Imaging chiaro e quantificazione del rene in 3D
Feb 27, 2022
Per decenni, misurazioni direnela microanatomia che utilizza 2-sezioni dimensionali ci ha fornito una conoscenza dettagliata di rene morfologia in condizioni fisiologiche e patologiche. Tuttavia, il rapido sviluppo di metodi di pulizia dei tessuti negli ultimi anni, in combinazione con lo sviluppo di nuove 3-modalità di imaging dimensionale hanno fornito nuove informazionirenestruttura e funzione. Questo articolo di recensione descrive una serie di nuovi spunti surenesviluppo e malattia ottenuti di recente utilizzando questi nuovi approcci metodologici. Ad esempio, nello svilupporenequesti approcci hanno fornito nuove comprensioni della morfogenesi della ramificazione ureterica, della proliferazione e dell'impegno delle cellule progenitrici del nefrone, delle interazioni tra le cellule della punta ureterica e delle cellule progenitrici del nefrone e dell'instaurazione della segmentazione del nefrone. Nel topo adulto interoreni, la pulizia dei tessuti combinata con la microscopia a foglio leggero può visualizzare e quantificare il numero totale di glomeruli, un importante passo avanti nel campo. Approcci simili hanno fornito nuove informazioni sulla struttura della vascolarizzazione e dell'innervazione renale, sul rimodellamento tubulo-interstiziale, sulla perdita e sull'ipertrofia dei podociti, sulla formazione di cisti, sull'evoluzione delle mezzelune cellulari e sulla struttura della barriera di filtrazione glomerulare. Molti altri progressi nella comprensione direnela biologia e la patologia possono essere previste poiché ulteriori tecniche di pulizia e imaging vengono sviluppate e adottate da più ricercatori.
Parole chiave:imaging 3D; glomerulo; sviluppo dei reni; nefropatologia; pulizia dei tessuti; tubuli; renale
CISTANCHE MIGLIORERA' LA FUNZIONE RENALE/RENALE
Numero totale di nefroni in ogni essere umano normalerenevaria da circa 200,{1}} a più di 2 milioni, 1 con una media di circa 1 milione. Questi nefroni così come gli altri componenti delrenecompresi i dotti collettori, i vasi sanguigni, gli interstizi e le fibre nervose sono disposti con squisita precisione microanatomica. 2 Questo modello preciso è alla base del normalefunzione renalee salute, che può essere gravemente disturbata quando l'architettura dei tessuti è alterata a causa di ipertrofia o restringimento glomerulare o tubulare, perdita di nefrone, anomalie congenite, rarefazione dei vasi e fibrosi interstiziale. Una serie di approcci di imaging hanno contribuito alla nostra comprensione completa direnemicroanatomia durante lo sviluppo e nell'adulto sano e malatorene. Per la maggior parte, questa comprensione è derivata dall'analisi di 2-sezioni dimensionali (2D) sia che si tratti di sezioni fisiche microscopiche o ottiche confocali. La quantificazione di questa microanatomia è dipesa principalmente da analisi stereologiche di sezioni che hanno fornito stime di numeri, lunghezze, aree di superficie e volumi di glomeruli, tubuli, vasi, interstizi e loro componenti cellulari. 3,4 Fino a tempi recenti, la visualizzazione 3D direnela microstruttura era in gran parte limitata alla microscopia confocale, che consente il sezionamento ottico e la ricostruzione 3D fino a una profondità da 50 a 80 m m. Sfortunatamente, le proprietà rifrangenti dei componenti proteici e lipidici all'interno di un tessuto diffondono la luce e riducono drasticamente la qualità dell'immagine all'aumentare della profondità. Negli ultimi anni, è stata sviluppata una gamma di metodi di pulizia per rimuovere il contenuto di lipidi e pigmenti di un tessuto e abbinare le proprietà di rifrazione del tessuto e dei mezzi di montaggio per rendere il tessuto trasparente. 5 I metodi di pulizia variano in complessità dall'incubazione di tessuti in varie soluzioni per un periodo di ore a procedure estese che coinvolgono apparecchiature elettrochimiche personalizzate. Indirizziamo i lettori alle recensioni recenti 5,6 per una panoramica dettagliata dei metodi attuali e ai documenti qui citati per metodi e casi d'uso specifici.
Le strutture subcellulari e intere popolazioni di cellule possono essere risolte all'interno di organi interi eliminati o sezioni spesse. Le caratteristiche di imaging accurate all'interno del tessuto eliminato richiedono microscopi specializzati ed elaborazione delle immagini per acquisire e ricostruire dati volumetrici da campioni che possono variare da centinaia di micron a centimetri di dimensioni. I microscopi confocali a scansione puntiforme e a disco rotante sono stati utilizzati in modo efficace per visualizzare le caratteristiche all'interno del clearedrenetessuto ma soffrono di una risoluzione ridotta nell'asse Z e di una progressiva riduzione dell'intensità della fluorescenza in profondità a causa di un singolo asse di illuminazione e imaging. Le tecniche di microscopia a foglio leggero sono particolarmente adatte per l'imaging dei tessuti eliminati in quanto consentono l'acquisizione rapida di grandi volumi 3D e possono includere l'illuminazione e l'imaging multiangolo. La tomografia a proiezione ottica è un altro approccio che incorpora l'imaging multiangolo e la ricostruzione digitale per produrre dati in cui gli assi X, Y e Z di ciascun voxel hanno la stessa risoluzione. Indipendentemente dall'approccio specifico, la pulizia dei tessuti e l'imaging a montaggio intero offrono una nuova opportunità per esplorare microambienti cellulari inesplorati e strutture tissutali di ordine superiore. In questa recensione, mettiamo in evidenza alcune nuove intuizioni inrenesviluppo, adultorenestruttura e patologia risultanti dalla pulizia dei tessuti seguita dall'analisi quantitativa 3D.
Nuove informazioni sullo sviluppo del reneDecenni di profili di espressione genica e studi knockout hanno portato a una comprensione dettagliata dei tipi cellulari, delle reti di regolazione genica e delle vie di segnalazione che controllano i mammiferirenesviluppo. Questa conoscenza ha informato la diagnosi delle malattie congenite e ha consentito la produzione direnetipi cellulari da cellule staminali pluripotenti. 7 Tuttavia, la dimensione, l'opacità e la complessità dello svilupporeneha presentato una barriera significativa alla misurazione precisa della morfogenesi di questo organo e della distribuzione 3D di cellule e proteine al suo interno. L'applicazione della pulizia dei tessuti e dell'imaging multiscala nelreneha consentito la visualizzazione e l'analisi quantitativa della morfogenesi della ramificazione ureterica, delle popolazioni di cellule progenitrici e della dotazione di nefroni all'interno di organi intatti (Figura 1). 8 Questi approcci sono alla base di una nuova capacità di fenotipizzazione di precisione e aprono strade per analizzare i driver cellulari e molecolari direnesviluppo e malattie congenite.
Imaging e analisi della morfogenesi della ramificazione in 3D.L'instaurazione dell'albero ureterale è una caratteristica distintiva direnesviluppo ed è stato ampiamente studiato utilizzando la genetica del topo e appiattitorenecolture di espianto. Tuttavia, la comprensione del modo in cui i singoli geni contribuiscono alla crescita, alla forma e al modello di questa struttura ramificata del dotto epiteliale in vivo ha richiesto la capacità di visualizzare e analizzare questa complessa rete su un'ampia gamma di dimensioni del campione. Corto et al. 8 ha affrontato questi problemi utilizzando l'immunofluorescenza a montaggio intero, la compensazione a base di solvente (alcol benzilico benzil benzoato) e l'imaging di organi interi con tomografia a proiezione ottica. Utilizzando questo approccio per acquisire istantanee 3D dall'inizio alla metàrenesviluppo, il team ha sviluppato un software di analisi personalizzato per ricavare dettagli senza precedenti sull'albero ureterico, inclusi il numero della punta, gli angoli e la lunghezza dei rami, i volumi dei rami e il numero di generazioni di ramificazioni da alberi ureterici intatti (Figure 1c e d). 8 Inizialmente utilizzato per caratterizzare e identificare nuovi aspetti della ramificazione renale, 9,10 gli sforzi in corso cercano di definire i principi ei regolatori chiave che governano il patterning delle ramificazioni in vivo. 1
Collegamento della dinamica dei progenitori alla morfogenesi degli organi con l'imaging multiscala.Le interazioni molecolari tra le cellule dell'ureterico e le cellule progenitrici del nefrone svolgono un ruolo importante nello stabilire il complemento dei nefroni che facilitanofunzione renalenella vita adulta. I progenitori del nefrone non indotti producono fattori che promuovonorenela crescita attraverso la ramificazione ureterica mentre segnali spazialmente limitati all'interno della punta ureterica mantengono entrambi lo stato di progenitore del nefrone e inducono un sottoinsieme di questi progenitori a differenziarsi in un nefrone precoce. Queste interazioni guidano un ciclo di ramificazione e induzione del nefrone che cessa intorno alla nascita, quando i progenitori del nefrone rimanenti si differenziano. Prima dei metodi di pulizia dei tessuti, la nostra comprensione delle dinamiche direnela morfogenesi e l'abbondanza relativa delle popolazioni di cellule progenitrici nel tempo erano gravemente limitate. Ciò è cambiato con lo sviluppo di approcci di imaging multiscala che utilizzano protocolli di immunofluorescenza estesi, pulizia dei tessuti e approcci di imaging per quantificarerenesviluppo a livello cellulare (confocale) e dell'intero organo (tomografia a proiezione ottica, foglio luminoso). 9,10 È emerso che le tariffe direnela crescita varia notevolmente con velocità di ramificazione e proliferazione inizialmente rapide che diminuiscono in fasi correlate alla riduzione del numero di cellule progenitrici all'interno della nicchia nefrogenica. 10 Imaging confocale tridimensionale di feto umano intero ripulitoreni(settimana 11) o campioni dalrenecorteccia (settimane 11-23) affermano che questa diminuzione delle dimensioni della nicchia è conservata in tutte le specie. 12 Un'ulteriore analisi comparativa della nicchia nefrogenica umana e del topo nel tessuto eliminato ha portato a un nuovo modello di reclutamento basato sul tempo della formazione del nefrone, in cui le cellule progenitrici vengono progressivamente aggiunte a un nefrone precoce e adottano un'identità di segmento in base all'ordine in cui arrivano . 13 In un altro studio incentrato sull'impegno del progenitore del nefrone, è stato utilizzato un metodo di schiarimento tissutale a base di idrogel (imaging rigido ibridato con acril-ammide a scambio passivo di lipidi/immunocolorazione/ibridazione in situ compatibile con idrogel di tessuto [CLARITY] 14) per il suo capacità di trattenere la fluorescenza di un reporter endogeno di tdTomato. L'analisi dell'etichettatura di tdTomato all'interno del tessuto eliminato ha mostrato che le cellule all'interno del nefrone commettente precoce possono tornare a uno stato progenitore, dove i risultati precedenti suggerivano che l'impegno fosse unidirezionale. 15 Pertanto, la pulizia dei tessuti ha migliorato la nostra comprensione dei processi di sviluppo dinamici su scale e specie.
Fenotipizzazione di precisione. I progressi nella pulizia dei tessuti e nell'analisi quantitativa hanno consentito una nuova capacità di fenotipizzazione di precisione. Cambiamenti statisticamente robusti nella ramificazione e nel numero di nefroni sono stati identificati in modelli murini con fenotipi sottili come Ret þ/? e Six2 þ/? topi (Figura 2), che in precedenza erano classificati come "normali". 10,16 Imaging confocale ad alta risoluzione di Wnt11 ?/?reniidentificato un nuovo fenotipo cellulare in cui i progenitori del nefrone appaiono disorganizzati a causa dell'incapacità di formare attaccamenti cellulari stabili con la punta ureterica e differenziarsi prematuramente. 17 Questi metodi sono stati utilizzati anche per quantificare come nuovi regolatori dello stato delle cellule progenitrici del nefrone come la DNA metiltransferasi 1, i microRNA Lin28 e Let7 e TSC1 influenzanorenesviluppo e numero di nefrone. 18-20 È probabile che la fenotipizzazione di precisione diventi uno strumento importante nel nostro sforzo per comprendere l'effetto additivo di fattori genetici e ambientali che contribuiscono al basso numero di nefroni e alla predisposizione a malattie cronichemalattie renali.
Modellazione matematica direnemorfogenesi. I dati prodotti dallo sviluppo cancellatorenestanno alimentando un'ondata di modelli matematici basati su immagini che tentano di discernere come la forma e la funzione macroscopiche di un tessuto derivino dalle interazioni molecolari tra le popolazioni di cellule progenitrici. 11,21–23 Un'ulteriore applicazione dell'imaging dell'intero organo nel tessuto purificato sarà fondamentale per comprendere i driver molecolari e cellulari del patterning 3D dei tessuti e potrebbe essere la chiave per migliorare la struttura e l'accuratezza dei modelli di cellule staminali delrene.
Morfologia 3D e patologia del rene adultoL'intricata morfologia dell'adultorenelimita l'uso di strumenti morfologici 2D in quanto possono trasmettere percezioni incomplete o fuorvianti della struttura 3D. Qui, discutiamo alcuni degli importanti progressi metodologici degli ultimi anni che ora consentono una solida analisi 3D delle strutture nell'adultorene, che vanno da intattorenifino ai componenti della barriera di filtrazione glomerulare (Figura 3). 2
CISTANCHE MIGLIORERA' L'INSUFFICIENZA RENALE/RENALE
Numero e dimensione del nefrone.L'umanorenemostra un alto livello di variabilità intra e intersoggettiva nel numero e nel volume dei nefroni, che è stato descritto negli studi autoptici di soggetti senzamalattie renali1,30,31 ed è stato collegato a disturbi dello sviluppo. Per decenni, lo strumento standard per quantificare il numero di nefroni in campioni sperimentali e umani è stato il metodo disector/fractionator, un metodo stereologico basato sul design. 3,4 Sebbene questo approccio sia accurato e preciso, è anche pratico, dispendioso in termini di tempo e richiede una formazione significativa. Per questo motivo, sono stati proposti approcci alternativi per ideare metodi efficienti in grado di fornire endpoint di alta qualità: 32 ad esempio, combinazioni di metodi di clearing ottico, inclusi idrofobi (precedentemente noti come a base di solventi), idrofili o a base di idrogel, con metodi avanzati microscopia ottica (p. es., confocale, multifotone o foglio luminoso).
A nostra conoscenza, il primo rapporto che combinava il clearing ottico e la microscopia a foglio leggero per l'analisi del numero e delle dimensioni dei nefroni è stato pubblicato da Klingberg et al. 24 in un documento fondamentale che presentava molteplici importanti progressi. In primo luogo, questo rapporto ha introdotto l'etil cinnamato, un solvente non pericoloso che potrebbe sostituire sostanze chimiche tossiche come l'alcol benzilico-benzil benzoato, che fino ad allora veniva regolarmente utilizzato nei protocolli di pulizia idrofobica. In secondo luogo, i ricercatori hanno eseguito il conteggio del nefrone nel topo intattoreni in un modello aggressivo e progressivo di immuno-mediatomalattie renali, identificando la perdita di nefrone durante il decorso della malattia. Inoltre, sono stati introdotti passi significativi verso l'automazione computerizzata degli algoritmi di segmentazione delle immagini, fornendo un percorso verso significativi miglioramenti dell'efficienza. Recentemente, Østergaard et al. 25 ha presentato un metodo di compensazione idrofobico simile combinato con la microscopia a foglio leggero e la segmentazione automatizzata dell'immagine che fornisce sia il numero totale di nefroni che il volume glomerulare singolo in un modello murino di nefropatia diabetica. Inoltre, questo studio ha mostrato un'elegante etichettatura funzionale dei tubuli prossimali tramite iniezione di albumina in vivo per visualizzare la giuntura glomerulartubulare e un semplice protocollo per l'istopatologia correlativa negli stessi campioni otticamente eliminati. Questo rapporto mostra la flessibilità di questi protocolli, che stanno diventando pipeline multistrato per una profilazione completa dei tessuti.
Vascolarizzazione renale e innervazione.Seguendo tracce di vascolarizzazione ramificata o fibre nervose nell'adultoreneè quasi impossibile nell'istologia convenzionale 2D poiché le dimensioni dell'organo e la complessità della distribuzione strutturale richiedono un sezionamento seriale ampio ed esperto. Recentemente, Huang et al. 33 ha riportato un colorante fluorescente cationico nel vicino infrarosso (MHI148-PEI) per etichettare in modo specifico i vasi sanguigni, che può essere combinato con un protocollo di pulizia modificato e accelerato basato sull'etil cinnamato per ridurre i tempi di elaborazione dei tessuti. Questo approccio apre nuove strade per la ricerca vascolare nelrene,soprattutto quando è richiesta l'imaging ad alta risoluzione in 3D. Allo stesso modo, Hasegawa et al. 26 hanno utilizzato Clear Unbstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis (CUBIC) insieme a un sistema di microscopia a foglio leggero personalizzato per identificare la distribuzione dell'innervazione simpatica nel rene del topo intatto. I nervi simpatici erano principalmente distribuiti attorno alle arterie. Dopo 10 giorni di ischemia o danno da riperfusione, la densità di innervazione simpatica era significativamente ridotta, correlandosi con livelli ridotti di norepinefrina intessuto renale. Questi cambiamenti persistevano parzialmente 28 giorni dopo la lesione iniziale, suggerendo che si possono riscontrare continue alterazioni simpatiche durante la progressione della malattia cronica.malattie renali.
Rimodellamento tubulo-interstiziale.Il sistema tubulare renale è particolarmente difficile da analizzare in 3D. La morfologia contorta e complessa pone molteplici sfide per i metodi convenzionali basati sul sezionamento seriale e sulla microscopia ottica standard. Tuttavia, il clearing ottico consente l'analisi dei tubuli intatti e del loro microambiente circostante. Sarita et al. 34 hanno eseguito una combinazione di clearing ottico idrogel e idrofobico seguito da microscopia ottica avanzata e analisi 3D semiautomatica per caratterizzare il rimodellamento tubulare distale dovuto alla privazione di potassio nella dieta. I ricercatori hanno quantificato l'iperplasia tubulare e rilevato un aumento delle cellule proliferanti all'interno del tubulointerstizio. Questo studio ha utilizzato la versatilità sia del clearing ottico che
Figura 3| Morfometria tridimensionale (3D) nel rene adulto. (a) Conteggio dei nefroni nei reni interi utilizzando l'etichettatura CD31 delle cellule endoteliali. Il pannello mostra una ricostruzione 3D (a sinistra), una sezione ottica in una vista bidimensionale (2D) (al centro) e aree speciali che mostrano singoli glomeruli in un confronto tra microscopia a foglio luminoso (LSFM) e confocale e 2- microscopia di fotoni (2P). Adattato con il permesso dell'American Society of Nephrology, dal Journal of the American Society of Nephrology, Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy, Klingberg A, Hasenberg A, Ludwig-Portugall I, et al ., volume 28, numero 2, 2017; autorizzazione trasmessa tramite il Copyright Clearance Center, Inc. 24 (b) Dimensionamento dei glomeruli con registrazione spaziale: la codifica a colori rappresenta la dimensione glomerulare, dove il rosso è l'oggetto più grande e il rosa il più piccolo. Adattato con il permesso dell'American Society of Nephrology, da Kidney360, Automated Image Analyzes of Glomerular Hypertrophy in a Mouse Model of Diabetic Nephropathy, Østergaard MV, Sembach FE, Skytte JL, et al., volume 6, numero 6 , 2020; autorizzazione trasmessa tramite il Copyright Clearance Center, Inc. 25 (c) Monitoraggio della vascolarizzazione e dell'innervazione, con una ricostruzione 3D di un rene intatto con immunomarcatura dei nervi simpatici (verde), vascolari (magenta) e fusi (a sinistra). Adattato da Kidney International, volume 96, numero 1, Hasegawa S, Susaki EA, Tanaka T, et al., L'analisi tridimensionale completa (rene CUBIC) visualizza i nervi simpatici renali anormali dopo un danno da ischemia/riperfusione, pagine 129–138, Copyright ª 2019, con il permesso della Società Internazionale di Nefrologia. 26 (d) Morfometria dei podociti nei singoli glomeruli mediante immunomarcatura per il marcatore specifico del podocita p57 (verde) e il marcatore del DNA 4 0,6-diamidino{33}}fenilindolo (DAPI). I pannelli mostrano (a sinistra) una ricostruzione 3D e (a destra) le superfici renderizzate. Adattato con il permesso dell'American Society of Nephrology, dal Journal of the American Society of Nephrology, Validation of a Three-Dimensional Method for Counting and Sizing Podocytes in Whole Glomeruli, Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al., volume 27, numero 10, 2016; autorizzazione trasmessa attraverso il Copyright Clearance Center, Inc. 27 (e) Dinamica cellulare utilizzando il tracciamento del lignaggio, che mostra podociti (all'estrema sinistra), cellule epiteliali parietali (PEC) che formano mezzelune cellulari in 3D (centro-sinistra), una vista 2D dei PEC che invadono il lato glomerulare con danno vascolare (centro-destra) e una visualizzazione 2D dell'uscita tubulare (estrema destra). Adattato da Kidney International, volume 96, numero 2, Puelles VG, Fleck D, Ortz L, et al., Novel 3D analysis using optical tissue clearing documenta l'evoluzione della glomerulonefrite murina rapidamente progressiva, pagine 505–516, Copyright ª 2019, Internazionale Society of Nephrology, sotto la licenza CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 28 (f) Visualizzazione del diaframma a fessura ad ingrandimenti crescenti da sinistra a destra. Adattato da Kidney International, volume 99, numero 4, Unnersjö-Jess D, Butt L, Höhne M, et al., Un protocollo di pulizia e rigonfiamento rapido e semplice per l'imaging 3D in-situ del rene su scale, pagine 1010–1020 , Copyright ª 2021, International Society of Nephrology, con licenza CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/). 29 Per ottimizzare la visualizzazione di questa immagine, consultare la versione online di questo articolo all'indirizzowww.kidney-international.org.
microscopia ottica per eseguire l'analisi tubulare nei reni intatti utilizzando l'inclusione di idrogel e la microscopia a foglio leggero, nonché la quantificazione unicellulare in fette renali utilizzando la compensazione idrofobica e la microscopia confocale, poiché ogni combinazione era più adatta per la specifica domanda di ricerca. Combinazioni di clearing ottico e microscopia ottica avanzata sono state utilizzate da Tahaei et al. 35 che ha caratterizzato il dimorfismo sessuale nella lunghezza del tubulo contorto distale, che può determinarne la capacità di adattamento allo stress fisiologico, e Schuh et al. 36 che hanno rivelato differenze assiali nell'assorbimento del ligando del tubulo prossimale e nella funzione endolisosomale, evidenziando che il segmento S1 è altamente specializzato nel riassorbire le proteine attraverso l'endocitosi mediata dal recettore. In un recente studio, Blanc et al. 2 ha analizzato un modello di formazione di cisti, mostrando che le cisti si sviluppavano solo in specifici segmenti di nefrone, che ne determinavano la forma e si trovavano contigui ai normali tubuli non dilatati. Nel complesso, ora abbiamo più esempi di applicazione diretta del clearing ottico per l'analisi sistematica del compartimento tubulo-interstiziale.
Perdita e ipertrofia dei podociti.Il glomerulo fornisce un esempio unico per l'analisi di unità funzionali intatte all'interno di un organo. In particolare, lo studio dell'esaurimento dei podociti ha beneficiato direttamente di questi progressi tecnologici poiché le metodologie basate sul design del gold standard richiedono un investimento significativo di tempo e risorse. 37 Il primo strumento per l'analisi morfometrica 3D dei podociti di glomeruli di topo intatti combinava l'immunomarcatura direnefette utilizzando un protocollo modificato di immunofluorescenza indiretta, compensazione ottica idrofobica e microscopia confocale, che ha facilitato la quantificazione del numero totale di podociti in glomeruli individuali interi di volume noto. Riteniamo che questo approccio sia ideale per lo studio dei processi che interessano un sottoinsieme specifico di strutture (ad es. perdita di podociti che porta alla glomerulosclerosi focale e segmentale). 27 La stessa tecnica è stata successivamente applicata per caratterizzare il ruolo dell'ipertrofia dei podociti come risposta compensatoria dopo la perdita dei podociti, un meccanismo che è mediato dal bersaglio dei mammiferi della via di segnalazione della rapamicina. 38 Mentre questi 2 studi si sono concentrati sull'analisi dei podociti glomerulari, questa pipeline basata sull'immunomarcatura convenzionale può essere utilizzata per caratterizzare i cambiamenti morfologici di qualsiasi tipo di cellula ad alta risoluzione spaziale.
L'evoluzione delle mezzelune cellulari.Un altro strumento importante che doveva essere integrato con successo nella cassetta degli attrezzi per il 3Drenela morfometria è il tracciamento del lignaggio genetico. La maggior parte dei metodi di compensazione ottica tendono a indurre un certo grado di estinzione della fluorescenza (che varia da lieve a grave). 6 Abbiamo recentemente presentato un protocollo che combina il tracciamento del lignaggio, il clearing ottico e la microscopia multifotonica per l'analisi completa della perdita di podociti e dell'attivazione delle cellule epiteliali parietali. 28 In questo studio, la perdita di podociti è stata identificata come una caratteristica della nefrite a mezzaluna sperimentale utilizzando l'etichettatura metabolica dei podociti con una proteina fluorescente verde potenziata. L'evoluzione delle mezzelune cellulari è stata visualizzata e quantificata in base alla proliferazione e migrazione delle cellule epiteliali parietali, che erano anche contrassegnate da una proteina fluorescente verde potenziata e monitorate nel corso di un modello sperimentale di nefrite crescente. L'analisi dei glomeruli intatti ha consentito l'identificazione della perdita focale dei podociti e della formazione di lesioni, che sono progredite in occlusioni tubulari da parte delle cellule epiteliali parietali, portando alla formazione di glomeruli atubulari. Questo studio apre la strada a studi futuri sulle interazioni immuno-epiteliali complesse all'interno di intattoreni.
CISTANCHE MIGLIORERA' LA DIALISI RENALE/RENALE
Barriera di filtrazione glomerulare.Un importante strumento diagnostico per la valutazione di routine delle malattie glomerulari è l'analisi ultrastrutturale delle biopsie renali mediante microscopia elettronica. Un'alternativa alla microscopia elettronica può essere trovata nel campo della microscopia ad espansione, che per definizione mira ad aumentare la risoluzione ottica aumentando le dimensioni dei tessuti. Nel corso degli anni, Unnersjo-Jess et al. 39,40 hanno fornito più protocolli per la visualizzazione di strutture su scala nanometrica nelrene.Recentemente, questi ricercatori hanno riportato una procedura semplice e veloce per la visualizzazione 3D direnemorfologia, combinando concetti di compensazione ottica ed espansione dei tessuti per risolvere strutture su scala nanometrica utilizzando la microscopia confocale convenzionale. 29 Questo protocollo è stato applicato per visualizzare e quantificare molteplici caratteristiche patologiche nel topo e nell'uomorenebiopsie comprendenti l'eliminazione del processo del piede, alterazioni della membrana basale glomerulare, lunghezza del diaframma a fessura, depositi di IgG e caratteristiche della patologia classica (p. es., glomerulo-sclerosi, fibrosi tubulo-interstiziale e atrofia tubulare). In sintesi, questo metodo consente la visualizzazione e la quantificazione multiscala della patologia renale utilizzando un metodo semplice e strumenti di analisi delle immagini accessibili. La scalabilità e l'attuazione di questo approccio nella pratica clinica saranno probabilmente determinate dalla necessità di apparecchiature avanzate di microscopia ottica e dallo sviluppo di strumenti automatizzati di analisi delle immagini.
Conclusione
L'attuale spettro di metodi di pulizia dei tessuti include tecniche semplici che possono essere implementate nella maggior parte dei laboratori per migliorare l'imaging 3D sui microscopi comunemente disponibili. Man mano che le opportunità offerte da questi nuovi approcci diventano evidenti, prevediamo un più ampio utilizzo di sistemi di microscopia specializzati per visualizzare efficacemente i tessuti eliminati ad alta risoluzione e lo sviluppo di ricerca su misura e flussi di lavoro clinici per rispondere a domande specifiche. Il campo delle neuroscienze è servito da banco di prova per metodi e applicazioni di imaging dei tessuti ripuliti. In questo contesto sono stati sviluppati analisi automatizzate delle immagini, nuovi approcci allo studio della connettività cellulare e progetti di atlante di espressione genica e proteica a livello di tessuto. È probabile che approcci simili forniscano nuove conoscenze sull'anatomia cellulare e sull'interdipendenza delle popolazioni cellulari nei soggetti in via di sviluppo e nell'adultorene.
Le limitazioni pratiche a questi progressi includono il costo dell'hardware di imaging e le difficoltà nella gestione, archiviazione e analisi di grandi set di dati. Altre limitazioni derivano dalla mancanza di riproducibilità della colorazione con tessuti variabilmente influenzati dalle condizioni di fissazione e dall'etichettatura degli anticorpi. Di conseguenza, è necessario che le nuove analisi 3D siano valutate criticamente e confrontate con i metodi stabiliti. Nonostante gli impressionanti progressi nella valutazionerenesviluppo e adultorenestruttura e malattia evidenziate in questa recensione, riteniamo che il meglio della pulizia dei tessuti e dell'imaging 3D debba ancora arrivare ed è probabile che rappresenti un'entusiasmante area di crescita perrenericerca per i decenni a venire.