATP sintasi - catena si lega al complesso mitocondriale I e l'antigene legante sono stati localizzati nella membrana interna mitocondriale. I risultati hanno rivelato che DJ-1 si è traslocato nella membrana interna mitocondriale dopo l'insulto OGD/RP (Fig. 8). Nel frattempo, i risultati della doppia colorazione di DJ-1 e mitocondri hanno rivelato che il CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)traslocazione e co-localizzazione mitocondriale facilitata di DJ- 1 (Fig. 8). Questi risultati hanno indicato l'interazione diretta tra DJ-1 eneuroprotettivoeffetto della CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)(Fig. 9).

4. Discussione

In questo studio, abbiamo riportato in prima persona che CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)riduce efficacemente il danno cellulare PC12 indotto da OGD/RP tramite la sovraregolazione della proteina DJ-1. CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)miglioramento della vitalità cellulare, riduzione del danno della membrana cellulare, mantenimento dell'omeostasi intracellulare di Ca2 più, prevenzione della perdita di MMP, diminuzione dell'apoptosi cellulare, soppressione dello stress ossidativo, promozione dell'espressione di DJ-1 e potenziamento della traslocazione di DJ-1 nei mitocondri. DJ-1 è stato recentemente coinvolto nella regolamentazione dineuroprotettivoeffetto e integrità mitocondriale. Questi risultati hanno fornito prove convincenti delneuroprotettivoeffetti della CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)contro l'ischemia Inoltre, l'interazione tra CDP e DJ-1 riproduce aneuroprotettivoruolo nel danno cellulare PC12 indotto da OGD/RP. I risultati di cui sopra possono sviluppare la nostra comprensione dell'effetto benefico della CDP e possono fornire informazioni utili per la terapia dell'ictus in futuro.

L'ictus ischemico è stato attribuito a una serie complessa di meccanismi biochimici e molecolari, tra cui eccitotossicità, sovraccarico di calcio e stress ossidativo [31]. OGD/RP è ampiamente utilizzato come modello in vitro di ischemia-riperfusione e viene utilizzato per l'esplorazione di cambiamenti neurologici e biochimici. La linea cellulare PC12 è sensibile al danno OGD/RP [2]. Esibisce una serie di proprietà e caratteristiche dei neuroni simpatici [32] e quindi linee cellulari neuronali ampiamente utilizzate per la ricerca relativa ai meccanismi del danno neurologico dovuto all'ictus [33,34]. Numerosi studi hanno indicato che lo stress ossidativo svolge un ruolo vitale nell'ictus e nel danno da ischemia cerebrale [35-37]. La proteina associata al morbo di Parkinson DJ-1 può inibire la neurodegenerazione ischemica e la disfunzione comportamentale riducendo il danno neuronale mediato da ROS [7]. Pertanto, abbiamo utilizzato il modello cellulare PC12 OGD/RP-lesione per studiare ilneuroprotettivoeffetto della CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi).

Il grado di lesione nelle cellule PC12 indotte da OGD/RP è stato valutato mediante saggi di rilascio di MTT, NRU e LDH. Amministrazione di CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)({{0}}.05, 0,5 e 5 ug/ml) ha migliorato la sopravvivenza cellulare e ha ridotto il rilascio di LDH. Gli effetti benefici del trattamento con CDP includevano anche una diminuzione del sovraccarico di calcio intracellulare e la conservazione della MMP. Anomalie della concentrazione intracellulare di Ca2 più, in particolare il sovraccarico di calcio mitocondriale, sono state collegate all'apoptosi neuronale e alla morte indotta da ictus ischemico [38]. La MMP può riflettere l'efficienza della catena di trasporto degli elettroni ed è stata indicata come indice di disturbo patologico di questo sistema [39]. Sia l'aumento della concentrazione intracellulare di Ca2 più che la perdita di MMP possono portare alla destabilizzazione della struttura neuronale e alla fine causare danni cellulari o morte cellulare [21,40]. In questo studio, i risultati hanno dimostrato che CDP ha inibito significativamente il sovraccarico intracellulare di Ca2 più e aumentato i livelli di MMP nelle cellule PC12 con lesioni OGD/RP. L'apoptosi gioca un ruolo vitale nella complessa fisiopatologia del danno da ischemia-riperfusione cerebrale. Dati crescenti hanno suggerito che l'apoptosi è stata implicata nella disfunzione mitocondriale; la dissipazione di MMP è un evento precoce con conseguente apoptosi cellulare [8,39]. L'apoptosi è un processo di morte cellulare programmata dipendente dall'energia per smaltire le cellule ridondanti. Molti neuroni nell'ictus ischemico subiranno l'apoptosi [41]. In questo studio, abbiamo eseguito la colorazione Hoechst33342 e Annexin V-FITC/PI per esaminare l'effetto della CDP sull'apoptosi [23,28]. I risultati hanno mostrato che il CDP mantiene l'integrità del nucleo e diminuisce il tasso di apoptosi cellulare. Tutti questi risultati hanno indicato che l'attività anti-apoptotica del CDP ha contribuito all'effetto benefico nel danno neuronale nelle cellule PC12.

Le cellule subiscono un danno da ischemia causato da un eccessivo accumulo di ROS, che può portare a perossidazione lipidica, danni alla membrana cellulare, sovraccarico di calcio e disfunzione mitocondriale, con conseguente apoptosi cellulare e morte [42]. Anche il consumo di antiossidanti endogeni, come SOD, CAT e GSH-Px, ha indicato l'occorrenza Fig. 9. Possibili meccanismi per gli effetti protettivi della CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)contro il danno cellulare PC12 indotto da OGD/RP. Il trattamento della CDP sopprime lo stress ossidativo, stabilizza la concentrazione di Ca2 più e MMP, migliora l'espressione e la localizzazione di DJ-1 nei mitocondri. Y. Liu et al. Biomedicina e farmacoterapia 99 (2018) 671–{7}}di stress ossidativo durante l'ischemia-riperfusione. In questo studio, il gruppo OGD/RP ha mostrato un aumento significativo di ROS e una diminuzione di CAT, GSH-Px e T-AOC rispetto al gruppo trattato con 5 ug/ml di CDP. Tuttavia, abbiamo osservato sostanziali diminuzioni nei tassi di generazione di ROS e consumo di antiossidanti endogeni (CAT, GSH-Px e T-AOC) nei gruppi CDP. Gli effetti benefici nel gruppo CDP 5 ug/ml erano vicini a quelli del gruppo Nimo. I risultati hanno suggerito che il CDP inibisce la generazione di ROS e ripristina la difesa antiossidante enzimatica.

DJ-1 è una chiave redox-reattivaneuroprotettivoproteina implicata nella regolazione dello stress ossidativo nell'ictus. Gli effetti benefici della sovraespressione di DJ{0}} includono la sopravvivenza cellulare dall'ischemia-riperfusione e la conservazione della funzione e della morfologia mitocondriale, come la precipitazione dell'apertura dei pori di transizione della permeabilità dei mitocondri [39,43]. Studi precedenti hanno indicato che l'effetto protettivo di DJ-1 nelle cellule esposte a OGD/RP è correlato alle sue proprietà antiossidanti e alla traslocazione dei mitocondri [43-45]. DJ-1 esegue un'efficiente neuroprotezione endogena nel mitigare i difetti mitocondriali tramite la traslocazione [46]. Diversi studi hanno indicato che la traslocazione di DJ-1 può avere un effetto sul movimento mitocondriale, migliorare l'interazione cellula-cellula e promuovere altri processi di sopravvivenza cellulare.

DJ-1 influenza diversi processi, come migrazione e adesione cellulare, chemiotassi, proliferazione e apoptosi, sia in modelli in vitro che in vivo [6,9,47,48]. Utilizzando il modello di ictus delle cellule PC12 ferite OGD/RP, abbiamo esplorato una potenziale relazione tra CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)e DJ-1. La sovraespressione di DJ- 1 è stata identificata mediante ELISA e Western blotting. Insieme a questa funzione, un risultato importante negli esperimenti ha dimostrato che la significativa sovraespressione di DJ-1 si verificava quando CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)(5 ug/ml) è stato somministrato prima della riperfusione. Questo ha suggerito un possibileneuroprotettivoeffetto nel rapporto tra CDP e DJ-1. Inoltre, abbiamo osservato che DJ-1 situato nei mitocondri in condizioni di OGD/RP e abbondante espressione di DJ-1 diminuiva la sensibilità cellulare ai ROS e inibiva lo stress ossidativo [45]. I risultati hanno implicato che la CDP regola e migliora il DJ-1, che funge da collegamento molecolare tra la disfunzione dei mitocondri e lo stress ossidativo e fornisce una progressione della morte cellulare secondaria inerente all'ictus [5,47,49-51]. In tandem con la stabilizzazione di DJ-1 nei mitocondri, CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)il trattamento ha aumentato la sopravvivenza cellulare, stabilizzato il Ca2 più l'omeostasi, ha migliorato la dissipazione di MMP e previene l'apoptosi correlata ai mitocondri [43]. Nel complesso, i nostri risultati hanno indicato che CDP esercita un romanzoneuroprotettivomeccanismo nel trattamento dell'ictus ischemico.

5. conclusione

I nostri risultati hanno indicato che CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)protegge le cellule PC12 dal danno indotto da OGD/RP attraverso i suoi effetti antiossidanti, che sono parzialmente attribuiti alla via mediata da DJ-1. Questi effetti includono una diminuzione del tasso di danno della membrana cellulare, la conservazione dell'omeostasi [Ca2 più ] I, il miglioramento della dissipazione di MMP, l'inibizione dell'apoptosi cellulare, l'attenuazione dei ROS intracellulari e la modulazione dei livelli di DJ-1. I risultati hanno inoltre indicato che le interazioni tra CDP e DJ-1 amplificano la neuroprotezione e mantengono l'integrità mitocondriale. Pertanto, i neuroni vulnerabili possono essere protetti da CDP(Cistaanchedeserticopolisaccaridi)attraverso il miglioramento dell'espressione di DJ{0}} durante l'ictus ischemico.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (sovvenzione 81360649), dal National Science and Technology Key Program (sovvenzione 2015BAK45B01) e dal programma di supporto scientifico e tecnologico della regione autonoma di Ningxia Hui (sovvenzione 2016BZ07).

Cistanche deserticola polisaccaridiavere un Effetto neuroprotettivo

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