I glicosidi feniletanoidi di Cistanche Tubulosa inducono l'apoptosi nelle cellule di carcinoma epatocellulare H22 attraverso vie di segnalazione sia estrinseche che intrinseche

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Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li e Jinyao Li

Astratto

Sfondo:Cistanche tubulose(Schenk) R. Wight è una medicina tradizionale cinese che parassita le radici della pianta di Tamarix ed è stata usata per trattare l'impotenza maschile, la sterilità, la debolezza del corpo e come tonico. Tuttavia, il suo effetto antitumorale sul carcinoma epatocellulare è ancora sfuggente. Qui, abbiamo studiato l'effetto antitumorale diC. tubulosa glicosidi feniletanoidi(CTPG) su cellule di carcinoma epatocellulare H22 sia in vitro che in vivo e suoi meccanismi. Metodi: La morfologia, la vitalità, l'apoptosi, il ciclo cellulare e il potenziale della membrana mitocondriale (Δψm) delle cellule H22 sono stati analizzati rispettivamente mediante microscopia invertita, test MTT e citometria a flusso. L'espressione e l'attivazione delle proteine ​​nella via dell'apoptosi sono state rilevate mediante Western blot. L'effetto antitumorale in vivo è stato valutato in un modello murino tumorale stabilito utilizzando topi Kunming maschi. Risultati: il trattamento con CTPG ha soppresso significativamente la crescita delle cellule H22 in modo dose e tempo-dipendente, che era correlato all'aumento dell'apoptosi e all'arresto del ciclo cellulare nelle fasi G0/G1 e G2/M. Inoltre, è stata osservata condensazione cromosomica nelle cellule H22 trattate con CTPG. Il trattamento con CTPG ha aumentato significativamente il rapporto Bax/Bcl-2, ha ridotto Δψm e ha migliorato il rilascio del citocromo c. I livelli di caspasi-8 e caspasi-9 scissi nelle vie di segnalazione sia estrinseca che intrinseca sono stati significativamente aumentati che la caspasi-7 e -3 attivate in modo sequenziale scinde PARP. Infine, CTPG (Cistanchetubulosaglicosidi feniletanoidi) ha inibito la crescita delle cellule H22 nei topi e migliorato il tasso di sopravvivenza dei topi tumorali. Conclusioni: questi risultati hanno suggerito che il CTPG ha soppresso la crescita delle cellule H22 attraverso percorsi di apoptosi sia estrinseca che intrinseca.

Sfondo

Il cancro al fegato si è classificato al sesto posto per incidenza di cancro e al quarto per decessi per cancro in tutto il mondo. Inoltre, si è classificato quarto per incidenza di cancro e primo per mortalità per cancro nei paesi con un basso indice sociodemografico [1]. In Cina, il cancro al fegato è la terza causa di morte per cancro nel 2015 [2]. Più del 90 per cento dei tumori primari del fegato sono carcinoma epatocellulare (HCC) nel mondo [3]. Attualmente, la resezione epatica è l'opzione principale per la terapia dell'HCC. Tuttavia, meno del 30% dei pazienti con carcinoma epatocellulare ha soddisfatto i criteri della resezione epatica curativa e il tasso di sopravvivenza globale di 5-anni è ancora basso del 35-50% a causa dell'alto tasso di recidiva [4, 5 ]. La disponibilità di opzioni terapeutiche per i pazienti con carcinoma epatocellulare da intermedio ad avanzato è molto limitata. Sorafenib, un farmaco a bersaglio molecolare, è stato approvato dalla FDA come trattamento di prima linea per l'HCC avanzato. Tuttavia, sorafenib prolunga solo circa 3 mesi di sopravvivenza e il tasso di risposta è inferiore al 4% [6, 7]. È urgente sviluppare nuovi farmaci o strategie contro l'HCC. La medicina tradizionale cinese (MTC) da sola o combinata con altre strategie è stata utilizzata per trattare l'HCC e ha mostrato i benefici clinici tra cui il tempo di sopravvivenza prolungato, il miglioramento della qualità della vita, la riduzione delle reazioni avverse e così via [8, 9].Cistanche, una specie di MTC, ha varie funzioni biologiche, comeantiossidante, antinfiammatorio, antietà,e neuroprotezione [10, 11]. I glicosidi feniletanoidi sono stati considerati i principali componenti attivi diCistanche, che hanno diverse attività tra cui antiossidante, antinfiammatoria, epatoprotezione e neuroprotezione [12-15]. Il nostro gruppo lo ha segnalatoCistanche tubulosa glicosidi feniletanoidi(CTPG) potrebbe indurre l'apoptosi nelle cellule di melanoma B16-F10 e inibire la crescita di tumori nei topi [16]. In questo studio, abbiamo misurato l'effetto antitumorale del CTPG sulle cellule HCC H22 sia in vitro che in vivo e ne abbiamo studiato i meccanismi. Abbiamo scoperto che CTPG induceva l'apoptosi nelle cellule H22 attraverso vie di segnalazione sia estrinseche che intrinseche e sopprimeva la crescita dei tumori H22 nei topi.

Metodi

Linea cellulare

Le cellule di carcinoma epatocellulare H22 di topo sono state ottenute dallo Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Xinjiang University (Urumqi, Xinjiang, China) e coltivate in terreno RPMI 1640 (Gibco) integrato con 100 U/ml di penicillina e 100 ug/ml streptomicina e siero bovino fetale inattivato al calore del 10% (Gibco) a 37 gradi in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2.

Saggio MTT

Il CTPG è stato acquistato da Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, Cina) e i principali composti del CTPG sono stati qualificati e quantificati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni [16]. La vitalità cellulare è stata valutata da 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) (Sigma, St. Louis, MO , USA). Le cellule H22 sono state inoculate in 96-piastre a pozzetti a una densità di 2 × 104 cellule in 100 ul di mezzo per pozzetto e coltivate a 37 gradi. Dopo 24 h, le cellule sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG (0, 100, 200, 300 e 400 ug/ml) o 0,3 percento di DMSO (uguale a quello in 400 ug/ml CTPG) rispettivamente per 24, 48 e 72 h . Dopo centrifugazione a 1000 rpm per 7 minuti, il surnatante è stato scartato e a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 100 ul di soluzione MTT (5 mg/ml in PBS). Le piastre sono state incubate a 37 gradi per 4 ore e sono stati aggiunti 100 ul di DMSO per sciogliere i cristalli di formazano formati. I valori OD490 sono stati rilevati da un lettore di micropiastre a pozzetti 96- (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). La vitalità cellulare è stata calcolata secondo la formula: Vitalità cellulare ( percentuale )=(trattata con OD/non trattata) × 100 percento.

Rilevazione dell'apoptosi

Le cellule H22 sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG (0, 100, 200, 300 e 400 ug/ml) o 0,3 percento di DMSO per 24 ore, quindi colorate con Annexin V FITC/ Kit di rilevamento dell'apoptosi di ioduro di propidio (PI) (YEASEN, Cina) secondo le istruzioni del produttore. I campioni sono stati analizzati mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur, USA).

Rilevazione del potenziale di membrana mitocondriale

Le cellule H22 sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG (0, 200 e 400 ug/ml) per 24 ore, quindi colorate con il colorante JC-1 permeabile alla membrana (Beyotime, Cina) per 20 min a 37 gradi. Dopo aver lavato due volte con il tampone JC-1, i campioni sono stati risospesi con 300 ul di tampone JC-1 e analizzati mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur, USA).

Analisi del ciclo cellulare

Le cellule H22 sono state inoculate in piastre di coltura da 60 mm e trattate con diverse concentrazioni di CTPG (0, 100, 200, 300 e 400 ug/ml) o 0,3% di DMSO per 24 ore Tutte le cellule sono state raccolte e lavate due volte con PBS. Le cellule sono state fissate in etanolo ghiacciato al 70% a -20 gradi per 2 ore e lavate due volte con PBS, quindi risospese in 300 ul di tampone di colorazione ioduro di propidio/RNasi (BD Biosciences). Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, i campioni sono stati raccolti mediante citometria a flusso (BD FACSCalibur, USA) e la distribuzione del ciclo cellulare è stata analizzata con il software ModFit LT 3.0.

Colorazione Hoechst 33.258

I cambiamenti morfologici dei nuclei delle cellule H22 sono stati analizzati mediante colorazione Hoechst 33.258 del colorante legante il DNA permeabile alla membrana. Le cellule H22 sono state seminate in una 6-piastra a pozzetti alla concentrazione di 1 × 105 cellule/pozzetto in un mezzo da 2 ml. Dopo il 60% ~ 70% di confluenza, le cellule sono state trattate con CTPG (0, 100, 200, 300 e 400 ug/ml) per 24 ore. Le cellule sono state raccolte e fissate con paraformaldeide ghiacciata al 4% a 4 gradi per 10 minuti. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state colorate con Hoechst 33.258 (Beyotime, Cina) a 4 gradi per 10 minuti. I campioni sono stati osservati da un microscopio a fluorescenza invertito (Nikon Eclipse Ti-E, Giappone).

Macchia occidentale

Anti-caspase-3, anti-cleaved caspase-3, Anti-Bcl-2 e anti-Bax sono stati acquistati da Beyotime Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Anti-caspase-7, anti-caspase-7, anti-caspase-8, anti-caspase-8, anti-caspase-9, anti -cleaved-caspase-9, anti-PARP, anti-cleaved PARP, IgG-HRP anti-topo e IgG-HRP anti-coniglio sono stati acquistati da Cell Signaling Technology. L'anti{28}}actina è stata acquistata da Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Pechino, Cina).

Le cellule H22 sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG (0, 100, 200, 300 e 400 ug/ml) o 0,3% di DMSO per 24 ore. Le cellule sono state raccolte e lisate con la soluzione di lisi cellulare RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) per 30 minuti su ghiaccio. I campioni sono stati centrifugati (12,000 g per 15 minuti a 4 gradi) per raccogliere i supernatanti e le concentrazioni proteiche sono state misurate con il kit BCA (Thermo Fisher Scientific, USA). Una uguale quantità di proteine ​​in ciascun campione è stata isolata dal 12% di SDS-PAGE e trasferita su membrane PVDF (Biosharp, Cina). Dopo il blocco con il tampone TBST contenente il 5% di latte scremato, le membrane sono state incubate con anticorpi primari corrispondenti e anticorpi secondari coniugati rispettivamente con perossidasi di rafano (HRP). Dopo il lavaggio con TBST, le proteine ​​target sono state rilevate dal kit di analisi ECL (Beyotime, Cina).

Animali e dichiarazione etica

6-8 topi maschi Kunming vecchi di settimane sono stati acquistati dall'Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Cina). I topi sono stati tenuti in una struttura standard per animali dell'Università dello Xinjiang a temperatura controllata e sottoposta a ciclo leggero. Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università dello Xinjiang. Il protocollo è stato approvato dal Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali dello Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (BRGE-AE001), Xinjiang University.

Studio sui topi tumorali

Per l'induzione del modello murino tumorale, i topi Kunming maschi sono stati iniettati per via sottocutanea con 1 × 106 cellule H22 in 100 ul PBS nel fianco destro. Dopo 3 giorni, i topi sono stati divisi casualmente in 3 gruppi (7 topi/gruppo). Al gruppo di controllo è stato iniettato 0,1 ml di DMSO per via sottocutanea attorno al tumore. I gruppi CTPG-200 e CTPG{10}} sono stati iniettati per via sottocutanea con 200 o 400 mg/kg di CTPG in 0,1 ml di DMSO attorno al tumore. I topi sono stati trattati ogni 2 giorni per un massimo di 21 giorni. Le dimensioni del tumore sono state misurate utilizzando calibri fino a 25 giorni e il volume del tumore è stato calcolato secondo la formula: volume del tumore (mm3)=(lunghezza×larghezza2)/2. Dopo 25 giorni, la sopravvivenza dei topi tumorali è stata monitorata ogni giorno fino alla fine di questo studio.

analisi statistica

La significatività statistica è stata calcolata mediante l'analisi unidirezionale della varianza tra i gruppi di trattamento e di controllo. Tutti i dati sono stati espressi come media ± deviazione standard (DS). p < 0.05="" è="" stato="" considerato="" statisticamente="">

Risultati

CTPG ha ridotto la vitalità delle cellule H22 in vitro

Per esplorare l'effetto antitumorale del CTPG sull'HCC, le cellule H22 sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG (0, 100, 200, 300 e 400 ug/ml) in vitro. Dopo 24 ore, la morfologia delle cellule H22 è stata osservata utilizzando un microscopio invertito. Abbiamo scoperto che la morfologia delle cellule H22 è stata drasticamente modificata dal trattamento CTPG. Con l'aumento della concentrazione di CTPG, le cellule sono diventate piccole e rotonde e anche il numero di cellule è stato notevolmente ridotto (Fig. 1a). Il test MTT è stato utilizzato per analizzare la vitalità delle cellule H22 dopo il trattamento con CTPG rispettivamente per 24, 48 e 72 ore. Il CTPG ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule H22 in modo dose-dipendente e dipendente dal tempo (Fig. 1b). Il CTPG a 300 ug/ml è arrivato al miglior tasso inibitorio (Fig. 1c). I valori di IC50 di CTPG per le cellule H22 sono 236 ug/ml a 24 ore e 169,8 ug/ml a 48 ore.

CTPG ha indotto l'apoptosi nelle cellule H22

Per studiare se la ridotta vitalità delle cellule H22 è mediata dall'induzione dell'apoptosi, le cellule H22 sono state trattate con diverse concentrazioni di CTPG (0, 100, 200, 300 e 400 ug/ml) per 24 ore e colorate con PI e Annexin V. I risultati della citometria a flusso hanno mostrato che il CTPG ha indotto significativamente l'apoptosi delle cellule H22 (inclusa l'apoptosi precoce e tardiva) in modo dose-dipendente (Fig. 2a). Sebbene l'alta dose di CTPG abbia anche aumentato significativamente la necrosi delle cellule H22, la necrosi gioca un ruolo minore nell'inibizione della crescita delle cellule H22 a causa della sua proporzione inferiore (8,3 percento) rispetto a quella dell'apoptosi (52,6 percento). Inoltre, le proteine ​​totali delle cellule H22 sono state isolate dopo il trattamento con CTPG e le espressioni del linfoma a cellule B anti-apoptotico 2 (Bcl-2) e della proteina X associata a BCL-2-pro-apoptotico (Bax) sono state rilevate da Macchia occidentale. I dati di scansione in scala di grigi hanno mostrato che i livelli di espressione di Bax e Bcl-2 erano rispettivamente aumentati e diminuiti. Il rapporto Bax/Bcl-2 è stato notevolmente aumentato (Fig. 2b). Questi risultati suggeriscono che CTPG induce l'apoptosi nelle cellule H22.

Il CTPG induce la condensazione cromosomica e l'arresto del ciclo cellulare nelle cellule H22

È stato riportato che il danno al DNA e l'arresto del ciclo cellulare indotto dai farmaci possono inibire la crescita delle cellule tumorali e causare apoptosi nelle cellule tumorali [17, 18]. Per rilevare la morfologia dei nuclei nelle cellule H22 dopo il trattamento con CTPG per 24 ore, le cellule H22 sono state colorate da Hoechst 33.342 e osservate mediante microscopia a fluorescenza invertita. Le cellule trattate con CTPG hanno mostrato un aumento dose-dipendente della cromatina dei nuclei brillantemente condensata, mentre le cellule non trattate hanno mostrato nuclei colorati in modo omogeneo (Fig. 3a). La distribuzione del ciclo cellulare nelle cellule H22 è stata ulteriormente analizzata mediante colorazione PI dopo il trattamento con CTPG per 24 ore. Come mostrato in Fig. 3b, il trattamento con CTPG ha aumentato significativamente la proporzione di cellule della fase G0/G1- e G2/M e ha ridotto significativamente la proporzione delle cellule della fase S, suggerendo che il CTPG ha indotto la G 0/G1 e arresto di fase G2/M nelle cellule H22. L'alta dose di CTPG ha anche aumentato significativamente la proporzione di cellule sub G1.

Il CTPG ha ridotto il potenziale della membrana mitocondriale e ha aumentato il rilascio del citocromo c

La via mitocondriale-dipendente gioca un ruolo importante nell'induzione dell'apoptosi [19, 20]. I cambiamenti del potenziale della membrana mitocondriale (Δψm) possono essere monitorati mediante la colorazione JC-1 a causa dell'aggregato JC-1 (fluorescenza rossa) che può disintegrarsi in monomero (fluorescenza verde) con la riduzione di Δψm [21]. Dopo il trattamento con CTPG per 24 ore, le cellule H22 sono state colorate con il colorante JC- 1. I dati della citometria a flusso hanno mostrato che la fluorescenza rossa nel canale FL-2 e la fluorescenza verde nel canale FL-1 erano significativamente diminuite e aumentate durante il trattamento con CTPG. La proporzione di cellule PE-FITC plus è stata significativamente aumentata (Fig. 4a), suggerendo che CTPG ha ridotto il Δψm nelle cellule H22. Ciò è coerente con l'aumento del rapporto Bax/Bcl-2. Di conseguenza, abbiamo osservato che il rilascio del citocromo c era significativamente aumentato durante il trattamento con CTPG (Fig. 4b). Questi risultati hanno indicato che il CTPG potrebbe indurre parzialmente l'apoptosi nelle cellule H22 attraverso una via mitocondriale (intrinseca).

CTPG ha attivato la via della caspasi e ha impedito la riparazione del DNA

Successivamente, è stata analizzata l'attivazione della caspasi indotta da CTPG tramite vie di segnalazione sia estrinseche che intrinseche. Dopo il trattamento con CTPG per 24 ore, le proteine ​​​​totali sono state isolate dalle cellule H22 e i livelli di pro-e caspasi tagliate sono stati rilevati mediante Western blot. Rispetto al controllo non trattato o DMSO, il trattamento con CTPG ha sovraregolato in modo significativo non solo il livello di caspasi scissa-8 (via estrinseca) ma anche il livello di caspasi scissa-9 (via intrinseca) (Fig. 5). In sequenza, le caspasi attivate-8 e -9 hanno scisso la pro-caspasi a valle-3 e -7 osservate in Fig. 5. La caspasi attivata-3 ha scisso il DNA enzima di riparazione della poli (ADP-ribosio) polimerasi (PARP) per prevenire la riparazione del DNA e accumulare danni al DNA come osservato in Fig. 3a.

Questi risultati hanno indicato che l'apoptosi indotta da CTPG nelle cellule H22 attraverso vie di segnalazione sia estrinseche che intrinseche.

CTPG sopprime la crescita di H22 HCC in vivo e migliora il tasso di sopravvivenza dei topi tumorali

Infine, l'effetto antitumorale del CTPG sull'HCC è stato valutato in un modello murino tumorale, che è stato stabilito mediante iniezione sottocutanea di cellule H22. Dopo 3 giorni di iniezione di cellule H22, i topi tumorali sono stati trattati con CTPG 8 volte. Il peso corporeo dei topi e le dimensioni del tumore sono stati monitorati nei punti temporali indicati. Come mostrato in Fig. 6a, il peso corporeo dei topi in ciascun gruppo non ha differenze significative, suggerendo che le dosi selezionate di CTPG non hanno effetti collaterali evidenti. È interessante notare che la crescita del tumore nei topi trattati con 200 mg/kg e 400 mg/kg di CTPG è stata significativamente inibita (Fig. 6b). Inoltre, le due dosi di trattamento con CTPG hanno notevolmente migliorato la sopravvivenza dei topi tumorali (3/7, 3/7) rispetto al gruppo di controllo (0/7) alla fine dell'esperimento (Fig. 6b). Abbiamo anche scoperto che il CTPG ha migliorato significativamente la proliferazione degli splenociti isolati dai topi Kunming maschi in modo dose-dipendente (Fig. 6c), suggerendo che il CTPG ha un effetto immunostimolante.

Discussione

La MTC è stata utilizzata per il trattamento di varie malattie, inclusi i tumori, per una lunga storia. È stato riportato che la MTC può indurre l'apoptosi in diversi tipi di cellule tumorali attraverso vie di segnalazione sia estrinseca (mediata dal recettore della morte) che intrinseca (dipendente dai mitocondri) per esercitare effetti antitumorali [22-25]. I due percorsi possono attivare rispettivamente la caspasi-8 e -9 [24, 26]. Qui, abbiamo scoperto che CTPG sopprimeva significativamente la crescita delle cellule H22 attraverso l'induzione dell'apoptosi e l'arresto del ciclo cellulare. I livelli di caspasi scissa-8 e -9 sono stati significativamente sovraregolati dal trattamento con CTPG, suggerendo che le vie di segnalazione sia estrinseca che intrinseca erano coinvolte nell'induzione dell'apoptosi. Il nostro studio precedente ha mostrato che il CTPG ha indotto l'apoptosi nelle cellule F10 del melanoma B16- attraverso la via mitocondriale che aumentava il livello della caspasi scissa-9 ma non della caspasi-8 [16]. Il CTPG potrebbe attivare vie di segnalazione distinte in diversi tipi di cellule tumorali.

L'integrità della membrana mitocondriale è strettamente regolata dai membri della famiglia di proteine ​​BCL-2 tra cui Bax e Bcl-2 [27, 28]. Il rapporto tra Bax e Bcl-2 gioca un ruolo fondamentale nel percorso dell'apoptosi mitocondriale [29]. Nelle cellule H22 trattate con CTPG, il rapporto Bax/Bcl-2 era significativamente sovraregolato, il che potrebbe causare la riduzione di Δψm e il rilascio del citocromo c osservato in questo studio. Di conseguenza, la pro-caspase-9 è stata scissa e attivata. Infine, gli iniziatori della caspasi attiva-8 e -9 hanno attivato il carnefice della caspasi-3 per fendere PARP per impedire la riparazione del DNA. Presi insieme, questi risultati hanno suggerito che l'apoptosi indotta da CTPG nelle cellule H22 attraverso vie di segnalazione sia estrinseche che intrinseche.

Nel modello murino tumorale, CTPG ha soppresso significativamente la crescita dell'HCC H22 e ha notevolmente migliorato la sopravvivenza dei topi tumorali. È interessante notare che il CTPG ha promosso in modo dose-dipendente la proliferazione di splenociti dai topi Kunming, il che è coerente con il nostro studio precedente [16].

Questi risultati hanno suggerito che il CTPG potrebbe sopprimere la crescita dell'HCC H22 nei topi sia attraverso l'effetto antitumorale diretto che il potenziamento immunitario indiretto.

Conclusioni

Il CTPG ha soppresso la crescita delle cellule H22 sia in vitro che in vivo e ha indotto l'apoptosi nelle cellule H22 attraverso vie di segnalazione sia estrinseche che intrinseche. Questi dati hanno indicato che il CTPG potrebbe essere un potenziale candidato per il trattamento dell'HCC.