La Cistanche Tubulosa protegge i neuroni dopaminergici attraverso la regolazione dell'apoptosi e del fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali: in vivo e in vitro-Ⅰ

INTRODUZIONE

La malattia di Parkinson (PD) è una malattia neurodegenerativa comune che si verifica negli anziani con manifestazioni patologiche di perdita di neuroni dopaminergici nella substantia nigra (SN) a causa della degenerazione. La gravità della malattia è correlata alla perdita di cellule neuronali dopaminergiche (DA) nel SN, il che è coerente con l’ipotesi che il processo neurodegenerativoil processo progredisce per molti anni prima che compaiano i sintomi (Sawle e Myers, 1993). La natura progressiva della malattia suggerisce interessanti possibilità di intervento terapeutico bloccando il processo neurodegenerativo sottostante. La ricerca di azioni potenti e specifiche indotte dalla terapia di fattori neurotrofici sulla sopravvivenza dei neuroni DA è quindi di notevole interesse.

CISTANCHE TUBULOSA NATURALI PER PROTEGGERE I NEURONI DOPAMINERGICI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

I fattori neurotrofici sono proteine ​​essenziali, tra cui il fattore di crescita nervoso (NGF), il fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e il fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali (GDNF), che promuovono la crescita dei nervi, lo sviluppo neurologico, la guida assonale e la funzione neuronale. Tra tutti i fattori neurotrofici che proteggono e promuovono la riparazione dei neuroni dopaminergici, il GDNF ha gli effetti più forti (Hong et al., 2008; Rangasamy et al., 2010; Allen et al., 2013). È stato dimostrato che il GDNF possiede potenti effetti neurotrofici sui neuroni DA in vitro (Lin et al., 1993) e esercita effetti neuroprotettivi in ​​vivo. È stato dimostrato che GDNF salva i neuroni DA nigral dalla morte cellulare indotta da lesioni dopo assotomia chirurgica o indotta da tossine nei ratti (Beck et al., 1995; Kearns and Gash, 1995; Sauer et al., 1995) e parzialmente anche dopo amministrazione sistemica diN-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetraidropiridina (MPTP)nei topi (Tomac et al., 1995). L'aumentata incidenza dell'apoptosi neuronale e i ridotti effetti protettivi dei fattori neurotrofici, potenzialmente innescati da vari fattori patologici, sono alla base della degenerazione dei neuroni dopaminergici (Holden et al., 2006).

C. tubulosa è un medicinale erboristico originario di diverse piante del genere Cistanche. È un'importante opzione terapeutica per la sindrome da insufficienza renale che è strettamente correlata agli ormoni androgeni nella medicina tradizionale cinese (MTC). Ad oggi, numerose ricerche cliniche e di base sulla C. tubulosa hanno dimostrato l'attività delle malattie neurodegenerative. L’identificazione delle prescrizioni di tonificazione renale della MTC nel trattamento della malattia di Parkinson può quindi fornire un trattamento clinico alternativo per la malattia di Parkinson.Echinacoside (ECH)è un importante componente bioattivo presente nell'erba medicinale C. tubulosa. Gli studi hanno dimostrato gli effetti terapeutici dei glicosidi di Cistanche ed ECH,verbascoside(VER) e icariina (ICA) su pazienti con malattia di Alzheimer (AD), PD e altri pazienti con demenza vascolare (Urano e Tohda, 2010; Wang et al., 2013; Wu et al., 2014). Wu et al. (2014) hanno suggerito che gli estratti di C. tubulosa che contenevano abbastanza ECH e acteoside miglioravano la disfunzione cognitiva causata da A -42 bloccando la deposizione di amiloide e invertendo la funzione neuronale dopaminergica colinergica e ippocampale. Tao et al. (2015) lo hanno scopertoglicosidi feniletanoidida C. tubulosa (Ph Gs-Ct) ha prevenuto l'edema cerebrale ad alta quota diminuendo l'espressione della proteina e dell'mRNA di AQP4 nel tessuto cerebrale dei modelli di ratto.

SNACK NATURALI ALL'ESTRATTO DI CISTANCHE TUBULOSA MIGLIORANO LA MEMORIA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Studi precedenti hanno dimostrato che i composti vegetali cinesi, inclusi i tre ingredienti di C. tubulosa, epimedium e rhizoma polygonati, alleviano il danno ai neuroni dopaminergici e aumentano i livelli di dopamina regolando l'espressione di fattori neurotrofici (Wu et al., 2013). Pertanto, non è ancora noto se gli effetti neuroprotettivi indotti da C. tubulosa siano di lunga durata e in che misura il salvataggio dei neuroni DA nigral mediante la somministrazione di GDNF possa consentire una significativa conservazione dei comportamenti motori rilevanti per la sintomatologia degli animali PD. Questo studio ha utilizzato una ricetta tonificante per i reni della medicina tradizionale cinese, la nanopolvere di C. tubulosa, che ha ricevuto un brevetto nazionale (numero di brevetto: 2011103028541) in Cina e ha precedentemente mostrato un certo effetto terapeutico nella malattia di Parkinson. Il presente studio, pertanto, è stato progettato per esaminare gli effetti neuroprotettivi e rigenerativi del trattamento con C. tubulosa e per studiare l'apoptosi sulle cellule MES23.5 e sui ratti comportamentali definitivi e la regolazione del GDNF, misurata da una batteria di test target .

MATERIALI E METODI

Materiali, reagenti e attrezzature

C. tubulosa è stata acquistata da Beijing Tong Ren Tang Group, Co., Ltd., Pechino, Cina. ECH, VER e ICA provenivano dagli Istituti nazionali per il controllo degli alimenti e dei farmaci, Cina. La linea cellulare neuronale dopaminergica MES23.5 è stata un dono del professor Biao Chen, Laboratorio di Neurobiologia, Capital Medical University, Pechino, Cina. Cinquanta topi maschi C57BL/6 (del peso di 20-25 g ciascuno) sono stati acquistati da Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd. (numero di licenza: SCXK2012-0002), Shanghai, Cina.

MPP+, MTT e glutammina sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA); Il siero bovino medio e fetale DMEM/F12 è stato acquistato da Gibco Co. (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA); e MPTP, standard DA e standard di acido omovanillico (HVA) sono stati acquistati da Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, USA). -actina, Bax, Bcl2, GDNF, recettore della famiglia GDNF alfa (GFR 1) e anticorpi Ret sono stati acquistati da Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA, USA); Il kit di reagenti per la colorazione della 3,3'-diaminobenzidina (DAB) è stato acquistato da Fuzhou Maixin Biotech., Ltd. (Fujian, Cina); e il kit di preparazione del campione di gel SDS-PAGE, il kit di rilevamento ultrasensibile della chemiluminescenza avanzata (ECL) e il test dell'acido bicinconinico (BCA) sono stati acquistati dal Beyotime Institute of Biotechnology (Pechino, Cina).

Questo studio ha utilizzato i seguenti strumenti: lettore di micropiastre ELX800 (Bio Tek Winooski, VT, USA); Incubatore a CO2 (Heraeus, Hanau, Germania); Sistema di analisi di imaging su gel Gel DOC 2000, cella per elettroforesi e serbatoio per elettroforesi (Bio-Rad, Hercules, CA, USA); analizzatore di proteine ​​DU-650 (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA); Centrifuga refrigerata ad alta velocità 5417R (Eppendorf, Amburgo, Germania); Mulino planetario a sfere doppio SXQM (Changsha, Tencan Powder Technology Co., Ltd, Hunan, Cina); Mulino miscelatore MM400 (Retsch GmbH, Haan, Germania); Cromatografia liquida ad alte prestazioni Agilent 1200 (HPLC; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA); Elettroforesi PowerPac Basic, sistema di trasferimento transmembrana PowerPac Basic, imager a chemiluminescenza Universal Hood II, sistema di trascrizione inversa dell'RNA Thermal Cycler S1000 (Bio-Rad); Sistema di analisi di immagini di tessuti e cellule Motic Med 6.0 (Motic China Group, Co., Ltd, Xiamen, Cina).

Preparazione diC. tubulosaNanopolvere

C. tubulosa è stata pesata, quindi purificata e disidratata. Dopo la polverizzazione convenzionale, la polvere fine di C. tubulosa è stata fatta passare attraverso un setaccio a 200- maglie e liofilizzata. Per preparare la nanopolvere di C. tubulosa sono stati utilizzati un vuoto a temperatura controllata e un mulino a sfere ad alta energia. Innanzitutto, la nanopolvere grezza di C. tubulosa è stata collocata in un serbatoio di macinazione a sfere sotto vuoto caricato con sfere di macinazione in carburo. Il rapporto tra le sfere di macinazione e la nanopolvere di C. tubulosa variava da 15:1 a 5:1. Per ottenere una polvere fine, la velocità e la durata del mulino a sfere ad alta energia sono state impostate rispettivamente su 300 giri al minuto e 20 minuti. La polvere fine è stata pesata per la lavorazione di materiali su scala nanometrica e lavorata nel mulino miscelatore con una frequenza di 25/s e un'oscillazione di 20 s per tre ripetizioni. PBS è stato utilizzato per sciogliere e preparare una soluzione madre da 25 mg/mL, seguita da 30 minuti di ultrasuoni, autoclavaggio e infine conservazione a -20°C.

Controllo di qualità dei componenti attivi diC. tubulosamediante HPLC

ECH e VER contenevano eluizione in gradiente con silice legata con ottadecilsilano come riempitivo, metanolo come fase mobile A e soluzione di acido formico 0,1% come fase mobile B. La lunghezza d'onda di rilevamento era 330 nm. L'ICA conteneva un'eluizione in gradiente con silice legata con ottadecilsilano come riempitivo e acetonitrile-acqua (30:70) come fase mobile. La lunghezza d'onda di rilevamento era di 270 nm. Il campione, il controllo e il controllo negativo sono stati misurati come 10 µl ciascuno per il test.

Coltura cellulare e test MTT per misurare la vitalità dell'MPP+-Cellule trattate

Le cellule MES23.5 sono state inoculate con siero fetale di vitello al 5%, glutammina all'1%, soluzione di 50× Sato al 2% e terreno DMEM/F12 con penicillina/streptomicina al 2%. Sono stati incubati a 37◦C in un incubatore a CO2 al 5% con umidità satura. Le cellule sono state isolate e fatte passare con trypsin allo 0,25% e la sospensione cellulare è stata raccolta nella fase di crescita logaritmica. Cellule isolate con una densità di 1 × 105 sono state seminate in piastre a pozzetti 96-rivestite di polilisina, seguite dall'aggiunta di diverse concentrazioni finali (6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 e 800 µmol/L ) dei mezzi MPP+. Le cellule MES23.5 incubate con terreno di coltura normale per 24 ore e 48 ore sono state utilizzate come controlli negativi negli esperimenti in vitro. Le cellule dei diversi gruppi di trattamento sono state incubate con il reagente MTT per 4 ore. La soluzione nei pozzetti è stata successivamente scartata e sono stati aggiunti 150 µl di DMSO e fatti oscillare per 10 minuti. L'assorbanza di ciascun campione ad una lunghezza d'onda di 570 nm è stata misurata utilizzando un lettore automatico di micropiastre. La percentuale di vitalità cellulare (%)=assorbanza media del gruppo sperimentale/assorbanza media del gruppo di controllo negativo × 100%.

Concentrazioni rilevanti di terreno MPP+ sono state aggiunte per il trattamento di 24-ora in cellule MES23.5 utilizzando lo stesso approccio della coltura in vitro. Dopo il trattamento la soluzione presente nel pozzetto è stata scartata. Supporti contenenti diverse concentrazioni (10, 50, 100, 200, 250, 500 e 1000 µg/mL) di nanopolvere di C. tubulosa sono stati aggiunti alle cellule MES23.5 in pozzetti diversi e lasciati incubare per 24 ore e 48 ore. Le cellule MES23.5 incubate con terreno di coltura normale per 24 ore e 48 ore sono state utilizzate come controlli negativi. Le cellule MES23.5 che sono state incubate con il mezzo MPP+ sono state utilizzate come veicolo. Le misurazioni sono state effettuate in triplicato per ciascun campione. L'assorbanza dei corrispondenti gruppi di trattamento e di controllo è stata misurata per calcolare la vitalità cellulare.

ESTRATTO NATURALE DI CISTANCHE TUBULOSA ANTIFATICA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Espressione TH misurata mediante immunocitochimica

Quando la nanopolvere di C. tubulosa era in 100, 200 e 250 µg/ml, il tasso di sopravvivenza cellulare è aumentato in modo significativo (Figura 2G). Pertanto, negli esperimenti successivi, abbiamo testato le tre concentrazioni: gruppi a basso dosaggio, a dosaggio medio e ad alto dosaggio. Sono state testate tre repliche per ciascuno dei gruppi di C. tubulosa. I vetrini coprioggetto sterilizzati e rivestiti di polilisina sono stati posizionati in piastre a pozzetti 6-. Successivamente, 5 × 104 cellule sono state seminate in ciascun pozzetto e incubate per 24 ore. Il mezzo fresco convenzionale è stato sostituito nel gruppo di controllo normale e una concentrazione finale di 100 µmol/L di mezzo MPP+ è stata sostituita nei restanti gruppi di trattamento per incubare per 24 ore. I terreni freschi convenzionali sono stati quindi sostituiti nei gruppi di controllo normale e veicolo e le concentrazioni finali di 100, 200 e 250 µg/mL di nanopolvere di C. tubulosa sono state incubate con le cellule per 24 ore nei gruppi a dose bassa, moderata e alta. Gruppi di trattamento con C. tubulosa, rispettivamente. Le cellule MES23.5 nei diversi gruppi sono state lavate tre volte in PBS per rimuovere il surnatante e ulteriormente fissate in paraformaldeide al 4% per 15 minuti. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state incubate con un bloccante della perossidasi a 37°C per 30 minuti e poi lavate nuovamente con PBS. Per la permeabilizzazione cellulare è stata utilizzata una soluzione di Triton X-100 allo 0,2% per 10 minuti, seguita da lavaggio con PBS. A ciascun campione è stato aggiunto siero di capra normale e incubato a temperatura ambiente per 30 minuti. Il siero di capra normale è stato quindi rimosso e l'anticorpo primario diluito 1:400 in PBS è stato aggiunto a ciascun campione e incubato a 4°C durante la notte. Le cellule nel gruppo di controllo negativo sono state incubate con PBS a 4°C durante la notte. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state incubate con anticorpi secondari marcati con biotina nella camera umida a 37°C per 20 minuti. Ciascun campione è stato quindi lavato in PBS ed etichettato con coniugati di perossidasi di rafano e streptavidina (soluzione di lavoro C) a 37°C per 20 minuti. Dopo il lavaggio con PBS, le cellule sono state colorate con il reagente DAB al buio per circa 1-10 minuti e lo sviluppo di un colore marrone è stato monitorato al microscopio ottico. Ciascun campione è stato quindi lavato due volte in acqua distillata per 1–2 minuti e i nuclei sono stati controcolorati con una soluzione di ematossilina per 0,5–1 minuto. Dopo aver risciacquato accuratamente ciascun campione in acqua, le cellule sono state immerse in alcool di acido cloridrico all'1% per la differenziazione e ammoniaca acquosa all'1%, seguite da un lavaggio accurato delle cellule in acqua. Le cellule di ciascun campione sono state quindi disidratate in etanolo al 70% per 2 minuti, etanolo all'80% per 2 minuti, etanolo al 90% per 2 minuti due volte, etanolo al 95% per 2 minuti due volte ed etanolo al 100% per 2 minuti due volte. Le cellule sono state quindi immerse in una soluzione di xilene per 2 minuti due volte e montate su un vetrino con resine neutre. Al microscopio ottico, ciascun campione è stato sottoposto all'acquisizione di immagini e alla selezione casuale di 5-10 campi visivi efficaci per determinare l'espressione di proteine ​​selezionate nei neuroni dopaminergici indicati dall'intensità delle particelle marroni e per semi-quantificare il contenuto proteico in base al suo valore medio di grigio .

Tasso di apoptosi delle cellule MES23.5 misurato mediante citometria a flusso

Le cellule aderenti sono state lavate una volta con PBS. Per l'isolamento delle cellule, è stata aggiunta una quantità adeguata di soluzione di trypsin priva di EDTA a temperatura ambiente e la soluzione è stata pipettata delicatamente per consentire alle cellule aderenti di staccarsi. È stato quindi aggiunto un mezzo di coltura cellulare per arrestare la trypsinizzazione. La miscela è stata trasferita in una nuova provetta da centrifuga e quindi centrifugata per 5 minuti a 1500 giri al minuto per raccogliere le cellule isolate. Dopo aver scartato il surnatante, il pellet cellulare è stato delicatamente risospeso utilizzando PBS e le cellule sono state contate. Circa 1 × 105 - 5 × 105 cellule risospese sono state centrifugate per 5 minuti a 1500 giri al minuto e il surnatante è stato scartato. Cinque microlitri di soluzione legante l'Annessina V-FITC sono stati aggiunti al pellet cellulare per risospendere delicatamente le cellule. Altri 5 µl di Annexin V-FITC sono stati aggiunti e miscelati accuratamente. Cinque microlitri di soluzione di ioduro di propidio sono stati utilizzati per la colorazione cellulare mediante incubazione a temperatura ambiente per 10 minuti poco prima della citometria a flusso.

Analisi Western Blot perin vitro

Le cellule sono state divise in un gruppo normale, gruppo di trattamento MPP+, a basso dosaggioC. tubulosagruppo di trattamento, gruppo di trattamento con C. tubulosa a dose moderata e gruppo di trattamento con C. tubulosa ad alte dosi. In ciascuno è stata misurata l'espressione di Bcl2 e Bax. Un totale di 1 × 105 cellule per pozzetto nella piastra a pozzetti 6- è stata utilizzata per la modellazione e il trattamento in ciascun gruppo prima della raccolta delle cellule. È stato aggiunto un lisato misto, contenente tampone RIPA, inibitore della proteasi e inibitore della fosfatasi, per lisare le cellule per 30 minuti su ghiaccio. Dopo la centrifugazione, il surnatante è stato utilizzato per l’analisi delle proteine. La proteina totale è stata quantificata utilizzando un test BCA e separata mediante SDS-PAGE al 10%. Le proteine ​​separate sono state trasferite su una membrana e incubate con un tampone bloccante il latte scremato al 5% a temperatura ambiente per 2 ore. La membrana è stata quindi incubata in anticorpo primario (Bcl-2 0.34 mg/ml, Bax 0,11 mg/ml, diluizione 1:200) a 4°C durante la notte. Dopo una fase di lavaggio, la membrana è stata incubata in un anticorpo secondario (0,5 mg/ml, diluizione 1:5000) a 4°C per 1 ora e poi nello sviluppatore ECL per 2 minuti per lo sviluppo convenzionale. Il software Quantità Uno è stato utilizzato per l'analisi semiquantitativa dell'espressione proteica.

CISTANCHE NATURALI TUBULOSA ANTIFATICA PROTEZIONE FEGATO PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Modellazione animale sperimentale e somministrazione di farmaci

Cinquanta topi maschi di 8-settimana privi di agenti patogeni specifici sono stati divisi casualmente in cinque gruppi: un gruppo normale, un gruppo di trattamento con MPTP (veicolo), un gruppo di trattamento con C. tubulosa a basse dosi, un gruppo di trattamento con C. tubulosa a dosi moderate. gruppo di trattamento con C. tubulosa ad alte dosi. Gli animali sono stati stabulati a una temperatura di 20–22◦C con libero accesso a cibo e acqua. Ai topi del gruppo normale è stato iniettato per via intraperitoneale un uguale volume di soluzione salina normale per sette giorni consecutivi. Ai topi degli altri gruppi di trattamento è stato iniettato per via intraperitoneale MPTP (30 mg/kg/giorno) per sette giorni consecutivi per stabilire i veicoli.

Durante la modellazione della PD, ai topi nei gruppi di trattamento con C. tubulosa a dose bassa, moderata e alta sono stati somministrati per via intragastrica volumi clinici equivalenti di 4 g/kg/giorno, 8 g/kg/giorno e 16 g/giorno. kg/gNanopolvere di C. tubulosa, rispettivamente, per 14 giorni consecutivi. Ai topi nei gruppi di controllo e veicolo sono stati somministrati per via intragastrica volumi equivalenti di soluzione salina normale per 14 giorni consecutivi. Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Etico dell'Università della MTC del Fujian e sono state eseguite secondo i principi accettati a livello internazionale per l'uso e la cura degli animali da laboratorio. In questo studio sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza degli animali.