Il cistanoside di Cistanche Herba migliora il danno riproduttivo maschile indotto dall'ipossia attraverso la soppressione dello stress ossidativo-Ⅱ

Effetti di Cis sulla vitalità cellulare GC-1 indotta dall'ipossia in vitro.

Per verificare se Cis può prevenire gli effetti inibitori dell'ipossia sulla vitalità delle cellule GC{{0}}, è stato eseguito un test CCK-8. Le cellule GC-1 sono state trattate con diversi sottotipi (Cis-A, B, C, H) e intervalli di concentrazione (0.02 μM, 0.2 μM, 2 μM) di Cis per 72 h. Un confronto tra il gruppo modello e il gruppo DMSO ha mostrato che DMSO non promuoveva direttamente la vitalità cellulare GC{{10}} (Figura 2A). Tuttavia, la vitalità cellulare è stata notevolmente ripristinata (P < 0.05) con i trattamenti Cis. Rispetto al gruppo modello, Cis-A, Cis-B, Cis-C e Cis-H hanno tutti mostrato alcuni effetti protettivi sul danno indotto dall'ipossia alla vitalità cellulare GC-1, mentre Cis-B ha mostrato i più significativi effetto (Figura 2A). Gli effetti protettivi di Cis a 0.2 μM erano significativamente più alti degli effetti protettivi di Cis a 0.02 μM, mentre la differenza tra 2 μM e 0,2 μM non era evidente, indicando che il ripristino La vitalità cellulare GC-1 indotta da Cis ha dimostrato un aumento dose-dipendente nell'intervallo di concentrazione da 0,02-0,2 μM (Figura 2A). Pertanto, in base alle esigenze sperimentali, 0,2 μM di Cis è stata selezionata come concentrazione ottimale nei seguenti esperimenti in vitro. Per confermare ulteriormente se le cellule germinali fossero effettivamente protette da Cis, è stata eseguita la colorazione FCM e Ki-67 per valutare l'alterazione della proliferazione delle cellule GC-1 dopo il trattamento con Cis. Dopo il trattamento Cis, la proporzione di cellule GC-1 nella fase G1 è stata ridotta. Al contrario, più cellule sono entrate nella fase S, suggerendo che il trattamento con Cis potrebbe aumentare l'indice di proliferazione delle cellule germinali (P <0,01; Figura 2B). Le statistiche per il ciclo cellulare GC-1 sono mostrate nella Figura 2Bb. I risultati della colorazione Ki-67 hanno mostrato anche che il trattamento con Cis-A, Cis-B, Cis-C e Cis-H ha migliorato significativamente il rapporto delle cellule positive al Ki-67- dei GC indotti dall'ipossia{{54} } cellule in vitro (Figura 2C).

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Il meccanismo di Cis protegge le cellule germinali dall'ipossia in vitro.

Per indagare se gli effetti protettivi di Cis sulle cellule GC-1 fossero correlati alla rimozione di ROS eccessivi, è stato utilizzato il colorante fluorescente DCFH-DA per rilevare i livelli di ROS in ciascun gruppo. Come mostrato nelle Figure 3A e 3B, il trattamento con DMSO non ha modificato il contenuto di ROS intracellulari o il livello di LPO rispetto al gruppo modello. Tuttavia, i livelli di ROS nelle cellule GC-1 erano marcatamente ridotti nei gruppi trattati con Cis (Figura 3A). Inoltre, è stata osservata una diminuzione dell'LPO anche nelle cellule GC-1 sottoposte a Cis (Figura 3B).

Per esplorare ulteriormente il meccanismo mediante il quale Cis protegge le cellule germinali dal danno ipossico, sono state eseguite la colorazione TUNEL e le analisi Western blot per valutare l'apoptosi. La colorazione TUNEL (Figura 3C) ha mostrato un'apoptosi significativa nel modello e nei gruppi DMSO. Tuttavia, con il trattamento con Cis sono state osservate meno cellule apoptotiche, il che indica che il trattamento con Cis riduce l'apoptosi delle cellule GC-1. Inoltre, è stata misurata l'espressione di PARP, Caspase-3, Bax e Bcl-2 per corroborare il meccanismo molecolare. Come presentato nella Figura 3D, Caspase-3 e PARP sono stati attivati ​​nelle cellule GC-1 sotto ipossia e questa attivazione è stata inibita dal trattamento con Cis. Inoltre, il rapporto Bax/Bcl-2 era più alto nel gruppo modello rispetto al gruppo di controllo e il trattamento con Cis ha ridotto il rapporto Bax/Bcl-2 (Figura 3D). Questi dati hanno indicato che Cis aveva una potenziale capacità di attenuare il danno ossidante indotto dall'ipossia e questo effetto protettivo potrebbe essere ottenuto riducendo l'accumulo di ROS e inibendo l'attivazione della via dell'apoptosi correlata alla Caspase.

Il meccanismo enzimatico che inibisce l’OS coinvolge gli spazzini dei radicali liberi come la glutatione reduttasi (GR), la glutatione perossidasi (GPx) e la superossido dismutasi (SOD) [23]. Il meccanismo enzimatico che inibisce l’OS svolge un ruolo essenziale nel prevenire il danno ossidativo nelle cellule e nei tessuti [23]. Per convalidare ulteriormente il potenziale meccanismo di inibizione di Cis dell'OS indotta dall'ipossia nelle cellule GC-1, sono state misurate le attività di GR, GPx e SOD. I risultati hanno rivelato che le attività GR, GPx e SOD sono tutte significativamente (P < 0.01, Figura 3E) diminuite in ipossia rispetto ai gruppi di controllo e il trattamento con Cis ha ripristinato marcatamente le loro attività in Cellule GC-1 esposte all'ipossia (P <0,05, Figura 3E), suggerendo che questi composti potrebbero attivare il potente sistema antiossidante endogeno.

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Effetti di Cis sulla riproduzione nei ratti indotti da ipossia ipobarica.

Per determinare gli effetti dell'ipossia ipobarica sui ratti maschi, abbiamo prima testato le alterazioni morfologiche dei testicoli nei ratti indotti dall'ipossia ipobarica. I risultati della colorazione con HE hanno mostrato che nel gruppo di controllo, le cellule spermatogeniche normali a vari stadi erano disposte in modo ordinato dalla membrana basale al lume e gli spermatozoi maturi erano visibili nei lumi dei tubuli (Figura 4A). Rispetto ai controlli, nel gruppo modello sono state osservate alterazioni patologiche del tessuto testicolare, la membrana basale delle cellule epiteliali testicolari era disposta in modo lasco, l'epitelio spermatogenico era estremamente sottile e il livello e il numero delle cellule germinali erano marcatamente ridotti (Figura 4A) . Tuttavia, il trattamento con Cis ha migliorato notevolmente l'istologia del danno testicolare indotto dall'ipossia ipobarica in vivo (Figura 4A). Abbiamo anche misurato il peso corporeo, il peso dei testicoli, il peso dell'epididimo e il peso delle vescicole seminali, che hanno portato al calcolo dell'indice degli organi riproduttivi (il rapporto organo riproduttivo/peso corporeo). Come mostrato nella Figura 4B-D, l'indice degli organi riproduttivi (testicoli, epididimo e ghiandola delle vescicole seminali) era nettamente inferiore nel gruppo modello (P <0.01) rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, l'effetto dell'ipossia ipobarica sull'indice degli organi riproduttivi dei ratti è stato invertito con il trattamento con Cis (Figura 4B-D).

Successivamente, sono stati misurati anche l'attività dell'enzima acrosomiale e il tasso di spermatozoi vivi di sperma di ratto maschio per chiarire il danno alla funzione testicolare. Come mostrato nelle Figure 4E, 4F, l'attività degli enzimi acrosomiale e la motilità degli spermatozoi erano inferiori nei ratti del gruppo modello rispetto al gruppo di controllo (P < 0.01). Tuttavia, rispetto ai ratti nel gruppo modello, l'attività degli enzimi acrosomiale è stata ripristinata nei ratti trattati con 8 mg/kg/giorno di Cis (P < 0,05) (Figura 4D). Inoltre, come mostrato nella Figura 4F, anche il trattamento con Cisaumentato il tasso di sperma vivo; i ratti trattati con 8 mg/kg/giorno di Cis hanno tutti mostrato un tasso di spermatozoi vivi significativamente aumentato (55,83 ± 6,03%, P < 0.05; 69,{ {8}} ± 2,29%, P < 0,01; .

Nel loro insieme, questi risultati suggeriscono che l’ambiente ipossico ipobarico porta ad alterazioni morfologiche testicolari, perdita di peso degli organi riproduttivi e danni alla funzione testicolare nei ratti maschi, e Cis potrebbe proteggere efficacemente gli organi riproduttivi dai danni indotti dall’ipossia.

Effetti di Cis sull'OS nei testicoli di ratti ipobarici indotti da ipossia.

I livelli di ROS e LPO nei testicoli dei ratti sono stati misurati per analizzare gli effetti di Cis sull'OS indotta dall'ipossia ipobarica. L'analisi dei ROS ha rivelato che rispetto al gruppo di controllo, i livelli di ROS nei testicoli del gruppo modello erano significativamente aumentati (P ​​< 0.01 Figura 5A). Al contrario, l'LPO era drammaticamente elevato nei testicoli (P <0.01) in ipossia ipobarica rispetto alle condizioni normossiche (Figura 5B). Tuttavia, il trattamento con Cis ha alterato i cambiamenti di cui sopra (P <0,05), in cui Cis-B ha esercitato effetti migliori rispetto ad altri Cis (Figura 5A, 5B). Cis sembrava proteggere i testicoli riducendo l'OS in condizioni ipossiche ipobariche in vivo.

Inoltre, sono state eseguite analisi dell'apoptosi per valutare ulteriormente il meccanismo mediante il quale Cis proteggeva dal danno alla funzione testicolare indotto dall'ipossia ipobarica. I risultati della colorazione TUNEL (Figura 5C) hanno mostrato che esisteva un'apoptosi significativa nel gruppo modello rispetto al gruppo di controllo. Tuttavia, dopo il trattamento con Cis (8 mg/kg/giorno), si sono verificate meno cellule apoptotiche (P < 0.05) (Figura 5C). I dati Western blot hanno anche mostrato che l'ipossia e il trattamento ipobarico hanno portato all'attivazione di Caspase-3 e PARP e ad un aumento del rapporto Bax/Bcl-2 nel tessuto testicolare, indicando un aumento dell'apoptosi (Figura 5D). Inoltre, diversi tipi diTrattamento Cisapoptosi significativamente ridotta nel tessuto testicolare (Figura 5D). Allo stesso modo, l'analisi IHC del tessuto testicolare ha mostrato risultati simili (Figura 1 supplementare).

Per verificare il meccanismo dell'OS ridotta in Cis innescata dall'ipossia ipobarica, abbiamo ulteriormente testato le attività di GR, GPx e SOD nel tessuto testicolare. Come mostrato nella Figura 5E, rispetto al gruppo di controllo, il trattamento dell'ipossia ipobarica ha ridotto significativamente le attività GR, GPx e SOD (P < 0.01). Tuttavia, il trattamento con Cis ha ripristinato le attività enzimatiche (GR, GPx e SOD) del tessuto testicolare nei ratti trattati con ipossia ipobarica (P <0,05). In conclusione, Cis sembrava proteggere i testicoli attivando un potente meccanismo di difesa enzimatica antiossidante endogeno in condizioni di ipossia ipobarica.

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Discussione

Nelle aree ad alta quota, è noto che l’ipossia ipobarica colpisce più sistemi negli esseri umani, compreso il sistema riproduttivo maschile [4, 20]. Recenti indagini sperimentali sono orientate alla comprensione dei meccanismi con cui l'ipossia ipobarica danneggia il sistema riproduttivo maschile. In questo studio è stato studiato l’effetto terapeutico dell’estratto Cis di Cistanches Herba sul danno riproduttivo indotto dall’ipossia. I risultati hanno dimostrato che Cis può proteggere il sistema riproduttivo maschile dal danno ipossico riducendo l’accumulo di ROS e l’OS indotti dall’ipossia migliorando l’attività degli enzimi antiossidanti endogeni.

I ROS sono radicali liberi derivati ​​dall’ossigeno che svolgono un ruolo vitale nella fisiologia e patologia umana. Basse dosi di ROS sono essenziali percapacitazione degli spermatozoi, la reazione acrosomiale e la fusione spermatozoi-ovociti [24, 25]. Tuttavia, un eccessivo accumulo di ROS spesso porta a danni alle cellule germinali e alle cellule stromali, con conseguente infertilità maschile [26]. I ROS possono facilmente danneggiare le membrane cellulari, gli acidi nucleici, le proteine, gli enzimi e altre macromolecole biologiche attraverso la perossidazione. Inoltre, portano anche a potenziali danni cellulari e al DNA quando superano la capacità di trasporto degli antiossidanti. Le prove accumulate supportano il ruolo chiave dei ROS nella patogenesi della fertilità maschile [27, 28]. La produzione di ROS è regolata dalla tensione dell'ossigeno. In condizioni ipossiche, l’ossigeno disponibile nell’ambiente diminuisce e la viscosità del sangue aumenta, influenzando così molti processi metabolici ossigeno-dipendenti nell’organismo [29, 30]. Tuttavia, la minore pressione atmosferica in alta quota provoca uno scarso ritorno venoso e una diminuzione della quantità di ossigeno trasportato dal flusso sanguigno a tutte le cellule dell'organismo, che aumenta ulteriormente l'ipossia di organi e cellule [29, 30]. Pertanto, l’esposizione ad alta quota dà luogo ad una serie di risposte fisiologiche ipossiche, inclusa la produzione e l’accumulo di ROS, quando la richiesta di ossigeno supera l’apporto vascolare. Come accennato in precedenza, l’accumulo di ROS porta a una varietà di effetti intracellulari, il più critico dei quali è quello di causare OS nelle cellule.

L’OS si riferisce a uno squilibrio tra reazioni di ossidazione e riduzione, che porta alla generazione di ossidanti o molecole in eccesso che accettano un elettrone da un altro reagente, che a sua volta produce ROS [31, 32]. È noto che l’OS può essere innescata da una serie di fattori endogeni ed esogeni, inclusa l’esposizione all’alta quota. Gli spermatozoi sono cellule particolarmente suscettibili all’OS a causa dei loro inadeguati sistemi di riparazione cellulare e dell’elevato contenuto della membrana plasmatica di acidi grassi polinsaturi [33]. I tessuti testicolari e dell’epididimo non fanno eccezione, poiché è stata osservata la presenza di OS grave negli spermatidi rotondi di ratti sottoposti a ipossia [4]. L'OS influisce sulla stabilità del DNA, mettendo così a repentaglio l'integrità del materiale genetico dei gameti [34-36]. Tuttavia, è stato confermato che un elevato livello di danno al DNA nei gameti maschili porta all’attivazione della segnalazione dell’apoptosi, che si traduce in una riduzione del numero degli spermatozoi nell’epididimo e in un aumento della percentuale di cellule difettose [28, 37]. Nel presente studio, l'ipossia ha ridotto significativamente la vitalità delle cellule GC-1 attraverso l'induzione dell'apoptosi e l'arresto del ciclo cellulare. Ancora più importante, livelli di ROS significativamente aumentati sono stati mostrati dall'analisi FCM dopo la stimolazione dell'ipossia, con un aumento del tasso di apoptosi e una maggiore attivazione di Caspase-3, PARP e rapporto Bax/Bcl-2, indicando che i ROS potrebbero attivare apoptosi attivando la via di segnalazione della caspasi durante il danno alla fertilità indotto dall'ipossia. I presenti risultati hanno dimostrato che l’ipossia porta ad un eccessivo accumulo di ROS, causando danni ossidativi alle cellule riproduttive. Pertanto, è significativo identificare nuovi antiossidanti che possano fungere da approccio efficace per alleviare il danno alla fertilità indotto dall’ipossia.

Per proteggersi dall’OS, nel corpo esiste un complesso sistema antiossidante, composto principalmente da fattori enzimatici. In condizioni fisiologiche, il contenuto di ROS e il sistema antiossidante mantengono un certo equilibrio. Tuttavia, la sovrapproduzione di ROS esaurisce il sistema antiossidante dello sperma, portando all’OS, che causa danni al DNA spermatico e si traduce in tassi di fertilità e gravidanza inferiori [23]. Pertanto, per affrontare la sovrapproduzione di ROS e i relativi effetti deleteri a livello cellulare nel sistema riproduttivo maschile, sono state testate diverse strategie antiossidanti [23]. Attualmente la letteratura riguardante l'utilizzo di composti ad attività antiossidante edmiglioramento della funzione degli spermatozoiè ampio. È importante sottolineare che la maggior parte dei rapporti descrive un miglioramento dei parametri spermatici dopo l'assunzione orale di antiossidanti, inclusomiglioramenti nella concentrazione degli spermatozoie motilità o una diminuzione del danno al DNA [38]. Pertanto, un numero crescente di urologi prescrive antiossidanti orali per l’infertilità dovuta a problemi legati all’OS [39]. Questi antiossidanti includono principalmente carnitine, vitamine, zinco, melatonina e composti naturali [23, 40]. Attualmente, con lo sviluppo della tecnologia di estrazione dei farmaci, si sta prendendo in considerazione anche un numero crescente di estratti di MTC per mitigare l’infertilità maschile perché questi antiossidanti possono ridurre gli effetti distruttivi dell’OS [41]. Yüce A. et al. riportato nel 2013 che la cannella ha effetti benefici sull'equilibrio ossidativo e antiossidante nei testicoli e sulla qualità dello sperma [42]. Zhang L et al. ha dimostrato che la curcumina migliora significativamente la motilità degli spermatozoi nei pazienti e diminuisce l’H2O2 [43]. Inoltre, è stato dimostrato che una varietà di altri estratti vegetali come il mirtillo, il crocus sativus, i semi di melograno e il tè verde proteggono il sistema riproduttivo attraverso meccanismi antiossidanti [27, 44-47]. Cistanches Herba è un’importante medicina tradizionale cinese che possiede un profilo di sicurezza favorevole e ampie funzioni medicinali per il trattamento dell’infertilità, tra le altre condizioni [13]. Moderni studi farmacologici hanno dimostrato che Cistanches Herba possiede diverse attività, quali attività antiossidante, antinfiammatoria, epatoprotettiva e anti-malattia neurodegenerativa [13, 48]. Pertanto, estratti, frazioni o composti di Cistanches Herba possono avere potenziali proprietà antiossidanti per il trattamento dell’infertilità.

Le sostanze attive nelle piante che migliorano la fertilità comprendono vari gruppi chimici come PhG, saponine, composti volatili ossigenati e alcaloidi [41]. Studi sull'attività farmacologica dei PhG hanno dimostrato che i PhG presentano un'ampia gamma di bioattività, come l'antiossidazione, la neuroprotezione antiradiazioni e il miglioramento della funzione sessuale [49, 50]. Tra queste attività, l’antiossidazione sta gradualmente attirando l’attenzione. È stato riportato che alcuni singoli componenti o frazioni di PhG inibiscono l’apoptosi delle cellule germinali indotta da varie sostanze chimiche e le loro capacità antiossidanti in vitro sono state dimostrate anche in vivo in diversi modelli animali [51, 52]. Questi risultati indicano che i PhG potrebbero essere un candidato interessante per iltrattamento dell’infertilità maschile. Cis è un PhG attivo che può essere isolato da Cistanches Herba. Nel presente studio, abbiamo esplorato gli effetti di Cis su cellule trattate con ipossia o su un modello di ratto e studiato i meccanismi molecolari sottostanti. Cis ha mostrato attività protettive sulla diminuzione della vitalità indotta dall'ipossia e sugli aumenti dell'apoptosi nelle cellule GC-1 e ha anche mostrato un effetto protettivo sul danno indotto dall'ipossia nel sistema riproduttivo dei ratti in vivo. È stata osservata una diminuzione significativa delle attività di GR, GPx e SOD in ipossia rispetto ai gruppi normossici, mentre le attività specifiche di GR, GPx e SOD sono aumentate significativamente nei testicoli o nelle cellule GC-1 trattate con Cis. Sembrava che Cis proteggesse i testicoli e le cellule GC-1 in condizioni ipossiche migliorando l'attività degli enzimi antiossidanti.

Gli antiossidanti enzimatici funzionano principalmente eliminando gli anioni superossido, prevenendo così la perossidazione lipidica e il danno al DNA per prevenire l’infertilità. I meccanismi antiossidanti enzimatici svolgono un ruolo cruciale nella prevenzione del danno ossidativo [23]. Il meccanismo enzimatico contro l’OS comprende scavenger di radicali liberi ed enzimi glutatione-dipendenti tra cui GR, GPx e SOD [12]. È noto che gli enzimi antiossidanti sono essenziali per il sistema riproduttivo maschile. Nel presente studio, l’effetto della ridotta attività degli enzimi antiossidanti in ipossia ipobarica è stato accompagnato da un aumento di ROS e LPO nel gruppo modello, il che è coerente con i rapporti precedenti [12]. Tuttavia, la somministrazione di Cis ha portato ad un recupero delle attività degli enzimi antiossidanti nelle cellule GC-1 e nei testicoli dei ratti, rendendo possibile generare strategie per la somministrazione di Cistanches Herba per prevenire il danno indotto dall'ipossia ipobarica, come suggerito in precedenza. Sebbene i risultati attuali abbiano mostrato che il trattamento con Cis ha parzialmente ridotto il danno alle cellule germinali indotto dall’ipossia nei ratti, sono necessarie ulteriori indagini per svelare il quadro completo dei suoi effetti protettivi sulla riproduzione. Ad esempio, il meccanismo specifico di Cis influenza l’attività degli enzimi antiossidanti. Inoltre, c'è da chiedersi se potrebbero essere pertinenti anche altri meccanismi poiché il Cis si è ripreso solo parzialmente dal danno riproduttivo causato dall'ipossia. Infine, si dovrebbe considerare anche se Cis abbia un effetto diretto di promozione della crescita sulle cellule germinali.

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Conclusioni

In generale, i risultati di questo studio sottolineano il potenziale del Cis come antiossidante per il trattamento del danno riproduttivo maschile indotto dall’ipossia. Cis può proteggere dal danno riproduttivo maschile indotto dall'ipossia ripristinando l'attività enzimatica antiossidante, riducendo l'OS indotto dai ROS, aumentando contemporaneamente la vitalità cellulare e diminuendo l'apoptosi. È importante sottolineare che i sottotipi Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C e Cis-H) studiati in questo studio hanno mostrato tutti un certo effetto protettivo sul sistema riproduttivo e Cis-B ha mostrato l’effetto più significativo. Pertanto, ipotizziamo che Cis potrebbe essere un buon candidato antiossidante per iltrattamento del danno riproduttivo maschile indotto dall’ipossia, sebbene l'esatto meccanismo sottostante richieda ulteriori indagini.