La combinazione dell'infusione di cellule NK adottive con un peptide a rilascio di dopamina riduce le cellule senescenti nei topi anziani

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INTRODUZIONE

L'invecchiamento è uno dei principali fattori di rischio per molte malattie [1] e lo sviluppo di metodi per intervenire sull'invecchiamento ridurrà significativamente il rischio di una serie di malattie legate all'età come le malattie cardiovascolari e cerebrovascolari [2, 3], il cancro [4] e morbo di Alzheimer [5]. Le cellule senescenti (SNC) si accumulano gradualmente nei tessuti durante il processo di invecchiamento e sono considerate la principale causa di malattie legate all'età [6-8]. È stato dimostrato che la rimozione di SNC nei modelli murini previene o ritarda la disfunzione tissutale e prolunga la vita sana [9, 10]. Al contrario, il trapianto di piccole quantità di SNC provoca disfunzioni fisiologiche nei topi giovani [1]. Questi studi hanno aperto le porte allo sviluppo di metodi che mirano alla rimozione delle SNC per migliorare le malattie croniche legate all'età.

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La clearance mirata delle SNC, denominata "senolitica", è stata la prima chemioterapia testata con successo in un modello preclinico in vivo e attualmente esistono diversi agenti senolitici [12]. Molti di questi farmaci prendono di mira le vie anti-apoptotiche sovraregolate nei SNC per eliminare selettivamente alcuni tipi di SNC e hanno mostrato il potenziale per prolungare la durata della vita e migliorare le funzioni corporee [13, 14].Estratto di Cistanche Anti RadiazioniNonostante l'inversione di successo della patologia legata all'età nei modelli animali, potrebbero esserci alcuni ostacoli all'uso di farmaci senolitici nell'uomo a causa dell'eterogeneità dei SNC e dell'alto rischio di tossicità [15]. Pertanto, dovrebbe essere esplorato un metodo alternativo in grado di eliminare in modo sicuro un'ampia gamma di SNC negli esseri umani.

Gli SNP possono essere riconosciuti e rimossi dal sistema immunitario [16]. Precedenti studi hanno dimostrato che gli SNC attivano le cellule natural killer (NK) sovraregolando il ligando di attivazione della proteina A e B legata alla catena di istocompatibilità principale di classe I [17]. Tuttavia, con l'aumentare dell'età, l'efficienza del sistema immunitario diminuisce, il che può portare alla fuga immunitaria dei SNC [18]. Nella terapia del cancro sono stati esplorati metodi per superare la fuga immunitaria causata dalla diminuzione della funzione immunitaria [19]. Sono stati fatti recenti progressi nel trasferimento adottivo di cellule NK per eliminare i tumori, che ha mostrato una certa efficacia [20]; quindi, era ragionevole presumere che l'infusione adottiva di cellule NK potesse produrre citotossicità nei SNC.

Il sistema nervoso e quello immunitario sono i due sistemi adattativi più importanti del corpo. Diversi studi hanno dimostrato che la dopamina (DA) come regolatore immunitario è una chiave per la comunicazione neuroimmune [21]. DA svolge le sue funzioni biologiche mediante l'interazione e l'attivazione dei recettori della dopamina (DR), che sono divisi in 2 sottogruppi, D1-simili (D1 e D5) e D2-simili (D2, D3, e D4). In termini di diverse funzioni, l'impegno di D1-come DR stimola la produzione di cAMP, mentre l'impegno di D2-come DR inibisce la produzione di cAMP [22]. Studi precedenti hanno dimostrato che la stimolazione D1-simile a DR migliora la citotossicità delle cellule NK sia in vitro [23] che in vivo [24]. Tuttavia, i livelli di DA diminuiscono con l'aumentare dell'età umana [25]. Pertanto, abbiamo ipotizzato che i farmaci dopaminergici potrebbero aumentare la citotossicità dell'infusione adottiva di cellule NK.

Cistanche può antietà

Qui, proponiamo l'uso del nonapeptide Acein, che ha interagito con un enzima di conversione dell'angiotensina (ACE I) per indurre la secrezione di DA [26], in combinazione con la terapia cellulare NK sistemica per eliminare gli SNC. I risultati in vitro hanno mostrato che le cellule NK rimuovevano le SNC, indipendentemente dagli induttori di senescenza e dai tipi cellulari.cistanche erbaIn un modello murino che invecchia, la terapia con cellule NK in combinazione con Aceina ha ridotto significativamente il numero di cellule-galattosidasi associate alla senescenza (SA- -gal)-positive in più tessuti, ha diminuito l'espressione dei geni associati alla senescenza negli organi principali e ha alleviato i fenotipi secretori associati alla senescenza (SSP). I risultati di questo studio forniscono informazioni sul possibile ripristino della sorveglianza immunitaria degli SNC cronici utilizzando la terapia cellulare NK in combinazione con Ace.

RISULTATI

L'infusione adottiva di cellule NK riduce le cellule CD3 più T senescenti nel sangue periferico

Ventisei volontari che hanno ricevuto l'infusione di cellule NK sono stati reclutati per lo studio. Le caratteristiche e le proprietà delle cellule NK dei volontari sono presentate nella Tabella 1. L'intervallo di tempo per la raccolta del sangue dopo la trasfusione di cellule NK era di circa 37 (25-57) giorni. La proporzione (Fig.1A) e il numero assoluto (Fig.1B) di cellule NK nel sangue periferico erano inversamente correlati all'età dei volontari. Sorprendentemente, la purezza del prodotto cellulare NK reinfuso in ciascun individuo era anche inversamente correlata all'età dei volontari (Fig.1C).crescita del pene cistancheCiò può essere dovuto alla diminuzione graduale del numero di cellule NK con l'aumentare dell'età. Al fine di riflettere l'effetto anti-invecchiamento della somministrazione di cellule NK, prima e dopo l'infusione di cellule NK sono stati rilevati più marcatori senescenti nel sangue periferico CD3 più cellule T, che riflettono ampiamente il fenotipo del corpo correlato all'età [27]. Rispetto ai marcatori di senescenza e al fattore SASP dei linfociti T CD3 più nel sangue periferico prima e dopo l'infusione di cellule NK autologhe, la proporzione di cellule T SA- - gal-positive era significativamente ridotta dopo l'infusione (Fig.1D). I livelli di mRNA di P16, P21 e inibitore dell'attivatore del plasminogeno 1(Pai1) sono stati significativamente ridotti, mentre le variazioni dei livelli di mRNA della proteina chemiotattica dei monociti-1 (MCP-1) e IL-6 non erano significativi (Fig. 1E). Non c'era alcuna differenza significativa negli indici biochimici (Tabella Supplementare 1) nel sangue periferico.

Le cellule NK umane riducono i marcatori di senescenza del tessuto adiposo e la secrezione di citochine proinfiammatorie

Il tessuto adiposo è stato raccolto da tre individui obesi, poiché l'obesità tende a causare un accumulo di SNC [28]. Inoltre, il tessuto adiposo è stato coltivato in un mezzo condizionato da SNC per indurre ulteriormente la senescenza del tessuto adiposo. Il tessuto adiposo coltivato in un mezzo condizionato da non SNC è stato considerato come il controllo. L'espressione di Perforin (Fig.2A) e CD69 (Fig.2B) nelle cellule NK era significativamente regolata dopo la co-incubazione con tessuto adiposo senescente rispetto alla co-incubazione con tessuto adiposo di controllo. L'espressione dei marcatori senescenti p16 e p21 in

il tessuto adiposo senescente era significativamente ridotto dopo il trattamento con cellule NK (Fig.2C, Fig.1A, B supplementare). Abbiamo anche scoperto che il componente chiave di SASP nel mezzo condizionato dopo la co-incubazione con cellule NK nel gruppo senescente era significativamente ridotto (Fig. 2D). Questi risultati hanno suggerito che le cellule NK potrebbero eliminare le SNC dal tessuto adiposo e ridurre il fenotipo SASP.

Le cellule NK di topo possono essere attivate contro SNC ed esercitare citotossicità

Per prima cosa abbiamo indotto la senescenza delle cellule progenitrici adipose di topo mediante irradiazione o adriamicina come descritto in precedenza [29]. Per determinare se le cellule NK sono state specificamente attivate dalle SNC, le cellule di controllo non irradiate o le SNC irradiate sono state co-incubate con le cellule NK per 24 ore. La citometria a flusso ha mostrato che i livelli di espressione di CD69 (Fig.3A) e IFN-y (Fig.3B) nelle cellule NK erano significativamente sovraregolati nelle cellule bersaglio SNC rispetto alle cellule bersaglio di controllo. Nel frattempo, dopo la co-incubazione con le cellule NK, il livello apoptotico delle SNC era significativamente superiore a quello delle cellule di controllo (Fig.3C). Successivamente, abbiamo rilevato l'espressione di ligandi attivatori e inibitori delle cellule NK negli SNC. I risultati della qPCR hanno mostrato che il livello di espressione dei ligandi attivanti nelle cellule NK era significativamente sovraregolato rispetto alle cellule di controllo e il livello di espressione di alcuni ligandi inibitori, come la beta 2 microglobulina (2 m), era sottoregolato rispetto alle cellule di controllo (Fig. .3D). Abbiamo anche esaminato la capacità delle cellule NK di eliminare gli SNC in vivo.benefici della salsa cistancheLe cellule di controllo marcate con DiR e le SNC marcate con DiR sono state trapiantate nella cavità addominale dei topi e le cellule NK sono state somministrate attraverso la vena della coda. I risultati dell'imaging in vivo hanno mostrato che l'intensità della fluorescenza nei topi trapiantati con SNC dopo il trattamento con cellule NK era significativamente più debole di quella nei topi trapiantati con cellule di controllo (Fig. 3E). Ciò indicava che la capacità delle cellule NK di uccidere gli SNC era significativamente superiore a quella degli SNC in vivo. Successivamente, abbiamo determinato se la citotossicità delle cellule NK contro gli SNC fosse dose-dipendente e cellula-specifica. Allo stesso tempo, abbiamo anche utilizzato la senescenza indotta dalla doxorubicina per determinare se la citotossicità delle cellule NK contro gli SNC fosse limitata all'induzione di radiazioni. I risultati hanno mostrato che le cellule NK avevano una significativa attività citotossica contro gli SNC in modo dose-dipendente, ma poca citotossicità contro le cellule di controllo. Diversi metodi di stimolazione della senescenza non hanno avuto alcun effetto sulla capacità delle cellule NK di uccidere gli SNC (Fig.3F). Questi risultati hanno suggerito che le cellule NK potrebbero essere specificamente attivate dalle SNC e produrre una significativa citotossicità contro le SNC in vitro e in vivo.

DA migliora la citotossicità delle cellule NK di topo contro le SNC attraverso i recettori D1-simili

In considerazione dell'importante funzione di comunicazione neuroimmune della DA [30], abbiamo valutato se la DA potrebbe aumentare la citotossicità delle cellule NK di topo contro le SNC. Le cellule NK sono state co-incubate con SNC indotte da radiazioni e al mezzo sono state aggiunte diverse concentrazioni di DA. I risultati hanno mostrato che la DA potrebbe aumentare la citotossicità delle cellule NK contro gli SNC (Fig. 4A, B). Per caratterizzare la via di segnalazione mediante la quale DA ha migliorato l'effetto di uccisione delle cellule NK sugli SNC, sono state valutate le modifiche nell'espressione di DR, nel contenuto di cAMP e nella fosforilazione della proteina legante l'elemento della risposta di cAMP (CREB) nelle cellule NK. Nelle cellule NK co-incubate con SNC insieme a DA, il contenuto di cAMP (Fig. 4C) e il livello di fosforilazione di CREB (Fig. 4D, Fig. 2A supplementare) erano significativamente aumentati, rispetto alle cellule NK e alla co-incubazione SNC senza DA. Al fine di chiarire perché DA migliora l'attività di uccisione delle cellule NK contro SNC, abbiamo confrontato i cambiamenti di DR sulle cellule NK dopo che le cellule NK sono state co-incubate con SNC o cellule di controllo. I risultati hanno mostrato che il livello di espressione di D1 e D5 DR era significativamente sovraregolato dopo che le cellule NK sono state co-incubate con SNC rispetto alle cellule di controllo (Fig.4E). Successivamente, DA e D{15}}come gli antagonisti dei recettori o D2-come

gli antagonisti del recettore sono stati aggiunti insieme nel sistema di co-incubazione delle cellule NK e degli SNC. Rispetto all'aggiunta del solo DA, il livello di apoptosi degli SNC è stato ridotto con l'aggiunta di DA più SCH-23300 (antagonista del recettore simile a D1-) (Fig.4F, G). Nel frattempo, il contenuto di cAMP (Fig. 4H) e il livello di fosforilazione di CREB (Fig. 4l, Fig. 2B supplementare) nelle cellule NK sono stati sottoregolati. Al contrario, l'aggiunta di DA più aloperidolo (antagonista del recettore D2) non ha modificato significativamente il livello di apoptosi degli SNC, il contenuto di cAMP e la fosforilazione di CREB nelle cellule NK, rispetto all'aggiunta di DA da solo. Questi risultati hanno dimostrato che la DA ha migliorato l'attività di uccisione delle cellule NK del topo contro le SNC attraverso D1-come i Drs.

Ace combinato con cellule NK di topo migliora significativamente la clearance degli SNC in vivo

Uno studio precedente ha dimostrato che la dopamina diminuisce con l'età negli esseri umani [22]. Per prima cosa abbiamo misurato il livello periferico di dopamina nei topi giovani e vecchi. I risultati hanno indicato che i livelli plasmatici di dopamina dei topi vecchi erano inferiori a quelli dei topi giovani (Fig. 5A). Successivamente, il rilascio periferico di dopamina dopo l'iniezione intraperitoneale di Acein è stato esplorato nei topi anziani. Abbiamo scoperto che i livelli plasmatici di dopamina aumentavano significativamente dopo un'iniezione di 10 mg/kg di Aceina (Fig.5B, Fig.3 supplementare). In considerazione di ciò, abbiamo eseguito cellule NK di topo combinate con Acein per trattare i topi anziani. Abbiamo rilevato lo stato delle cellule NK nel sangue periferico dei topi dopo il trattamento e abbiamo scoperto che il numero di cellule NK nel sangue periferico dell'infusione di cellule NK da sole o cellule NK combinate con Aceina era significativamente superiore a quello del gruppo trattato con Ace e gruppo PBS, mentre il numero di cellule NK non era significativamente diverso tra il gruppo trattato con cellule NK e le cellule NK combinate con il gruppo trattato con Aceina (Fig.5C, D).cistanche tubulosa dosaggio redditUn ulteriore rilevamento del livello di attivazione delle cellule NK ha mostrato che il livello di espressione di CD69 nelle cellule NK del sangue periferico nel gruppo trattato combinato era significativamente sovraregolato rispetto al gruppo trattato con cellule NK (Fig.5E). Successivamente, abbiamo valutato gli SNC nel tessuto. Abbiamo scoperto che l'infusione di cellule NK da sole riduceva l'espressione di alcuni marcatori senescenti rispetto al gruppo PBS e al gruppo trattato con Aceina, mentre l'infusione di cellule NK combinate con Aceina riduceva significativamente le cellule SA- -gal-positive (Fig. 5F ) nonché i livelli di espressione di P16 e P21 (Fig. 5G, Fig. 4A, B supplementare) nel tessuto adiposo, rispetto al trattamento delle sole cellule NK. Anche il numero di cellule Ki67BrdU nel tessuto adiposo è stato significativamente aumentato (Fig. 5H), dimostrando ulteriormente che il contenuto di SNC nel tessuto adiposo era inferiore nel gruppo trattato combinato. La colorazione SA- -gal delle sezioni di fegato, polmone, rene e grasso mostrava anche il livello più basso di SNC nel gruppo trattato combinato (Figura 5A-D supplementare). Questi risultati hanno mostrato che le cellule NK combinate con la terapia con aceina hanno migliorato il livello di attivazione delle cellule NK nei topi e hanno causato una significativa eliminazione di SNC in vivo.

Ace combinato con cellule NK riduce i fenotipi legati all'età nei topi anziani

Per confermare ulteriormente i fenotipi legati all'età nei topi, sono stati raccolti tessuti del fegato, dei polmoni, dei reni, del grasso e degli occhi per rilevare una varietà di marcatori senescenti inclusi i fattori P16, P21 e SASP. Questi campioni sono stati scelti perché questi tessuti hanno maggiori probabilità di subire senescenza con l'età [31]. In ciascun tessuto, dopo la sola infusione di cellule NK, i livelli di mRNA dei fattori P16, P21 e SASP erano significativamente inferiori a quelli del gruppo di controllo, mentre i livelli di marker di senescenza nei tessuti di fegato, grasso ed eva nei tessuti trattati combinati il gruppo è stato ulteriormente ridotto rispetto al gruppo trattato con la sola infusione di cellule NK (Fig. 6A). Allo stesso modo, abbiamo anche rilevato il principale fattore SASP nel siero dei topi e i risultati erano coerenti con i risultati nei tessuti (Fig.6B). Inoltre, abbiamo anche esaminato i livelli di NAD nel fegato e nel tessuto adiposo, che sono legati all'invecchiamento [32]. Abbiamo scoperto che l'infusione di cellule NK da sole o in terapia combinata aumentava significativamente il contenuto di NAD nel fegato e nel tessuto adiposo, il livello di miglioramento era significativamente più alto nel gruppo di terapia combinata (Fig. 6C). Alcuni indici biochimici sierici tra cui ALT, AST, CREA, UA, CHOL e BUN sono associati ai livelli di invecchiamento [33]. Abbiamo scoperto che solo l'UA era significativamente ridotta nel siero dei topi nel gruppo trattato in combinazione, mentre gli altri indici biochimici chiave non lo facevano

MATERIALI E METODI Infusione di cellule NK umane

L'infusione di cellule NK autologhe è stata eseguita dallo Shanghai Mengchao Cancer Hospital (Shanghai, Cina) e tutti i protocolli sono stati approvati dal loro comitato etico (n. 05,2020, Medical Ethics Committee of Shanghai Mengchao Cancer Hospital). Tutti i volontari hanno fornito il consenso informato firmato per ottenere sangue periferico. In breve, sono stati estratti 50 ml di sangue periferico da ciascun individuo, dopo di che le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state isolate e trasferite in un pallone T75 con ExCellerate" Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems, USA) contenente 1 × Cloudz CD2/NKp46 , IL umano ricombinante-2(27ng/mL), L umano ricombinante-12 (10 ng/mL), IL umano ricombinante-18 (10 ng/mL e L umano ricombinante{{ 13}}(10 ng/mL)(R&D Systems, USA) per 48 ore, quindi sostituito con terreno attivato (270 ng/mL di IL umano ricombinante-2, 20 ng/mL di IL umano ricombinante-12 , 20 ng/mL di IL umana ricombinante-18 e 20 ng/mL di IL umana ricombinante-21) per ulteriori colture. La densità cellulare è stata mantenuta a 1 × 10 gradi cellule/mL. Il giorno 28 della coltura , un piccolo numero di cellule NK autologhe è stato raccolto per il controllo di qualità e reiniettato per via endovenosa insieme a cellule NK autologhe a una densità di 4,15 × 10 gradi (3.76-5.87 × 10) cellule, con un tempo di infusione di 30 minuti Il processo sperimentale è stato condotto in conformità mente con la buona pratica clinica. L'intervallo di tempo per il secondo prelievo di sangue è stato di circa 37 ({36}}) giorni.

Isolamento di cellule T e cellule NK del sangue periferico umano Il sangue fresco è stato ottenuto da volontari sani dopo aver fornito il consenso informato e il protocollo è stato approvato dal comitato di revisione istituzionale della China Pharmaceutical University (numero di autorizzazione: SYXK2016-0011). Lymphoprep (STEMCELL Technologies, Canada) è stato utilizzato per isolare i PBMC umani. Le cellule CD3 più T umane sono state ottenute da PBMC utilizzando perline magnetiche di smistamento di cellule T CD3 umane (Miltenyi Biotec, Germania) secondo il protocollo del produttore. Le cellule NK sono state isolate dal sangue periferico utilizzando RosetteSep" Human NK Cell Enrichment Cocktail (STEMCELL Technologies) secondo il protocollo del produttore

Separazione ed espansione di cellule NK di topo in vitro

Le cellule NK spleniche di topo sono state isolate utilizzando il kit di isolamento delle cellule NK (Miltenyi Biotec) secondo le istruzioni del produttore. In breve, sono state ottenute milza di topo, le cellule della milza sono state filtrate utilizzando un filtro cellulare da 70 μm e i linfociti della milza sono stati ottenuti mediante centrifugazione in gradiente di densità utilizzando un kit di separazione dei linfociti della milza di topo (Solarbio, Cina). I linfociti splenici sono stati raccolti per ottenere cellule NK di elevata purezza utilizzando perline magnetiche per separare le cellule NK di topo. Le cellule NK spleniche isolate sono state coltivate in un mezzo di mantenimento RPMI-1640 integrato con 10% di siero bovino fetale (FBS), 1% di L-glutammina, 1% di penicillina/streptomicina, 1% di terreno essenziale minimo (MEM) non- amminoacido essenziale, 1% di acido piruvato di sodio e 50 μM di mercaptoetanolo (tutti da Life Technologies, USA). Inoltre, sono stati aggiunti al medio. Quindi sono stati raccolti cellule NK a 10 gradi e linfociti splenici irradiati a 10 gradi e 5 mL di mezzo di amplificazione (mezzo di mantenimento integrato con 1000 IU/mL rlL-2, 10 ng/mL ml-15 e 30 ng/mL anti L'anticorpo -NKp46 (PA5-46986, Invitrogen, USA)) era

Fig.3 Le SNC attivano le cellule NK e sono state uccise dalle cellule NK. La citometria a flusso per rilevare l'espressione di (A) CD69 e (B) IFN-y è stata eseguita dopo una co-incubazione di 24 ore con cellule NK di topo e preadipociti o preadipociti indotti dall'irradiazione. n =3. I dati sono presentati come mezzi±DS. Le differenze sono state valutate mediante il test t non parametrico a due code non accoppiati. **P<0.01.c snc="" apoptosis="" was="" detected="" after="" a="" 24-h="" co-incubation="" with="" dir-labeled="" nk="" cells="" by="" flow="" cytometry.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="" test.=""><0.01.d activating="" ligands="" and="" inhibitory="" ligands="" of="" nk="" cells="" on="" preadipocytes,="" doxorubicin-induced="" preadipocytes,="" or="" irradiation-induced="" preadipocytes="" were="" measured="" by="" pcr.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means="" ±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" one-way="" anova="">< 0.05(irradiation="" vs=""><0.05(doxorubicin vs="" con).e="" 1×="" 10°dir-labeled="" control="" preadipocytes="" or="" irradiation-induced="" senescent="" preadipocytes="" were="" implanted="" into="" the="" abdominal="" cavity.="" representative="" images="" showing="" fluorescence="" activity="" in="" mice="" seven="" days="" after="" 5×="" 10°nk="" cell="" treatment.="" quantification="" of="" fluorescence="" activity.="" n="3." data="" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova=""><><0.0001.f quantification="" of="" cytotoxicity="" of="" non-senescent="" and="" senescent="" counterparts="" induced="" by="" irradiation="" or="" adriamycin="" incubated="" with="" increasing="" nk="" cells="" for="" 24="" h.="" n="3.Data" are="" presented="" as="" means±="" sd.="" differences="" were="" assessed="" by="" the="" two-way="" anova="">< 0.01,=""><><0.0001. two="" parallel="" samples="" were="" set="" in="" each="" experiment="" and="" three="" independent="" experiments="" were="" performed="" for="" each="" result.="" added="" to="" a="" t25="" flask.="" every="" three="" days,="" 1000="" iu/ml="" rll-2="" was="" added="" and="" a="" fresh="" amplification="" medium="" was="" added="" on="" the="" 9th="" day="" to="" maintain="" the="" cell="" density="" at="" 1×10°cells/ml.="" nk="" cells="" were="" collected="" on="" the="" 20th="" day,="" and="" nk="" cells="" were="" amplified="" 50-fold.="" then="" the="" purity="" of="" the="" nk="" cells="" was="" determined="" by="" flow="">

Estrazione di preadipociti e cellule satelliti muscolari

I preadipociti sono stati estratti come precedentemente descritto [11]. In breve, il grasso umano o di topo è stato rimosso in condizioni sterili e tagliato in pezzi di 1-2 mm, lavato due volte con PBS e digerito con collagenasi ll (Solarbio) a 37 gradi per 1 ora. Quindi le cellule sono state filtrate con un filtro cellulare da 100 μm, centrifugate a 300 g per 5 minuti e raccolte. Le cellule aderenti sono state coltivate in a-MEM integrato con FBS al 20% per 12 ore e digerite con tripsina per raccogliere le cellule aderenti. Le cellule satelliti muscolari sono state isolate come precedentemente descritto [34]. Il muscolo quadricipite è stato tagliato in pezzi di 1-2 mm e sono stati aggiunti 5 ml di collagenasi ll per la digestione a 37°C per 12 min. La miscela è stata miscelata con una pipetta e un mezzo completo da 5 ml è stato aggiunto dopo un'ulteriore digestione per 12 minuti. Le cellule sono state filtrate utilizzando un filtro cellulare da 70 μm e centrifugate a 300 g per 5 minuti. Allora le cellule erano

coltivato con 5 ml di terreno aggiunto ogni giorno per 4 giorni. Le cellule aderenti sono state soffiate via con una pipetta e centrifugate a 2000 × g per 5 minuti. Dopo la digestione della tripsina a 37 gradi per 5 minuti, le cellule sono state centrifugate a 2000 × g per 5 minuti e raccolte. Quindi sono stati aggiunti 5 ml di mezzo di prosciutto F-10 integrato con il 20% di FBS e 4 ng/ml di fattore di crescita dei fibroblasti di base (PeproTech).

La citotossicità delle cellule NK spleniche di topo per le SNC è stata rilevata dal test della lattato deidrogenasi

Gli SNC sono stati indotti da 0.2 μM di Adriamicina (MedChemExpress, USA) per 24 ore o mediante coltura continua per 20 giorni dopo una radiazione a raggi X di 10 Gy. Quindi 5000 SNC sono stati inseriti in una piastra e cellule NK spleniche (vitalità cellulare: 93.5-97.1 percento) sono state aggiunte a rapporti effettore-bersaglio di 50:1,25:1,12,5:1, 6,25: 1,3.125:1 e 1.563:1. I supernatanti sono stati raccolti dopo la co-coltura a 37 gradi C per 24 ore e per il rilevamento è stato utilizzato un kit di rilevamento della citotossicità della lattato deidrogenasi (LDH) (Cayman Chemical, USA). La citotossicità è stata calcolata con la seguente formula: citotossicità ( percentuale )=(miscela cellula esperimento-cellula bersaglio spontanea cellula effettrice spontanea)/(cellula bersaglio massimo cellula bersaglio spontanea)× 100.

Imaging dal vivo

Topi C57BL/6 di dodici 10- settimane sono stati acquistati da Changzhou Cavens Laboratory Animal Co, Ltd. (Jiangsu, Cina). Quindi 1 × 10 gradi 1,1'-ottadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina ioduro (DiR) (Invitrogen)-controllo etichettato

preadipociti o preadipociti senescenti indotti da radiazioni sono stati risospesi in 200 ul di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e iniettati nella cavità addominale dei topi con un ago da 22 gauge. Dopo tre giorni, cellule NK allogeniche 5×10 gradi (vitalità cellulare: 93.{7}}.2 percento) in 100 ul di PBS sono state iniettate attraverso la vena della coda. Il 10° giorno, i topi sono stati anestetizzati con isoflurano. La fluorescenza è stata rilevata utilizzando il sistema di imaging in vivo della serie MS 100 (PerkinElmer, MA, USA).

Citometria a flusso

Per rilevare l'apoptosi delle SNC co-incubate con cellule NK spleniche marcate con DiR (vitalità cellulare: 91.8-93.2 percento), le SNC 1 × 10 gradi sono state digerite con precisione a 37 gradi per 10 minuti e quindi colorate con un kit di colorazione per apoptosi di annessina V e ioduro di propidio (PI) (Multisciences Biotech Co, Ltd., Cina) secondo il protocollo del produttore. Gli SNC sono stati gated nella posizione DiR-negativa. Per testare l'attivazione delle cellule NK, le cellule NK di topo sono state raccolte e colorate con mNK1.1-alloficocianina (APC)(S17016D) e con cluster di differenziazione di topo 69-R-ficoeritrina-cianina7 (mCD{{ 17}}PE-Cy7)(H1.2F3)(Biolegend, USA) a 4 gradi per 30 min. Quindi le cellule sono state processate con il CytodexCytoperm Plus Kit (BD Biosciences, USA) e colorate con interferone di topo viola gamma-brillante 421 (mlFNy-BV421) (XMG1.2) a 4 gradi per 30 minuti. La colorazione con perforina-APC(S16009A) delle cellule NK umane è stata eseguita utilizzando lo stesso protocollo utilizzato per la colorazione extracellulare (CD56-isotiocianato di fluoresceina [FITC](5.1H11), CD69-PE(FN50) ) e colorazione intracellulare (perforina-APC)(Biolegend).

Per rilevare le cellule NK del sangue periferico, sono stati raccolti 100 ul di sangue anticoagulante. Per il sangue periferico di topo sono stati aggiunti CD3-FITC, NK1.1-APC e CD69-PE-Cy7. Per il sangue periferico umano sono stati aggiunti CD3-BV421 (OKT3) e CD{10}}FITC e incubati per 20 minuti a temperatura ambiente.

Quindi sono stati aggiunti 400 μL 1 × lisato di eritrociti (BD Biosciences) e incubati per 3 minuti, seguiti da tre lavaggi con PBS. Per rilevare la proliferazione cellulare nel tessuto adiposo, i topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 200 μL di 10 mg/mL di bromodeossiuridina (BrdU) 24 e 72 ore prima dell'eutanasia. Dopo l'eutanasia, i depositi di grasso inguinale sono stati rimossi e tagliati in frammenti, digeriti a 37°C per 30 minuti con collagenasi II e DNasi e filtrati utilizzando un filtro cellulare da 100 um. Le cellule sono state processate con il kit Cytofix/Cytoperm Plus e colorate con BrdU-FITC (3D4) e Ki67-PE (16A8). La citometria a flusso è stata eseguita su un citometro a flusso CytoFLEX. Per escludere le cellule morte in tutti gli esperimenti è stato utilizzato il kit LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, USA). I dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, OR, USA).

PCR quantitativa di trascrizione inversa

L'RNA è stato estratto utilizzando il reagente Trizol e invertito e trascritto in cDNA utilizzando Hair 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Yepsen Biotechnology, Cina). La PCR quantitativa (qPCR) è stata eseguita utilizzando la miscela di reazione di SYBR Green (Yepsen Biotechnology) sul sistema ABC QuantStudio 3 Real-Time PCR (Applied Biosystems, USA), con GAPDH che funge da controllo interno. I dati sono stati analizzati utilizzando il metodo 2-△ACt. L'elenco delle sequenze di primer è riportato in Materiale supplementare (Tabella 2-3).

Colorazione con galattosidasi associata alla senescenza

Per la colorazione cellulare, le cellule sono state lavate una volta con PBS, fissate in una soluzione di galattosidasi (SA- -gal) associata alla senescenza (Cell Signaling Technology, USA) a temperatura ambiente per 15 minuti, lavate tre volte con PBS e incubate per una notte in una soluzione colorante SA- -gal a 37 gradi C. La piastra è stata sigillata con parafilm per impedire l'evaporazione del mezzo colorante. Cellule

sono stati lavati con PBS e osservati al microscopio. Per la colorazione delle sezioni congelate, le sezioni sono state asciugate a 37 gradi per 30min e fissate a temperatura ambiente in una soluzione di fissazione SA{2}}gal per 15 minuti. Le sezioni sono state lavate tre volte con PBS e incubate per una notte in una soluzione colorante SA- -gal a 37 gradi C. Quindi sono state colorate con eosina per 1 minuto e risciacquate con acqua per 2 minuti. I dati sulla colorazione SA- -gal sono stati analizzati utilizzando il software Image-Pro Plus 6.0.

Espianti di tessuto adiposo umano

Il tessuto adiposo di tre individui è stato ottenuto mediante liposuzione. Uno dei soggetti era un maschio e due erano femmine. L'età media dei soggetti era 57.0±7,6 anni (media±DS: range, 50-65). L'IMC medio era 40,5±5,1 kg/m²（media ± DS; intervallo, 36.7-46.2）. Il comitato etico dello Shanghai Mengchao Cancer Hospital (n. 05, 2020, Medical Ethics Committee dello Shanghai Mengchao Cancer Hospital) ha approvato lo schema sperimentale. Il consenso informato è stato ottenuto per tutti i volontari. Il tessuto adiposo è stato tagliato in piccoli pezzi con un diametro di circa 2 mm. Cinque pezzi di tessuto sono stati posti in ciascun pozzetto di una 96-piastra a pozzetti e 200 ul di preadipociti o mezzo condizionato da preadipociti senescenti indotti da radiazioni, integrati con il 10% di siero AB umano, 1% di L-glutamina, 1 la percentuale di penicillina/streptomicina, l'1% di amminoacidi MEM non essenziali e l'1% di acido piruvato di sodio sono stati aggiunti alla co-coltura per 24 ore. Quindi il mezzo è stato sostituito con un mezzo fresco contenente 5 × 10 gradi di cellule NK autologhe (vitalità cellulare: 92. 3-95.7 percento 6) e coltivato per altre 48 ore, dopodiché le cellule NK sono state raccolte per la citometria a flusso. Il tessuto adiposo è stato lavato cinque volte con PBS e lo stesso mezzo è stato aggiunto per un'ulteriore coltura per 48 h; il supernatante (100 ul) è stato utilizzato per il rilevamento multifattoriale. I preadipociti o preadipociti senescenti indotti da radiazioni sono stati derivati ​​​​dal tessuto adiposo dello stesso individuo.

Questo articolo è tratto da Cell Death and Disease (2022) 13:305