Complemento nella malattia renale come potenziale contributo all'ipertensione arteriosa
Mar 17, 2022
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Lisa-Maren Fischer, et al
Astratto
Obbiettivo:La deposizione del complemento è prevalente nelle biopsie renali di pazienti con ipertensione arteriosa e nefropatia ipertensiva, ma fino ad oggi non è stata dimostrata un'associazione tra ipertensione e deposizione del complemento o il coinvolgimento del complemento nella patogenesi della nefropatia ipertensiva.
Metodi:In questo studio, abbiamo analizzato la deposizione del complemento C1q e C3c in un modello di ratto di sovraccarico e ipertensione mediante nefrectomia subtotale (SNX) e in biopsie renali umane d'archivio da 217 pazienti con ipertensione nota e 91 pazienti di controllo senza storia di ipertensione utilizzando un punteggio semiquantitativo di Immunoistochimica C1q e C3c e correlazione con parametri di funzionalità renale. Per valutare se il complemento fosse depositato solo passivamente o attivamente espresso dalle cellule renali, è stata ulteriormente analizzata l'espressione dell'mRNA di C1q e C3.
Risultati:La deposizione del complemento glomerulare C1q e C3c era significativamente più alta nei reni di ratti SNX ipertesi e ipertesi rispetto ai pazienti non ipertesi. La pressione arteriosa media (BP) nei ratti SNX era ben correlata con la quantità di deposizione glomerulare di C1q e C3c e con il peso del ventricolo sinistro, come parametro indiretto di alta pressione arteriosa. L'analisi quantitativa dell'mRNA ha mostrato che C3 non è stato solo depositato, ma anche prodotto attivamente dalle cellule glomerulari di ratti SNX ipertesi e nelle biopsie renali umane. Da notare che nei pazienti lo stadio di CKD era significativamente correlato con l'intensità della colorazione glomerulare C3c, ma non con quella di C1q.
Conclusione: la deposizione del complemento renale è correlata con l'ipertensione sperimentale così come la presenza di ipertensione in una varietà direnalemalattie. Per rispondere alla domanda, se e come esattamente il complemento renale sia causa della patogenesi dell'ipertensione arteriosa negli uomini, sono necessari ulteriori studi.
Parole chiave:Rene, deposizione di complemento, ipertensione,Renalepatologia
Cistanche può curarerenalepatologia
introduzione
The complement system and its regulatory proteins are components of the innate immune system consisting of >20 fattori solubili, che svolgono un ruolo importante in (i) opsonizzazione, (ii) stimolazione di diverse vie infiammatorie e (iii) lisi osmotica di agenti patogeni e cellule danneggiate in numerose malattie, soprattutto infiammatorierenepatologia[1]. Il sistema del complemento è costituito da 3 vie: (i) la via classica, attivata da qualsiasi struttura riconosciuta da C1q [2], (ii) la via della lectina, attivata quando i pattern saccaridici sono riconosciuti dai complessi di riconoscimento del pattern [3], e (iii) la via alternativa, attivata attraverso l'idrolisi spontanea di C3 [4].
Gli ultimi 2 decenni hanno intensificato la nostra conoscenza del sistema del complemento e del suo ruolo nella patogenesi di diversi sistemici erenalemalattiecome la glomerulonefrite postinfettiva (GN), la nefropatia da IgA (IgAN), la nefrite da lupus (LN), la GN membranoproliferativa e le glomerulopatie C3 [1, 5]. Un ruolo importante del sistema del complemento e della sua disfunzione è noto anche nella patogenesi delle microangiopatie trombotiche, tra cui la sindrome emolitico-uremica atipica [6], la vasculite da IgA (ex porpora di Henoch-Schönlein) [7] e l'ipertensione maligna [8]. Sebbene i meccanismi patologici della microangiopatia trombotica siano già noti [6, 7], la nostra conoscenza del significato del sistema del complemento in relazione all'ipertensione è ancora relativamente vaga. La maggior parte dei pazienti con insufficienza renale cronica presenta una pressione sanguigna elevata (BP) [9], ma l'esatta patogenesi dell'ipertensione è sconosciuta. Sono disponibili diversi studi che descrivono un'associazione tra C3 plasmatico e ipertensione [10, 11], mentre un altro studio non ha potuto confermare queste osservazioni [12]. Nel modello di ipertensione con sale DOCA di ratto, la deposizione glomerulare di C3 è stata aumentata nei ratti con sale DOCA e diminuita dalla terapia antipertensiva, ovvero spironolattone e tripla terapia con idroclorotiazide, reserpina e idralazina [13]. Studi recenti che utilizzano modelli preclinici di ipertensione hanno suggerito un ruolo del complemento nella patogenesi dell'ipertensione [14] mediata da diverse cellule immunitarie come i macrofagi e le cellule T regolatorie (Tregs) [15-17] e l'attivazione del sistema renina-angiotensina che porta a cambiamenti fenotipici nelle cellule muscolari lisce vascolari [18]. Il ruolo dettagliato della deposizione del complemento renale nello sviluppo di valori pressori elevati non è ancora chiaro. Pertanto, in questo studio, abbiamo studiato C1q, come prodotto di scissione del classico, e C3c come marcatore comune di tutte e 3 le vie di attivazione del complemento nelle biopsie renali di pazienti ipertesi e normotesi, nonché in un modello di ratto consolidato di sovraccarico e successivo ipertensione mediante nefrectomia subtotale (SNX).
Metodi
Modello animale
Per lo studio della deposizione del complemento renale, del danno renale e delle alterazioni cardiache negli animali ipertesi, abbiamo utilizzato il modello di ratto, che è caratterizzato da iperfiltrazione glomerulare e sovraccarico dovuti alla riduzione del nefrone, glomerulosclerosi focale segmentale e globale, cicatrici tubulo-interstiziali e CKD progressiva con significativamente aumento della pressione arteriosa. I ratti sono stati mantenuti in una specifica struttura priva di agenti patogeni in un ambiente a temperatura e luce controllata e hanno avuto accesso ad libitum a cibo standard (annusare Spezialdiäten GmbH, Soest, Germania) e acqua. I ratti sono stati tenuti su lettiere in legno di pioppo pioppo classico (sniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Germania) in gabbie in makrolon di tipo IV (Tecniplast Deutschland GmbH, Hohenpeißenberg, Germania) con una popolazione massima di 3. Per l'induzione del modello, 12 maschi Dark Agouti (DA/ HanRj, Janvier, Le Genest-Saint-Isle, Francia) i ratti con un'età di 12-14 settimane erano SNX in un protocollo in 2 fasi che iniziava con una tomia non ispirata seguita da resezione standardizzata del peso dei poli superiore e inferiore dal rene rimanente 1 settimana dopo. A tale scopo, agli animali è stato somministrato Buprenovet (Bayer, Leverkusen, Germania) in una dose di 0.05 mg/kg di peso corporeo sc prima dell'intervento chirurgico. Dopo l'anestesia con isoflurano, il fianco destro è stato rasato, disinfettato con tintura KO-DAN forte (Schülke & Mayr GmbH, Norderstedt, Germania), il fianco è stato aperto con un'incisione di 1,5 cm e il rene è stato accuratamente sollevato e fissato con 2 sterili tamponi seguiti da legatura dell'afflusso di sangue renale e dell'uretere e rimozione del rene. L'incisione addominale è stata chiusa con una sutura riassorbibile e una cucitura continua così come la pelle chiusa con cuciture a bottone singolo. Una settimana dopo, il rene sinistro è stato estratto esattamente come descritto per il rene destro. Quindi l'arteria renale è stata bloccata con una clip atraumatica e il polo superiore e inferiore del rene è stato resecato con un bisturi e la superficie del taglio è stata chiusa con una spugna di collagene (Resorba medical GmbH, Norimberga, Germania). Infine, il rene rimanente è stato riportato nella sua posizione originale e l'incisione addominale è stata chiusa come descritto sopra. Sono stati valutati l'attività postoperatoria, l'assunzione di liquidi, il peso, la struttura del mantello e il comportamento degli animali, ma non hanno mostrato segni di dolore postoperatorio. Tuttavia, l'analgesia è stata mantenuta per almeno 3 giorni dopo l'intervento chirurgico. I controlli hanno ricevuto un intervento chirurgico fittizio (finto, n=11). Alla fine dell'esperimento, gli animali sono stati alloggiati per 24 ore in gabbie metaboliche per raccogliere l'urina per la misurazione della proteinuria utilizzando un saggio proteico Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories GmbH, Monaco, Germania). L'adsorbimento è stato misurato in campioni di urina diluiti con PBS a 595 nm in un lettore di micropiastre e la proteinuria è stata calcolata utilizzando una curva standard da standard di albumina sierica bovina compresa tra 0,15 e 2 mg (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Dopo 12 settimane, i ratti sono stati sottoposti a eutanasia dopo la misurazione della pressione arteriosa intra-arteriosa per 30 minuti tramite l'inserimento di un catetere nella carotide A. utilizzando il sistema di laboratorio di alimentazione degli strumenti AD (ADInstruments Ltd., Oxford, Regno Unito). Infine, i reni e i cuori sono stati raccolti e divisi in 2 parti, una è stata congelata a scatto per l'analisi dell'RNA e la seconda parte è stata elaborata per l'immunoistochimica. Il sangue è stato raccolto per il rilevamento della creatinina sierica utilizzando un autoanalizzatore (Beck man Instruments, Brea, CA, USA).
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Analisi quantitativa dell'mRNA
L'RNA totale dei reni di ratto è stato isolato utilizzando colonne RNeasy Mini (Qiagen, Hilden, Germania). Le reazioni di trascrizione inversa e la PCR in tempo reale sono state eseguite utilizzando Power SYBR Green su un sistema 7500 Fast Real-Time PCR (entrambi Applied Biosystems, Weiterstadt, Germania) secondo le istruzioni del produttore. I dati della PCR in tempo reale sono stati analizzati utilizzando il software SDS v1.3 (Applied Biosystems) e l'espressione relativa dei livelli di mRNA del gene target è stata calcolata utilizzando il metodo comparativo delta Ct [19]. La normalizzazione è stata condotta contro i livelli endogeni di rRNA 18S applicati ai cambiamenti di piega relativi risultanti. Sono stati utilizzati i seguenti primer: 18 s (fw 5′TTGATTAAGTCCCTGC-CCTTTTGT3′; rev 5′CGATCCGAGGGCCTCACTA3′); C3 (fw 5′ TGCGGCTGGAGAGTGAAG3′; rev 5′ TTACTGGCTGGAATC-TTGATGG3′) [20]; e C1qB (fw 5′TCATAGAACACGAGGAT TCCATACA3′; rev 5′GACCCAGTACAGCTGCTTTGG3′) [20].
Immunoistochimica
Per biopsie renali immunoistochimiche o rene SNX e sham rat, i campioni sono stati fissati in formalina, incorporati in paraffina e tagliati in sezioni di 1 μm e colorati in un coloratore Ventana Benchmark (Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Germania) utilizzando il seguente protocollo : il recupero dell'antigene è stato effettuato utilizzando la digestione della pronasi E per 40 minuti a 37 gradi. Dopo il blocco con Avidin-Biotin Block (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), le sezioni di siero di capra normale e blotto (1:5) sono state incubate per 1 ora a 37 gradi utilizzando i seguenti anticorpi diluiti all'1% di BSA in pH Tris 50 mM 7.4: C1q, un anticorpo policlonale di coniglio contro C1q umano (A0126; DAKO Deutschland, Amburgo, Germania) e; C3c, un anticorpo policlonale di coniglio contro C3c umano (A0062; DAKO Deutschland). Dopo il lavaggio con Tris 50 mM pH 7,4, gli anticorpi primari legati sono stati rilevati utilizzando il "Kit di rilevamento DAB universale ultra view" (Roche Diagnostics Deutschland GmbH, Mannheim, Germania). I controlli negativi includevano la delezione o la sostituzione dell'anticorpo primario con concentrazioni equivalenti di un anticorpo monoclonale murino irrilevante o di IgG preimmuni di coniglio.
Campioni di tessuto renale umano
In una prima fase, una coorte non selezionata di 308 biopsie renali d'archivio consecutive fissate in formalina e incluse in paraffina (Dipartimento di nefropatologia, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg [FAU]) è stata analizzata per la deposizione del complemento renale utilizzando l'immunoistochimica e confrontando i casi con la presenza o assenza di ipertensione arteriosa secondo le cartelle cliniche, indipendentemente dal primariorenalepatologia. Sono state incluse solo le biopsie di pazienti ipertesi e non ipertesi con BP clinicamente ben documentata. Inoltre, 46 biopsie zero da allotrapianti di rene trapiantato donate da donatori viventi non ipertensivi sono servite come controlli.
In una seconda fase, ci siamo concentrati sul confronto di gruppi comuni selezionati direnalemalattie, ovvero controlli (Zero-biopsie; n=46), IgAN (n=65), GN membranoso (MGN, n=18), LN (n=10), focale glomerulosclerosi segmentale (FSGS, n=17) e nefropatia diabetica (DN, n=28) risultanti in un sottogruppo rappresentativo di 184 biopsie. In questo sottogruppo è stata analizzata più dettagliatamente la relazione tra ipertensione arteriosa e deposizione di complemento nel contesto di diverse nefropatie comuni. Le caratteristiche di base dei pazienti sono descritte nella Tabella 1.
Valutazione istopatologica
La diagnostica della biopsia renale è stata eseguita da 3 neuropatologi specializzati e di grande esperienza durante il lavoro di routine con una discussione di consenso su tutti i casi ambigui (inclusi MBH e KA). La valutazione della morfologia dettagliata delle biopsie renali umane è stata effettuata da uno scienziato molto esperto (CD) utilizzando un punteggio semiquantitativo di glomerulosclerosi, punteggio di danno tubulare e punteggio di danno vascolare (VSI) su sezioni di paraffina colorate con PAS come descritto in precedenza [21]. La fibrosi interstiziale/atrofia tubolare (IF/TA) è stata classificata secondo la classificazione BANFF per le biopsie di trapianto renale [22]
Valutazione della retrospettiva
Dati clinici Sono stati raccolti i parametri clinici disponibili al momento della biopsia renale. I seguenti parametri sono stati inclusi per l'analisi di correlazione con i punteggi C1q e C3c, la localizzazione del complemento e i punteggi delle lesioni utilizzando il software SPSS: età del paziente, presenza o assenza di ipertensione e diabete, proteinuria, creatinina sierica, urea sierica, colesterolo sierico, proteine sieriche e fattori del complemento C3 e C4 sierici. Purtroppo, informazioni sulla durata delrenalepatologiaand current medication was not consistently available and could therefore not be systematically analyzed. In renal patients, BP is measured regularly and particularly before performing a kidney biopsy. BP measurements and grading was done according to the KDIGO guidelines for renal patients [23]. Proteinuria was measured by analysis of a 24 h urine collection and significant proteinuria was defined as urinary protein excretion >300 mg/giorno. In 2/3 di tutti i casi, la proteinuria è stata somministrata in g/24 h di urina. Solo alcuni pazienti avevano proteinuria documentata da misurazioni spot delle urine e per pochissimi pazienti non erano disponibili dati sulla proteinuria. Poiché i valori di proteinuria a 24 ore e spot possono essere difficilmente confrontati, abbiamo incluso solo i pazienti con raccolta di urina nelle 24 ore per la correlazione della proteinuria con la deposizione di complemento. Al fine di standardizzare ulteriormente i nostri risultati, abbiamo anche suddiviso i pazienti in base a diverse classi di CKD utilizzando la formula CKD-EPI per il calcolo della GFR [24] e le classi di CKD secondo la classificazione KDIGO 2012 [25].
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Valutazione semiquantitativa della deposizione di complemento nelle biopsie renali
La colorazione del complemento mediante immunoistochimica nelle biopsie renali è stata classificata separatamente nei glomeruli e nel compartimento tubulo-interstiziale. I punteggi semiquantitativi {{0}}–4 descrivono l'intensità di C3c o C1q osservabile nelle biopsie renali con ingrandimento ×200. Il punteggio 0 indica l'assenza di depositi, il punteggio 1: colorazione debole che interessa fino al 25% del compartimento indagato. Punteggio 2: colorazione moderata che interessa fino al 50 percento o colorazione forte<25% of="" the="" compartment.="" score="" 3:="" substantial="" staining="" affecting="" up="" to="" 75%="" of="" the="" investigated="" compartment.="" score="" 4:="" highest="" staining="" intensity="" affecting="">75 per cento del compartimento indagato.
C1q e C3 mRNA in biopsie renali umane
I dati per C1q e C3 nei glomeruli e nel tubulointerstizio di biopsie renali umane con diverse malattie sono stati valutati dal database Nephroseq utilizzando il set di dati Ju CKD [26].
Analisi statistiche
Dopo aver testato la distribuzione normale dei valori utilizzando il test di Kolmogorov-Smirnov, i dati sono stati analizzati utilizzando il test di Mann-Whitney per il confronto di 2 gruppi e il test di Kruskal-Wallis con il test di confronto multiplo di Dunn come test post hoc per il confronto di più gruppi. In tutti i test, p < 0.05="" è="" stato="" accettato="" come="" statisticamente="" significativo.="" il="" test="" di="" spearman="" è="" stato="" utilizzato="" per="" testare="" la="" correlazione="" della="" deposizione="" di="" complemento="" con="" i="" punteggi="" di="" danno="" renale="" e="" dati="" clinici.="" le="" analisi="" statistiche="" sono="" state="" eseguite="" utilizzando="" il="" software="" spss="" per="" windows="" (versione="" 19.0="" spss,="" ibm,="" monaco,="" germania)="" o="" il="" software="" graphpad="" prism="" 8="" per="" windows="" (versione="" 8.3,="" graphpad="" software="" inc.,="" san="" diego,="" ca,="">
Risultati
La deposizione di complemento renale C3c e C1q è presente in un modello di ratto iperteso di CKD stabile e correla con alterazioni renali e cardiache
La deposizione del complemento è stata studiata in un modello di ratto iperteso di CKD, ovvero ratti Dark Agouti subtotalmente nefrectomizzati (SNX), in cui la PA arteriosa media 12 settimane dopo l'induzione del modello era significativamente (p < 0.0="" 01)="" è="" aumentato="" (175,7="" ±="" 21,0="" mm="" hg)="" rispetto="" ai="" controlli="" simulati="" (135,8="" ±="" 2,8="" mm="" hg)="" (fig.="" 1a).="" anche="" la="" proteinuria="" era="" significativamente="" più="" alta="" in="" snx="" rispetto="" ai="" controlli="" sham="" (78,5="" ±="" 16,6="" contro="" 8,9="" ±="" 0,8="" mg/24="" h).="" questo="" modello="" di="" ratto="" da="" sovraccarico="" di="" ipertensione="" e="" insufficienza="" renale="" progressiva="" sembrava="" adatto="" per="" esaminare="" i="" cambiamenti="" associati="" all'ipertensione="" nella="" deposizione="" e="" nell'espressione="" del="" complemento="" renale.="" la="" deposizione="" glomerulare="" di="" c3c="" e="" c1q="" era="" assente="" nei="" ratti="" di="" controllo="" normotesi,="" operati="" con="" la="" simulazione="" (fig.="" 1b,="" c)="" e="" aumentava="" significativamente="" nei="" ratti="" snx="" ipertesi="" (fig.="" 1d,="" e,="" g,="" h).="" nei="" ratti="" snx,="" il="" fattore="" del="" complemento="" c3c="" non="" solo="" è="" stato="" depositato="" nel="" tessuto="" renale,="" ma="" è="" stato="" anche="" significativamente="" sovraregolato="" a="" livello="" di="" mrna="" (fig.="" 1f).="" l'espressione="" dell'mrna="" c1q="" renale="" ha="" mostrato="" una="" tendenza="" a="" livelli="" più="" elevati="" nei="" ratti="" snx="" rispetto="" ai="" controlli,="" ma="" questa="" differenza="" non="" ha="" raggiunto="" il="" significato="" (fig.="" 1i).="" è="" interessante="" notare="" che="" nei="" ratti="" sia="" la="" deposizione="" glomerulare="" di="" c3c="" che="" quella="" di="" c1q="" erano="" altamente="" correlate="" con="" la="" pressione="" arteriosa="" media="" (fig.="" 2a,="" d)="" e="" l'ipertrofia="" cardiaca="" valutata="" dal="" peso="" del="" ventricolo="" sinistro="" (fig.="" 2b,="" e).="" inoltre,="" nel="" modello="" snx,="" la="" deposizione="" del="" complemento="" renale="" è="" correlata="" al="" danno="" renale="" e="" alla="" funzione="" renale.="" il="" c3c="" glomerulare,="" così="" come="" la="" deposizione="" di="" c1q,="" hanno="" mostrato="" una="" forte="" correlazione="" con="" la="" creatinina="" sierica="" (fig.="" 2c,="" f)="" e="" la="" proteinuria="" (fig.="" 2g,="" h).="" la="" correlazione="" della="" creatinina="" sierica="" e="" della="" proteinuria="" con="" il="" complemento="" non="" era="" sorprendente="" poiché="" entrambi="" i="" parametri="" mostravano="" anche="" una="" forte="" correlazione="" tra="" loro="" in="" questo="" modello="" di="" ratto="" (fig.="" 2i).="" pertanto,="" i="" nostri="" dati="" in="" un="" modello="" di="" ratto="" di="" ckd="" ipertensiva="" dovuta="" alla="" riduzione="" e="" al="" sovraccarico="" della="" massa="" renale="" hanno="" suggerito="" un'associazione="" tra="" deposizione="" del="" complemento="" renale="" e="" ipertensione.="" pertanto,="" abbiamo="" mirato="" a="" confermare="" questi="" risultati="" in="" una="" coorte="" umana="" di="" pazienti="" ipertesi="" rispetto="" a="" pazienti="" normotesi,="" in="" cui="" è="" stata="" eseguita="" una="" biopsia="" renale="" per="" vari="">
La deposizione del complemento è indipendente dalla malattia renale sottostante
Qui, abbiamo utilizzato un approccio in 2 fasi: in primo luogo, abbiamo incluso tutti i pazienti con un valore di PA riportato indipendentemente dal sottostanterenepatologia(n=308, vedere la Tabella 1 per i dettagli). Da notare che 217 su 308 pazienti (70,5%) hanno riportato l'ipertensione. In secondo luogo, per ulteriori analisi, ci siamo concentrati sui sottogruppi delle forme più diffuse di GN, ovvero IgAN, MGN e LN, e 2 mediate da complessi non immunitarirenalemalattievale a dire DN e glomerulosclerosi segmentaria focale (FSGS). 46 biopsie zero da allotrapianti di rene trapiantato donati da donatori viventi normotesi sono servite come gruppo di controllo (vedi Tabella 1).
Per studiare una potenziale relazione tra ipertensione e complemento renale, la deposizione di C1q e C3c nel compartimento glomerulare e tubulo-interstiziale è stata analizzata mediante punteggio semiquantitativo delle colorazioni immunoistologiche. La quantità e l'intensità della colorazione C1q e C3c variavano notevolmente nelle biopsie studiate (per i dettagli vedere la Fig. 3). Nel compartimento tubulo-interstiziale, C3c è stato depositato lungo le membrane basali tubolari e all'interno della matrice interstiziale (Fig. 3G), mentre la colorazione C1q era solitamente debole e limitata all'interstizio (Fig. 3H).
La deposizione glomerulare di C3c è stata aumentata in moltirenalemalattie, tra cui IgAN, MGN, LN e FSGS, rispetto alle biopsie zero normotensive (Fig. 4A). Nel complesso, la deposizione glomerulare di C1q era più debole rispetto a quella glomerulare di C3c. È stato significativamente aumentato in IgAN, MGN, LN e DN, ma non in FSGS rispetto ai controlli a biopsia zero (Fig. 4B). È interessante notare che il complemento C3 e C1q non solo si sono depositati nei reni malati, ma è stata anche aumentata l'espressione locale dell'mRNA renale. I dati di Nephroseq hanno mostrato che l'espressione dell'mRNA di C3 e C1q era significativamente sovraregolata in IgAN, LN, DN e FSGS rispetto al gruppo di controllo, ovvero donatori viventi sani (Fig. 4C, D). L'espressione dell'mRNA di C1q era inferiore all'espressione di C3. Anche la deposizione tubulointerstiziale di C3c è stata aumentata rispetto alle biopsie zero nella maggior parte dei casirenalemalattie(Fig. 4E), mentre C1q non era significativamente diverso dai controlli a biopsia zero (dati non mostrati). In sintesi, una marcata deposizione di complemento renale è un reperto comune in varirenemalattie. Successivamente, abbiamo studiato la potenziale rilevanza di un'elevata pressione arteriosa sulla deposizione del complemento renale.
Fig. 3. Deposizione di C3c e C1q nelle biopsie renali. Le biopsie renali umane sono state colorate per C3c (A, C, E, G) e C1q (B, D, F, H) mediante immunoistochimica (colorazione marrone). Immagini rappresentative della deposizione glomerulare e tubulointerstiziale di C3c e C1q mostrano esempi di diversi punteggi di deposizione del complemento. Nessuna colorazione per C3c nelle biopsie zero (A) e C1q nella necrosi tubulare acuta (B). Esempi di deposizione glomerulare di C3c in NP ipertensivo/ischemico, punteggio 1 (C) e deposizione di C1q in classe II LN, punteggio 2 (D). Deposizione C3c più prominente in IgAN, punteggio 4 (E) e deposizione C1q, punteggio 4, in un altro caso di classe II LN (F). Deposizione nel compartimento tubulo-interstiziale di C3c nella nefrite interstiziale, punteggio 4 (G) e deposizione C1q, punteggio 4 (H) in un caso di GN postinfettiva. Le barre di scala rappresentano 100 µm. LN, nefrite lupica; GN, glomerulonefrite.
Fig. 4. Deposizione ed espressione del complemento renale in differentirenemalattie. Analisi semiquantitativa della colorazione glomerulare C3c (A) e C1q (B) in selezionatirenalemalattie. IgAN, MGN, LN, DN, FSGS e biopsie da allotrapianti di rene trapiantato donati da donatori non ipertensivi (0-biopsia) sono serviti come controlli. I dati del database Nephroseq hanno mostrato l'espressione di mRNA glomerulare C3c (C) e C1q (D) in diversirenalemalattiee il rispettivo gruppo di controllo, cioè HLD. Nel compartimento tubulo-interstiziale, principalmente C3c (E) è stato rilevato nelle biopsie renali di pazienti con varie malattie. Le differenze significative sono contrassegnate da asterischi: *p < 0.05;="" **p="">< 0.01="" e="" ***p="">< 0.001="" indicano="" differenze="" significative="" rispetto="" a="" zero-biopsie.="" gn,="" glomerulonefrite;="" mgn,="" gn="" membranoso;="" ln,="" nefrite="" lupica;="" fsgs,="" glomerulosclerosi="" segmentaria="" focale;="" dn,="" nefropatia="" diabetica;="" hld,="" donatore="" vivente;="" nefropatia="" da="" igan,="">
La deposizione renale di C3c e C1q è significativamente aumentata nei pazienti ipertesi rispetto a quelli normotesi
Per indagare se la presenza di pressione arteriosa elevata nei pazienti è associata alla deposizione di complemento renale, abbiamo analizzato biopsie di pazienti normotesi e ipertesi con vari sottostantirenemalattiee li ha confrontati con la deposizione del complemento in biopsie zero da allotrapianti di rene trapiantato donati da donatori non ipertensivi (biopsie zero). In IgAN, il GN più diffuso nella nostra regione [27], solo le biopsie di pazienti con ipertensione avevano una C3c glomerulare (Fig. 5A) e tubulointerstiziale significativamente più alta (Fig. 5C), nonché una deposizione di C1q glomerulare (Fig. 5E), rispetto a zero biopsie. Quando abbiamo confrontato la deposizione di C3c (Fig. 5B, D) e C1q (Fig. 5F) nelle biopsie renali della coorte totale, sia i campioni normotesi che quelli ipertesi hanno mostrato una reattività significativamente maggiore rispetto ai controlli. Inoltre, nelle biopsie di pazienti ipertesi glomerulari e tubulointerstiziali, C3c era significativamente più alto rispetto ai pazienti normotesi (Fig. 5B, D). Poiché la deposizione tubulare di C1q era bassa in tutte le biopsie studiate, non abbiamo osservato differenze tra i gruppi né in IgAN (Fig. 5G) né nell'analisi di tutti i casi studiati (Fig. 5H). Pertanto, i nostri dati suggeriscono che in particolare la deposizione di C3c sembra essere rilevante negli ipertesirenalemalattie.
Fig. 5. Deposizione del complemento renale nelle biopsie renali di pazienti ipertesi e normotesi. La deposizione di C3c è stata analizzata in biopsie da pazienti con IgAN (A, C) e tutte le biopsie studiate conrenalemalattie(B, D) separati in pazienti con BP normale e BP elevata rispetto alle biopsie da allotrapianti di rene trapiantato donati da donatori non ipertensivi (biopsie zero) come controlli nel compartimento glomerulare (A, B) e tubulointerstiziale (C, D). Allo stesso modo, la deposizione di C1q è stata analizzata anche nelle biopsie di pazienti con IgAN (E, G) e tutte le biopsie studiate conrenemalattie(F, H) nel compartimento glomerulare (E, F) e tubulointerstiziale (G, H). Le differenze significative sono contrassegnate da asterischi: *p < {{0}}.05;="" **p="">< 0,01="" e="" ***p="">< 0,001="" indicano="" differenze="" significative.="" bp,="" pressione="">
La deposizione del complemento renale è associata a danno e funzione renale
La valutazione delle alterazioni istopatologiche, come valutate da glomerulosclerosi (Fig. 6A), punteggio di danno tubulointerstiziale (Fig. 6B) e VSI (Fig. 6C), ha mostrato un danno renale significativo e più alto nelle biopsie di pazienti con ipertensione documentata rispetto ai pazienti normotesi. L'entità della deposizione glomerulare di C3c era correlata positivamente con glomerulosclerosi (Fig. 6D) e C3c tubulointerstiziale con danno tubulointerstiziale (Fig. 6E) e VSI (Fig. 6F), indicando che la deposizione di complemento è associata a danno renale cronico. Inoltre, la fibrosi interstiziale/atrofia tubolare (IF/TA) era significativamente più alta nelle biopsie renali di pazienti ipertesi (Fig. 6G) e si correlava bene con l'entità della deposizione tubulare di C3c (Fig. 6J). Anche la funzione renale, valutata dalla creatinina sierica, era significativamente inferiore nei pazienti ipertesi (Fig. 6H) e correlata con la deposizione glomerulare di C3c (Fig. 6K). Non è stata rilevata alcuna differenza significativa tra pazienti normotesi e ipertesi per quanto riguarda la proteinuria (Fig. 6I). Tuttavia, c'era una debole correlazione tra proteinuria e C3c glomerulare (r=0.238; p=0.008; Fig. 6L). Questi risultati hanno confermato un'associazione tra danno renale, funzione, deposito di complemento e ipertensione.
Infine, abbiamo studiato la misura in cui la deposizione del complemento dipendeva dallo stadio CKD. Come previsto, l'età media dei pazienti è aumentata con uno stadio di insufficienza renale cronica più elevato (Fig. 7A). Al contrario, la proporzione di pazienti con ipertensione era indipendente dallo stadio di CKD (Fig. 7B), confermando i nostri risultati di cui sopra. Glomerulare (Fig. 7C) e tubolare C3c (Fig. 7D) erano significativamente inferiori negli stadi 1 e 2 di CKD rispetto agli stadi CKD superiori, mentre non è stata osservata tale associazione per C1q (Fig. 7E, F).
Fig. 6. La deposizione del complemento renale nelle biopsie umane è correlata al danno e alla funzione renale. Il danno renale valutato da GSI (A), TSI (B) e VSI (C) era significativamente aumentato nei pazienti con pressione arteriosa elevata e GSI correlato alla deposizione glomerulare di C3c (D), TSI correlato a C3c tubulointerstiziale (E) e VSI correlato con C3c tubulointerstiziale (F). IF/TA (G) e creatinina sierica (H) erano aumentati nei pazienti ipertesi, mentre la proteinuria era simile in entrambi i gruppi (I). C3c tubolare correlato con IF/TA (J) e C3c glomerulare con creatinina sierica (K) e in misura più debole C3c glomerulare con proteinuria (L). Le differenze significative sono contrassegnate da asterischi: **p < 0.01="" e="" ***p="">< 0,001="" indicano="" differenze="" significative="" tra="" pazienti="" con="" pa="" normale="" e="" pa="" elevata="" o="" correlazioni="" significative.="" pressione="" sanguigna,="" pressione="" sanguigna;="" gsi,="" glomerulosclerosi;="" tsi,="" lesione="" tubulo-interstiziale;="" vsi,="" danno="" vascolare;="" if/ta,="" fibrosi="" interstiziale/atrofia="">
Fig. 7. La deposizione renale di C3 nelle biopsie umane, ma non l'ipertensione, è correlata allo stadio di CKD. L'età media dei pazienti con insufficienza renale cronica aumentava con l'aumentare dello stadio di insufficienza renale cronica (A), mentre la percentuale di pazienti ipertesi non era correlata allo stadio di insufficienza renale cronica (B). C3c (C, D) ma non C1q (E, F) ben correlato con diversi stadi di CKD. Glomerulare C3c (C), tubolare C3c (D), glomerulare C1q (E) e tubolare C1q (F). Le differenze significative sono contrassegnate da asterischi: *p < 0.{{10}}5;="" **p="">< 0,01;="" e="" ***p="">< 0,001="" indicano="" differenze="" significative="" tra="" i="" gruppi="" collegati="" da="">
Discussione
Progressione direnalepatologia, in particolare il danno tubulo-interstiziale, ha dimostrato di essere mediato, almeno in parte, dall'attivazione del complemento [28], ma il ruolo della deposizione del complemento nell'ipertensione e nel danno renale non è ancora chiaro. Nel nostro studio, abbiamo riscontrato un aumento della deposizione renale di fattori del complemento, in particolare di C3c, che era fortemente correlato con un aumento del danno renale e una funzione renale inferiore. Inoltre, molto frequentementerenepatologiaè associato all'insorgenza di ipertensione che di per sé è legata ad un aumento del rischio di malattie cardiovascolari e alla progressione di CKD [9]. Qui, abbiamo mostrato una maggiore deposizione renale di prodotti di scissione del complemento C1q, come marker della classica via di attivazione, e C3c, un componente di tutte e 3 le vie di attivazione, nei reni di pazienti ipertesi con differentirenalemalattierispetto ai pazienti normotesi. Ci sono alcune prove che il complemento svolga un ruolo importante nello sviluppo e nel peggioramento dell'ipertensione, ma il ruolo della deposizione del complemento renale in questo processo è sconosciuto. Nelle biopsie renali umane e nel nostro modello di ratto da sovraccarico ipertensivo, è diventato evidente che C3c è più frequentemente rilevabile di C1q suggerendo che la via classica non è esclusivamente responsabile dell'attivazione del complemento inrenale patologia. Tuttavia, è stato riscontrato che C1q è coinvolto in modo critico nel rimodellamento arterioso ipertensivo tramite l'attivazione della segnalazione della -catenina [29]. La questione se il complemento induca l'ipertensione o l'ipertensione attivi il complemento rimane fino ad oggi poco chiara. In questo studio, abbiamo osservato una forte correlazione tra la deposizione del complemento renale, in particolare del fattore C3c, con il grado di danno e funzione renale. Molto probabilmente l'ipertensione porta a un'ulteriore attivazione del sistema del complemento, ma ci sono alcuni rapporti a sostegno dell'ipotesi che il complemento non sia solo secondario, ma anche causativo dell'ipertensione. In uno studio longitudinale con un follow-up di 15 anni, l'incidenza di ipertensione era significativamente più alta nei pazienti con livelli plasmatici elevati di complemento C3 al basale, suggerendo un ruolo del C3 plasmatico nella patogenesi dell'ipertensione [10]. Inoltre, i pazienti con ipertensione arteriosa resistente alla terapia avevano livelli plasmatici di C3 significativamente più elevati rispetto ai pazienti con ipertensione controllata [11]. Al contrario, in uno studio di coorte basato sulla popolazione, una C3 plasmatica elevata è stata associata a un'aumentata incidenza del primo ricovero dovuto a insufficienza renale cronica ma indipendente dalla pressione arteriosa [12]. Tuttavia, quest'ultimo studio è stato limitato allo studio dei livelli plasmatici di C3, mentre l'espressione locale dei fattori del complemento e l'attivazione del complemento non sono stati studiati. I prodotti di scissione di C3, cioè C3c, non solo sono stati depositati passivamente, ma l'mRNA di C3 è stato anche espresso localmente nei reni malati di pazienti ipertesi e ratti SNX. Tuttavia, non abbiamo determinato la fonte del C3 renale, ma ci sono rapporti che oltre al fegato la maggior parte dell'mRNA di C3 è espressa nei monociti e nei macrofagi [30]. Inoltre, è stato segnalato che i fibroblasti, le cellule epiteliali ed endoteliali sono potenziali fonti extraepatiche di C3-[31]. L'attivazione del complemento è stata osservata anche in un modello di ipertensione indotta da angiotensina II nei topi. Nei ratti spontaneamente ipertesi, la carenza di C3 potrebbe abolire l'ipertensione sensibile al sale [18], indicando che C3 è coinvolto in modo critico nelle vie di induzione dell'ipertensione. Tuttavia, questi effetti possono essere mediati anche più a valle nella cascata del complemento. Utilizzando topi carenti del recettore C5a (C5aR) Zhang et al. [32] hanno dimostrato che la segnalazione di C5aR gioca un ruolo patologico nell'infiammazione e nel rimodellamento cardiaco. Sebbene l'inibizione di C5aR non abbia influenzato l'elevata pressione arteriosa indotta dall'angiotensina II, il danno cardiaco, come valutato dall'ipertrofia cardiaca, dall'infiammazione e dalla fibrosi perivascolare, potrebbe essere ridotto [33]. Nel nostro modello di ipertensione di ratto SNX, abbiamo confermato che la deposizione del complemento renale era ben correlata al danno renale ma anche all'ipertrofia cardiaca e alla pressione arteriosa. L'ipertensione indotta dal complemento è stata mediata dai recettori del complemento per C3a e C5a. Le Treg regolatorie possono inibire l'attivazione delle Treg effettrici ed esercita effetti antinfiammatori. Nel modello di ipertensione indotto dall'angiotensina II, le Treg hanno dimostrato di essere un importante modulatore della pressione arteriosa e la prevenzione del danno d'organo [15, 34]. Il trattamento con angiotensina II ha stimolato l'espressione del recettore C3a e C5a sulle Treg portando a un numero ridotto di Tregs nei topi wild-type, ma non nei topi knockout con doppio recettore C3a e C5a [35]. Inoltre, questi topi a doppio knockout hanno sviluppato ipertensione smussata e meno fibrosi renale e danno glomerulare [35]. Nel nostro studio bioptico è stata confermata anche un'associazione tra attivazione del complemento e danno glomerulare e fibrosi renale, valutata da glomerulosclerosi e IF/TA. Meccanicamente, l'aumento della PA è stato indotto dall'attivazione mediata da C3- del sistema renina-angiotensina nelle cellule muscolari lisce vascolari con molecole a valle come il TGF-ß/PDGF-A e dalla modifica del fenotipo delle cellule mesenchimali e dall'induzione dell'epitelio -transizione mesenchimale [31]. La segnalazione del complemento è stata presa di mira anche in altre malattie ipertensive. Nella gravidanza normale, l'attivazione del complemento è presente ma è eccessiva nei disturbi ipertensivi della gravidanza e i polimorfismi genetici delle proteine del complemento sembrano predisporre alla preeclampsia [36]. L'inibizione della segnalazione del complemento mediante il trattamento con il recettore 1 del complemento solubile ha provocato ipertensione attenuata in un modello di ischemia placentare di preeclampsia [37].
Limiti dello studio
Anche se abbiamo cercato di rafforzare i nostri risultati in biopsie renali umane di vario genererenalemalattiecon e senza ipertensione arteriosa mediante l'incorporazione di un modello animale appropriato per dimostrare un'associazione tra la deposizione di complemento nel tessuto renale e l'ipertensione, dobbiamo riconoscere diversi limiti e bias di selezione. Nello studio sull'uomo, ci troviamo di fronte alla limitazione di una coorte variabile con numerosi confondenti diversi che non possono essere chiaramente identificati o esclusi. Per affrontare questo aspetto e per armonizzare il gruppo di studio, abbiamo anche analizzato la correlazione del complemento con la fibrosi renale (IF/TA) come marker surrogato della perdita di nefrone e della progressione del sottostanterenalepatologiacosì come con gli stadi di CKD in cui potremmo mostrare risultati simili. Inoltre, i dati sulla durata delle rispettive malattie o sull'attuale trattamento medico non erano sistematicamente disponibili, lasciando questi aspetti come un altro potenziale fattore confondente che dobbiamo menzionare. Dal momento che abbiamo formalmente escluso quei pochi pazienti senza BP clinicamente ben documentata, è probabile che quei pazienti potrebbero non avere ipertensione o ipertensione controllata al punto che potrebbero arrivare a un follow-up regolare che potrebbe potenzialmente causare bias di selezione. Contrariamente all'esperimento sugli animali nella nostra coorte umana, la proteinuria al momento della biopsia renale non è stata riportata in modo coerente per tutti i pazienti, quindi abbiamo potuto includere solo 2/3 di tutti i pazienti per le rispettive analisi che potrebbero influenzare alcuni dei risultati. Da notare che la proteinuria non era significativamente più alta nei pazienti renali con e senza BP elevata, rendendo improbabile una distorsione significativa della proteinuria.
Conclusione
Nel complesso, il nostro studio sottolinea una forte associazione tra la deposizione di complemento e l'ipertensione, ma anche il danno renale nell'uomo e in quello sperimentalerenalepatologia. Sebbene non siamo in grado di rispondere alla domanda se la deposizione del complemento sia causa dello sviluppo dell'ipertensione, i dati supportano un coinvolgimento dell'attivazione del complemento nella patogenesi o nella progressione dell'ipertensione in varirene malattie, implicando un ruolo potenziale per strategie di inibizione del complemento per la futura gestione dei casi di ipertensione refrattari alla terapia erenalepatologia. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per affrontare l'esatto ruolo del complemento nella patogenesi delle malattie ipertensive.
Cistanche può curaremalattia renale
Da: 'CompletaRenalePatologiacome potenziale contributore all'ipertensione arteriosa' diLisa-Maren Fischer, et al
---Rene Blood Press Res 2021;46:362–376
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