Coccidioides Immitis e Posadasi; una rassegna della loro biologia, genomica, patogenesi e immunità dell'ospite

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ASTRATTO

Immunità ai coccidioidie C. posadas sono due specie fungine dimorfiche altamente patogene che sono endemiche nelle aree aride del nuovo mondo, inclusa la regione dal Texas occidentale alla California meridionale e centrale negli Stati Uniti che causa la coccidioidomicosi (nota anche come febbre della valle). Nelle regioni altamente endemiche come l'Arizona meridionale, fino al 50% dei residenti a lungo termine è stato infettato. Nuove informazioni sulla genetica delle popolazioni fungine.ecologia, l'epidemiologia e le interazioni ospite-patogeno stanno diventando disponibili, tuttavia, la nostra comprensione di alcuni aspetti della coccidioidomicosi è ancora incompleta, inclusa l'entità della variabilità genetica del fungo. i geni coinvolti nella virulenza e come i cambiamenti nell'espressione genica durante il Ciclo di vita dimorfico dell'organismo sono correlati alla trasformazione da una muffa a vita libera a una sferula parassitaria. Sfortunatamente, gli sforzi per sviluppare un efficace vaccino a subunità non sono stati ancora prodotti, sebbene siano stati sviluppati due potenziali vaccini contro i funghi vivi.

STORIA DELL'ARTICOLO Ricevuto il 13 aprile 2018 Accettato il 31 luglio 2018

PAROLE CHIAVE Funghi; Cocidioides;cocidioidomicosi;dimorfismo; sferula;genoma; transriptome;immunità; vaccino

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introduzione

La coccidioidomicosi è stata riconosciuta per la prima volta come un'infezione disseminata fatale 120 anni fa, ma l'eziologia fungina è stata determinata solo due decenni dopo e l'intero spettro digitale della malattia non è stato realizzato per altri 40 anni dopo [1]. Nell'ultimo decennio, ci sono stati progressi nella nostra comprensione del protettivorisposta immunitarianei topi e sono stati compiuti modesti progressi verso la creazione di un vaccino protettivo. I progressi nella metodologia molecolare sono stati utilizzati per chiarire la tassonomia del patogeno, l'epidemiologia di questi patogeni fungini endemici, dimorfici ed endemici di importanza regionale e per confrontare l'espressione genica fungina nelle sue diverse morfologie. È ancora difficile effettuare mutazioni precise e mirate in questi agenti patogeni, il che ha limitato la nostra capacità di identificare i fattori di virulenza e di comprendere appieno come il fungo si trasforma da muffa nella complessa e unica struttura parassitaria (sferula) che è la forma che assume all'interno dell'ospite. Parte della nostra attuale conoscenza di questi problemi sarà discussa in questa rassegna selettiva.

Tassonomia

Le specie Coccidioides sono funghi all'interno della divisione degli Ascomiceti, della classe degli Eurotiomiceti e dell'ordine degli Onygenales[2,3]. Questo ordine include una varietà di patogeni umani dimorfici in grado di causare malattie invasive in ospiti immunologicamente normali, tra cui Histoplasma capsulare,Paracoccidioidespp e Blastomyces spp. In questo ordine si trova anche la muffa monomorfica, Aspergillus fumigatus, che è un patogeno opportunista. All'interno di questo ordine si trovano anche diverse specie non patogene ma strettamente correlate (Figura 1). Coccidioides e C. posada sono morfologicamente identici e le loro proteine ​​previste sono più del 90% omologhe [2]. Non possono essere distinti da test sierologici, ma le due specie possono essere distinte da genetichepolimorfismi, e sono state riportate alcune differenze nelle caratteristiche di crescita [4.5].C. posadas ha una dimensione della popolazione maggiore, che è più diversificata di C. [6]. La più grande differenza tra le due specie è la loro distribuzione geografica. C si trova principalmente nelle regioni desertiche della California centrale e meridionale (inclusa Baja California), mentre C. posadas si trova principalmente nelle regioni desertiche del Nevada, Arizona, New Mexico, Texas occidentale, Messico e America centrale e meridionale, il che implica che significative barriere geografiche nel momento in cui la specie si discostava da un antenato comune [6]. Alcune sovrapposizioni geografiche tra le due specie si verificano anche nella California meridionale e nella Bassa California [7]. Entrambe le specie contengono sottopopolazioni che si raggruppano all'interno di aree geografiche più piccole [8].

Figura 1. Un albero filogenetico di funghi dimorfici che sono agenti patogeni umani. Per il confronto vengono mostrati alcuni parenti stretti che non sono patogeni primari dimorfici (non evidenziati in marrone chiaro). Gli ordini sono mostrati a destra dei nomi nella casella. Gli organismi all'interno di ciascun Ordine sono imballati insieme. I dati filogenetici sono stati ottenuti utilizzando lo strumento di tassonomia NCBI e l'albero è stato costruito utilizzando Philip-3.695.

Ecologia

Coccidioides sp. cresce nel suolo arido e alcalino del deserto della California, ma il suolo è molto complesso [9] e le caratteristiche del suolo contaminato possono differire tra le regioni endemiche[10]. Finora, nessun insieme di caratteristiche fisiche, biologiche e chimiche descrive tutti i siti in cui è stato trovato l'organismo e, anche in un "sito", il fungo è distribuito in modo non uniforme nel terreno per ragioni poco chiare. Esistono alcune prove dell'importanza delle carcasse di piccoli mammiferi infetti per il suolocolonizzazione[7], il che potrebbe spiegare il recupero a macchia di leopardo da campioni di suolo anche in luoghi dove si sono verificati piccoli focolai [1l], ma è improbabile che siano necessari animali infetti per la colonizzazione del suolo [12,13]. Oltre alle carcasse di animali nelle tane , è probabile che ci siano degli avanzi di cibo che gli animali hanno portato nelle tane. I genomi di Coccidioides rivelano un'espansione degli enzimi proteolitici, che è stata interpretata come prova indiretta che il fungo utilizza proteine ​​(carcasse) come fonti di carbonio nelle sue nicchie ambientali, poiché è noto che piccoli roditori del deserto come i topi canguro hanno spesso i cocci -granulomi digitali nei loro polmoni [11]. Recuperare l'organismo dal suolo mediante coltura può essere difficile [14]. Il recupero dell'organismo mediante l'inoculazione del topo è più sensibile, ma anche la tecnologia ha i suoi limiti [151. Il DNA di Coccidioides si trova solo in una piccola frazione di campioni di suolo provenienti da regioni endemiche della Baja California e dell'Arizona anche da test sensibili come la PCR [12,15], ma una nuova metodologia può aumentare la sensibilità e la specificità del rilevamento del DNA [16]. È stato più facile coltivare C. dal suolo nella San Joaquin Valley in California in prossimità di siti in cui è noto che gli esseri umani sono stati infettati [7,1ll,14]. Rilevamento delorganismodall'atmosfera è ancora più difficile che trovarlo nel suolo, sebbene il recente sviluppo di nuove tecniche possa migliorare la sensibilità di rilevamento del DNA fungino aerosolizzato [17].

Epidemiologia

Si stima che il 30-50 percento delle persone in aree altamente endemiche sia stato infettato, come rilevato da un test cutaneo per la coccidiosi [18]. Queste stime si basano su vecchi dati poiché i reagenti per test cutanei non erano disponibili per decenni e nosu larga scalasono stati condotti studi epidemiologici dalla recente disponibilità di un reagente per il test cutaneo delle sferule. È importante ricordare che le aree endemiche includono le aree urbane di Phoenix, Tucson, Los Angeles e San Diego, quindi non è necessario recarsi nel deserto aperto per contrarre la coccidioidomicosi. Sebbene l'urbanizzazione riduca probabilmente il rischio di infezione diminuendo la superficie del suolo contaminato esposto, aumenta anche il numero di persone che possono essere potenzialmente infettate da artroconidi aerodispersi generati da attività che disturbano il suolo, come l'edilizia e i terremoti [19] ,20]. Inoltre, le spore portate dal vento provenienti da un'area endemica possono infettare persone e animali a molte miglia dall'area endemica [21].Coccidioidesono tolleranti al sale, quindi possono sopravvivere nelle acque costiere e questo potrebbe spiegare come possono infettare i mammiferi marini[7,22]. L'incidenza delle infezioni umane segnalate varia leggermente di anno in anno, forse a causa dei modelli meteorologici. Gli inverni umidi sembrano essere correlati con un numero maggiore di infezioni nei mesi successivi [23]. Inoltre, c'è stata una tendenza generale verso un aumento del numero di infezioni sintomatiche negli ultimi 10 anni [23,24]. Sebbene le ragioni di questo aumento dell'incidenza non siano completamente stabilite, in Arizona ci sono persone più suscettibili (compresi gli anziani) che si spostano da aree non endemiche ad aree endemiche, che è una possibile spiegazione. Sebbene la popolazione della Central Valley della California non stia aumentando allo stesso modo, il numero di casi nella periferia della contea di Los Angeles è aumentato drammaticamente con l'espansione urbana [18]. Inoltre, sono state costruite diverse nuove prigioni nel mezzo dell'endemica zona nella San Joaquin Valley, con conseguenti tassi di attacco inaccettabilmente elevati tra i prigionieri e le guardie [25]. Recentemente un piccolo numero di infezioni da C. è stato diagnosticato in un'area arida nello Stato di Washington orientale. Gli organismi sono stati anche isolati da campioni di suolo in cui sono state acquisite le infezioni, migliaia di miglia a nord delle aree endemiche conosciute più vicine in California [26]. Il suolo e gli isolati umani erano identici ma erano geneticamente distinti dagli isolati della California centrale e meridionale di C.

Esistono numerose revisioni recenti delle manifestazioni cliniche della coccidioidomicosi che contengono informazioni cliniche dettagliate [18,27,28].Sintomi polmonarisono i motivi più comuni per cui i pazienti cercano assistenza medica, ma si stima che solo il 30-50 percento delle infezioni sia sintomatico[18]. Anche se la maggior parte delle infezioni non viene diagnosticata, gran parte dei casi di polmonite ambulatoriale in Arizona è dovuta a coccidioidomicosi[29]. Quasi tutte le co-polmoniti sono autolimitanti, anche nei casi in cui i pazienti presentano complicanze extrapolmonari, ma in alcuni casi la polmonite può persistere per settimane o mesi [27,29]. In altri casi possono esserci granulomi residui o cavità a parete sottile che rimangono a lungo dopo la risoluzione della polmonite.

Meno del 5% dei pazienti immunocompetenti sviluppa una malattia disseminata [21,30]. A parte la malattia o l'immunosoppressione indotta da farmaci, il rischio di malattia disseminata è fortemente influenzato da fattori dell'ospite, come il terzo trimestre di gravidanza e la vecchiaia [30,31]. L'etnia è anche un importante fattore di rischio per la diffusione. In molti studi, le persone che si descrivono come afroamericane hanno 2-10 volte più probabilità di sviluppare la malattia disseminata rispetto alle persone di origine europea, anche quando non ci sono differenze evidenti nelle loro esposizioni (come accade nelle carceri e su basi militari)[18,25.32]. I filippini hanno anche maggiori probabilità di avere un'infezione disseminata [33]. I geni ei meccanismi alla base della predisposizione etnica alla diffusione non sono stati stabiliti.

genomi

Sono state determinate le sequenze di DNA di molti isolati di C.immitis e di molti isolati di C. posadas [8,34]. Ce n'è un po'ibridazionetra le due specie [6,35]. Il sequenziamento di un gran numero di isolati clinici in Arizona ha stabilito che quasi tutti erano ceppi geneticamente diversi di C post [8]. I gruppi di isolati delle aree di Tucson e Phoenix sono geneticamente distinti. Uno studio che ha confrontato gli isolati del suolo di Phoenix con gli isolati di pazienti nella stessa area ha rilevato che gli isolati ambientali erano geneticamente più diversi degli isolati clinici, ma non c'erano prove per un sottoinsieme di ceppi più patogeni che potrebbero spiegare la crescente incidenza di infezioni in quella zona [6,34].

I genomi di Coccidioides spp. sono 28-29 megabasi (Mb). Almeno quattrocromosomisono stati identificati mediante elettroforesi su gel con ritrovamento elettrico omogeneo fissato al contorno [36]. I genomi sono aploidi e non sono stati osservati accoppiamenti all'interno o tra le specie, sebbene siano presenti geni che codificano per le funzioni di accoppiamento[2] e si verifichi una ricombinazione genetica [35]. Circa il 18% del genoma è costituito da DNA ripetitivo. Coccidioides sp. sembra avere un meccanismo di mutazione indotto dalla ripetizione per controllare la proliferazione dei trasposoni [35]. Si trovano sia il DNA che i trasposoni a ripetizione terminale lunga; Gypsy, che è un trasposone simile a un retrovirus comune nei funghi, è il tipo più comune di trasposone. I trasposoni si trovano più frequentemente nelle regioni genomiche che hanno pochi geni strutturali e di solito si trovano in cluster [37]. La maggior parte dei trasposoni è degenerata e non dispone di tutti i domini necessari per la trasposizione. Ci sono alcune prove che i trasposoni di C. sono preferenzialmente associati a geni che codificano per la fosforilazione delle proteine. Inoltre, molti geni C. affiancati da alcune superfamiglie di trasposoni sono scarsamente espressi [37]. Di interesse, un test PCR recentemente concesso in licenza dalla FDA per l'identificazione di organismi incampioni clinicie una nuova modifica di quel test che è sia sensibile che specifico per l'uso su campioni di suolo, il test mira a un retrotrasposone simile a Copia che è presente con un numero elevato di copie nel genoma [16].

Le famiglie di geni che codificano per l'attività della fosfotransferasi, le protein chinasi e le proteinasi, comprese le subtilasi e le cheratinasi, sono espanse in Coccidioides spp. rispetto a specie strettamente imparentate [3]. Ciò suggerisce che Coccidioides spp. magari specializzato per la crescita di proteine ​​oltre ai carboidrati. Ci sono quasi 800 geni che sono unici per Coccidioides spp. e alcuni sono preferibilmente trascritti in sferule (vedi sotto).

Dimorfismo

Tutti i principali patogeni fungini eccetto Cryptococcus spp. condividono la caratteristica di essere termicamente dimorfici, crescere come muffe nel terreno e differenziarsi in lievito o sferula all'interno dei mammiferi. Coccidioides sp. cresce come micelio (muffa) nel terreno e forma spore note come artroconidi all'interno del micelio mentre maturano (Figura 2).Artroconidivengono rilasciati quando il suolo contaminato viene disturbato e ognuno ha il potenziale per formare un nuovo micelio se atterra nel suolo, o una sferula se infetta gli animali sensibili. Per la patogenicità è richiesta la capacità di formare sferule dagli artroconidi. Gli artroconidi si arrotondano e diventano sferule immature per crescita isotropa. La maturazione delle sferule comporta il rigonfiamento circonferenziale dell'organismo e la divisione sincrona dei nuclei e del citoplasma per riempire la sferula con centinaia di endospore di 2-4 micron. Quando una sferula matura si rompe, quelle endospore vengono rilasciate e ognuna di esse ha il potenziale per formare un'altra sferula. La differenziazione dell'endospora in sferule mature richiede circa 4-6 giorni in vivo, quindi il numero di sferule può aumentare molto rapidamente. La trasformazione da artro-conidi a sferule quando viene coltivata in un mezzo definito richiede uno spostamento della temperatura da 25 gradi a 37 gradi e un aumento della CO atmosferica al 10-14 percento [38]. Si presume che condizioni simili richiedano lo sviluppo della sferula in vivo, ma ci sono anche prove che il contatto con i neutrofili può stimolare la conversione degli artroconidi in sferule (39). alle forme ifali che contengono rigonfiamenti che sembrano essere tentativi abortiti di creare sferule [40].

Figura 2. Mvcelia contenente artroconidi e una sferula matura con endospore, (a) micelio maturo cresciuto in vitro che mostra artroconidi macchiati di scuro alternati a segmenti nucleati a parete sottile all'interno del micelio (colorazione blu cotone lattofenolo). (b) Una sferula contenente endospore nel tessuto (Periodic Acid Schiff (PAS). L'immagine è stata ottenuta dal CDC(HTTPS/Phil.Phil/details.asp). Questa cifra è stata precedentemente pubblicata nel Journal of Fungi [70].

Relativamente poco si sa del cambiamento nel programma trascrizionale che media la sorprendente trasformazione da artroconidi a sferule. Ci sono solo due studi pubblicati che confrontano il trascrittoma del micelio con quello delle sferule coltivate in vitro; uno ha studiato sia C. che C. posadas usando RNA-seq e l'altro ha studiato solo C., usando un microarray open reading frame dell'intero genoma [41,42]. IlRNA-seqlo studio ha confrontato il micelio e le sferule del giorno 4 e si è concentrato sui geni che erano espressi in modo differenziale in entrambe le specie. Il 13 percento dei geni era sovraregolato più del doppio nelle sferule di entrambe le specie, comprese le proteine ​​associate alla chitina, la -(1,3) glucano sintasi e la glicoproteina della parete esterna della sferula. Lo studio del microarray ha confrontato il micelio di C. immitis con le sferule del giorno 2 (all'inizio del processo di trasformazione) e del giorno 8 (endosporulante). Il livello di espressione del 22 percento dei geni è stato regolato verso l'alto o verso il basso più del doppio nelle sferule del giorno 2 o 8 rispetto al micelio. C'erano anche differenze significative tra i trascrittomi del giorno 2 e le sferule del giorno 8 (Figura 3). L'ossidoreduttasi (inclusa la superossido dismutasi extracellulare che potrebbe aiutare a proteggere dall'uccisione dei neutrofili) è sovraregolata nelle sferule del secondo giorno, così come i trasportatori dello zucchero, la tioesterasi e l'amilasi. Circa un terzo dei geni sovraregolati in vivo non ha una funzione assegnata e il 5% si trova solo in Coccidioides spp [42]. Una delle famiglie di geni più interessanti che sono sottoregolate in C. immitis spherules è la famiglia delle proteine ​​chinasi; 28 dei 184 geni previsti per le proteine ​​chinasi erano sottoregolati. Alcuni dei geni della proteina chinasi down-regolati codificano per il ciclo cellulare, la parete cellulare e le proteine ​​correlate alla risposta allo stress. La relazione tra la down-regulation di questi geni e la formazione di sferule non è chiara.

Figura 3. Numero di geni sovraregolati in sferule di tre diverse scadenze. Il diagramma di Venn dei geni di C. immitis ha sovraregolato più di 2- volte rispetto all'espressione genica del micelio. (a) I dati per le sferule del giorno 4 provengono da [41] e (b) i dati per le sferule del giorno 2 e del giorno 8 provengono da [42].

Uno dei geni sovraregolati trovati in entrambi gli studi è la 4-idro fenilpiruvato diossigenasi (4-HPPD o PDA). Questo enzima fa parte di un complesso di geni coinvolti nel catabolismo della tirosina. 4-HPPD degrada l'{3}}omogentisato di idrossifenilpiruvato, che è tossico. L'omogentisato viene ulteriormente catabolizzato o ossidato e polimerizzato per formare feomelanina [43]. 4-È stato riscontrato che l'HPPD è sovraregolato nella fase di lievito di tutti i funghi patogeni primari dimorfici [44]. L'interruzione del gene 4-HPPD in Talaromyces mar-non si traduce mai in un mutante che non può crescere e differenziarsi in lievito all'interno dei macrofagi [45]. Gli autori di questo studio ritengono improbabile che questo fenotipo sia direttamente correlato all'effetto di 4-HPPD sul metabolismo della tirosina perché altre mutazioni nella via del catabolismo della tirosina non avevano quel fenotipo, quindi suggeriscono che 4- HPPD potrebbe avere altre proprietà sconosciute.

Nonostante le differenze nel disegno sperimentale e nell'analisi dei dati, ci sono 152 geni che sono stati sovraregolati nelle sferule in entrambi gli studi, indipendentemente dallo stadio di maturazione (Figura 3). Molti di questi geni sovraregolati si trovano nelle vie enzimatiche del metabolismo dei carboidrati complessi (Tabella 1). L'arricchimento dei geni nelle vie complesse dei carboidrati sembra plausibile poiché è necessario un ampio rimodellamento e sintesi di nuove pareti cellulari per la trasformazione e la crescita di sferule ed endospore. Ventisei dei geni comuni sovraregolati nelle sferule erano anche sovraregolati nel processo diIstoplasmadifferenziazione capsulatum in lievito[46]. Oltre a 4-HPPD, questi includono diversi trasportatori di zucchero, un trasportatore di solfito, amilasi, cheto-reduttasi, una protein chinasi e un gene della polichetide sintasi. Non sono stati pubblicati studi sul trascrittoma delle sferule di Coccidioides in vivo. La proteomica è un altro approccio che può identificare i geni espressi nelle sferule e convalidare le cosiddette proteine ​​ipotetiche. Esiste uno studio pubblicato che utilizza questo approccio che ha identificato le proteine ​​​​nel micelio e nelle sferule di C.posa-dashi [47]. Hanno rilevato 837 proteine ​​(8% del totale previsto dalla sequenza del DNA), l'88% delle quali corrispondeva alle proteine ​​previste dall'analisi del genoma. Hanno anche identificato 172 nuove proteine, la maggior parte delle quali potrebbe essere attribuita allo splicing differenziale dei geni. È stata espressa una proteina trasposone, indicando che almeno un trasposone è ancora trascrizionalmente attivo. Studi come questo miglioreranno senza dubbio l'annotazione del genoma.

Sebbene questi dati trascrittomici possano identificare geni che sono espressi preferenzialmente nelle sferule, non ci dicono quali geni sono necessari affinché gli artroconidi si differenziano in sferule e quali cambiamenti nell'espressione siano una conseguenza della trasformazione [46]. Il modo più conclusivo per identificare i geni essenziali per la formazione di sferule è eliminarli o regolarne l'espressione con un RNA regolatorio e osservare il fenotipo.

Sono stati realizzati solo pochi mutanti di eliminazione a causa della difficoltà di effettuare mutazioni mirate. I geni della chitinasi 2 e 3 sono espressi a livelli più elevati nelle sferule rispetto ai miceli e si è ipotizzato che siano importanti per il rimodellamento della parete cellulare delle sferule in maturazione [48]. Un doppio knockout di quei geni ha prodotto un mutante che non produce sferule mature con endospore ed è avirulento nei topi. Questo mutante era un efficace vaccino vivo attenuato nei topi. Il gene CPSI è importante anche per la virulenza poiché la delezione del gene ha prodotto sferule che crescevano più lentamente del tipo selvatico, non potevano endosporulare e il mutante era avirulento anche in topi altamente immunocompromessi [49]. Il prodotto del gene CPSI non è ben caratterizzato. Il gene è stato scelto come bersaglio perché il suo omologo è associato alla patogenicità nelle eterostrofe di Cochiobolus. Nelle sferule mutanti, 33 geni erano up o down-regolati rispetto alle sferule wild-type [49]. È difficile dedurre la funzione di CPSI dai geni regolati verso l'alto e verso il basso. Questo mutante è anche un efficace vaccino vivo nei topi. Anche la delezione del gene codificante per una glicoproteina della parete esterna della sferula ha ridotto significativamente la virulenza[50]. La glicoproteina della parete esterna è prodotta esclusivamente nelle sferule e forma lo strato più esterno che viene a contatto con le cellule ospiti. Questa proteina ricca di prolina è anche un'adesina nota per legarsi alla laminina.

Anche gli enzimi coinvolti nel metabolismo dell'ammoniaca sono importanti per la virulenza. I tessuti infetti nei topi sono piuttosto alcalini e Coccidioides sintetizza sia un enzima ureasi che l'ureidoglicolato idrolasi, un enzima che degrada l'ureidoglicolato in ammoniaca e gliossilato (UGH). Un mutante a doppio knockout di ureasi e UGH produce meno ammoniaca ed è altamente attenuato anche nei topi BALB/c geneticamente suscettibili, suggerendo che la capacità di alcalinizzare il loro ambiente è importante per la patogenicità [51]. Tuttavia, poiché lo shunt del gliossilato è anche una via metabolica nei funghi per la generazione di energia in assenza di glucosio, la mutazione UGH può avere effetti deleteri diversi dalla ridotta produzione di ammoniaca.

Immunologia

Esiste una forte correlazione tra il tipo di risposta immunitaria che le persone fanno e la prognosi della coccidioidomicosi polmonare acuta. La maggior parte delle persone ha infezioni polmonari autolimitanti e sviluppa un'ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) misurata da test cutanei positivi alla coccidiosi o alla sfera interna, ma producono solo bassi titoli di anticorpi fissanti il ​​complemento (CF). Al contrario, i pazienti che continuano a diffondere l'infezione producono alti titoli di anticorpi contro la FC e non sviluppano DTH [30,52]. Anche se questo è noto da molti decenni, c'è poca o nessuna comprensione di ciò che guida la risposta immunitaria verso un percorso TH1 (DTH, IFNy) nelle persone che stanno bene. Chiaramente, le cellule T CD4 sono necessarie poiché i pazienti con una bassa conta di CD4 a causa dell'AIDS non trattato sono ad alto rischio di infezioni disseminate [53] Anche i pazienti trattati con inibitori del fattore di necrosi tumorale sono a rischio più elevato [54]. Sappiamo anche da rare mutazioni genetiche umane che l'incapacità di produrre o rispondere a IFNy è un rischio per la diffusione dell'infezione [55,56]. Una mutazione del guadagno di funzione nello Stato predispone anche alla coccidioidomicosi disseminata e all'istoplasmosi, ma il meccanismo(i) alla base di questa maggiore suscettibilità ai funghi dimorfici invasivi non è chiaro [57].

La risposta immunitaria all'infezione e alla vaccinazione è stata ampiamente studiata nei topi. È generalmente accettato che la risposta immunitaria innata determini la natura della risposta immunitaria adattativa, e questo è vero anche nella coccidioidomicosi sperimentale. DBA/2, un ceppo murino altamente resistente produce più IL-12p70, L-23p19, IFNy, State e IL-17a e meno IL-10 dopo l'infezione rispetto a ceppi altamente suscettibili, sia in vivo che in vitro[58,59]. Nei topi, l'aumento della produzione di IL-10 si traduce in una maggiore suscettibilità e, al contrario, i topi IL{10}} KO sono più resistenti dei topi suscettibili ceppo parentale, molto simile a DBA/2, il ceppo consanguineo più resistente [60]. L'unico fattore noto di queste differenze nei topi è la dectina-1, il recettore del glucano, che è espresso sulle cellule dendritiche e su altre cellule mieloidi [6]. Esiste una differenza nella struttura e nella funzione di Dectin-1 nei topi B6 suscettibili e nei topi DBA/2 resistenti che si basa sullo splicing alternativo del gene codificante, ClecZa [59]. Quel gene è anche splicing alternativamente nelle cellule umane [62,63], ma non ci sono studi su come tale splicing differenziale influenzi la risposta umana alle sferule.

È probabile che anche la dectina{0}} sia almeno parzialmente responsabile della generazione di una risposta immunitaria TH17 poiché le sferule interagiscono fortemente con quel tipo C dei recettori della lectina [59]. Una mutazione del recettore IL-17 altera la capacità dei topi di sviluppare l'immunità dopo la vaccinazione da parte di un ceppo vivo avirulento di C.posadasi[64]. Un paziente con una mutazione STAT-3, che colpisce la differenziazione CD4 TH17, ha sviluppato una meningite individuale [65,66]. Poiché STAT-3 è coinvolto anche in molte altre vie di segnalazione, è possibile che i bassi livelli di IL-17a riscontrati in questi pazienti non siano l'unica spiegazione della sua suscettibilità.

Anche il meccanismo con cui le sferule e/o le endospore vengono uccise in vivo è sconosciuto, ma deve dipendere indirettamente dai linfociti T CD4 più poiché esiste una correlazione inversa tra la conta totale dei CD4 e il rischio di coccidioidomicosi disseminata nei pazienti con AIDS [67]. Le molecole effettrici che effettivamente uccidono o inibiscono la moltiplicazione del fungo in vitro sono sconosciute. Le persone con la malattia granulomatosa cronica non sono apparentemente più suscettibili a questi agenti patogeni, né i topi con un difetto genetico ortologo [68], quindi la NADPH ossidasi non è necessaria. C'è una certa incertezza sul ruolo di iNOS. Un inibitore della NOS ad ampio spettro ha aumentato la suscettibilità dei topi DBA/2 a C. immitis [69]. Al contrario, un ceppo murino mutante Nos2 non era più suscettibile [70]. Tuttavia, quella mutazione è stata effettuata nei topi C57BL/6, che a loro volta producono pochissimo NO in risposta a questa infezione [69].

Sforzi vaccinali

L'immunità indotta dal vaccino contro la coccidioidomicosi sembra fattibile perché le seconde infezioni sintomatiche da Coccidioides spp. sono straordinariamente rari (non si possono escludere infezioni subcliniche che potenziano l'immunità in aree altamente endemiche)[71]. Il successo della vaccinazione richiede una risposta immunitaria mediata dai linfociti T con entrambe le risposte immunitarie e TH17 che svolgono un ruolo nella protezione mediata dal vaccino [64]. Non ci sono prove che la risposta anticorpale sia protettiva negli esseri umani in quanto non vi è alcuna associazione tra deficit di immunoglobuline ereditari o acquisiti e coccidioidomicosi disseminata, ma nei modelli murini vi sono prove contrastanti sul fatto che i linfociti B siano necessari per l'immunità indotta dal vaccino [72,73 ]. Idealmente, un vaccino preverrebbe o ridurrebbe drasticamente l'incidenza dell'infezione, ma uno che potrebbe prevenire l'infezione sintomatica e proteggere quelli ad alto rischio di malattia disseminata sarebbe considerato un successo dal punto di vista digitale.

I candidati vaccinali sono stati tutti testati inizialmente su topi consanguinei geneticamente suscettibili e molti vaccini proteici ricombinanti li proteggono da piccoli ma non da grandi inoculi di artroconidi. È ora possibile identificare e produrre proteine ​​clonate ricombinanti che possono essere testate come antigeni per un vaccino perché i genomi di C. immitis e C.posadasii sono disponibili e ci sono abbastanza genomi completamente sequenziati in modo che si possa scegliere altamente proteine ​​conservate. Sfortunatamente, al momento non c'è modo di prevedere quali proteine ​​sferule susciteranno un'immunità protettiva. Inizialmente si credeva che le proteine ​​di superficie altamente espresse sarebbero state i migliori vaccini, ma non tutte le proteine ​​della superficie cellulare sono protettive (osservazioni non pubblicate, TNK). La tabella 2 mostra alcune delle proteine ​​ricombinanti che sono state testate come vaccini [71]. La protezione è stata valutata dalla diminuzione della conta delle colonie fungine dalla coltura quantitativa di polmoni e milza e, in alcuni casi, dalla sopravvivenza. I criteri esatti variavano da uno studio all'altro. Gli antigeni singoli tendono a essere moderatamente protettivi nella migliore delle ipotesi [74-76]. L'approccio multiproteina/epitopo sembrava produrre i vaccini a subunità più promettenti[77-79]. Un vaccino a doppia proteina è stato testato nei macachi cynomolgus e si è verificata una riduzione del carico di malattia, ma la vaccinazione non ha prodotto un'immunità sterilizzante [79]. Nonostante i risultati promettenti su topi e scimmie, lo sviluppo di un vaccino proteico ricombinante richiede decisioni importanti su quali sono le proteine ​​migliori, la quantità di tali proteine, l'adiuvante, la formulazione e quante dosi saranno necessarie per realizzare un vaccino efficace. Forse ancora più importante, è necessario un partner farmaceutico disposto a produrre il prodotto, data la popolazione relativamente piccola a rischio di infezione. Anche un'attenta pianificazione di una sperimentazione clinica è fondamentale. Per tutti questi motivi, non è realistico aspettarsi che un vaccino sia pronto per la valutazione clinica nel prossimo futuro.

Riepilogo

Lo studio di Coccidioides spp. ha compiuto notevoli progressi nell'ultimo decennio. La nostra comprensione dell'ecologia e della biologia della popolazione di questi organismi è notevolmente migliorata. La disponibilità della sequenza genomica di un certo numero di ceppi è stata preziosa per molti aspetti della ricerca, inclusa la creazione di diversi ceppi knockout che sono altamente attenuati e forniscono importanti conoscenze sulla patogenesi. L'immunologia della coccidioidomicosi e Coccidioides spp. i vaccini sono meglio compresi. Sfortunatamente, ci sono lacune significative nelle nostre conoscenze. Sono ancora necessarie ulteriori informazioni sull'ecologia di questo organismo. La comprensione della biologia della trasformazione dal micelio alle sferule è nella migliore delle ipotesi limitata. Sono inoltre necessarie ulteriori informazioni sulla risposta immunitaria umana all'infezione. Nonostante la clonazione, l'espressione e il test di un certo numero di proteine, non è stato sviluppato un vaccino a subunità. Questi e altri argomenti offrono molte sfide per il futuro.