Analisi della composizione e attività immunologiche degli oligosaccaridi isolati dalle Cistanche Deserticola
Mar 02, 2022
Come migliorare la memoria senza medicine?
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Ying Bai1, Hai-yan Li1, Shi-xian Chen1 1College of Food Science and Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, Cina
Astratto:È stato ottenuto un oligosaccaride (CDOS).Cistanche desertichemediante estrazione con alcali (pH{{0}}), precipitazione con etanolo e frazionamento in due frazioni purificate (ad esempio, CDOS-1 e CDOS-2) mediante Sephadex G-100 e cromatografia a filtrazione su colonna Sephadex G-25. La composizione di monosaccaridi del CDOS è stata analizzata mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). È stato riscontrato che il CDOS-1 era composto solo da saccarosio e il CDOS{7}} era composto principalmente da saccarosio, ramnosio e mannitolo, con un rapporto molare di 1:0,73:3,61. I test immunologici hanno indicato che il CDOS ha presentato un effetto significativo sull'indice della milza del topo, aumentando l'attività di fagocitosi dei macrofagi e stimolando la proliferazione delle cellule che producono anticorpi. Si spera che il CDOS si trasformi in cibo o medicina funzionale.
Parole chiave:Cistanche desertiche, oligosaccaridi, purificazione, composizione, attività immunologiche.
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1. Introduzione
Cistanche deserticheYCMa.(FamigliaOrobancacee) è una pianta parassita corta originaria del nord-ovest della Cina. L'intera pianta essiccata (senza fiori) è conosciuta come tonico e si chiama "Rou Congrong".Nella medicina orientale è classificato come dolce e salato nel gusto, caldo in natura, e attribuibile ai canali del rene e dell'intestino crasso, con la funzione di tonificare il rene e integrare l'essenza, idratare l'intestino e rilassare le viscere [1] -[3] Il moderno studio farmacologico ha dimostrato che potrebbe stimolare la sintesi del DNA e ritardare il processo di senilità, aumentare l'azione antiossidante [4], prevenire e curare le malattie cardiovascolari [3] Inoltre, potrebbe anche causare analgesici e anti -effetti infiammatori [5], migliorano l'apprendimento e la memoria inducendo fattori di crescita nervosa.Alcuni studi lo hanno indicatoC. deserticola gli estratti potrebbero attivare la funzione fagocitica dei macrofagi intra-addominali nei topi [7]-[9] e migliorare l'immunità del corpo. Secondo gli studi precedenti, questa pianta contiene molteplici costituenti attivi che includono glicosidi feniletanoidi, iridoidi, lignani, saccaridi, alcaloidi,s, ecc. [11] Come ilC. deserticola i glicosidi feniletanoidi e i polisaccaridi sono riconosciuti come i principali componenti attivi, numerosi studi si sono concentrati sulle loro strutture e bioattività negli ultimi decenni [12]-[17]. Per quanto riguarda i preziosi oligosaccaridi inC. deserticola, i rapporti sono piuttosto limitati. Gli oligosaccaridi, un saccaride a catena corta contenente zuccheri omo o eterozuccheri, sono ben noti per i loro effetti benefici sulla vita umana e sono stati ampiamente utilizzati per lungo tempo [18]. Gli oligosaccaridi funzionali, che hanno una funzione fisiologica come la bassa cariogenicità e il fattore di crescita dei bifidobatteri [19], migliorano la salute dell'uomo e degli animali. Sono stati utilizzati come ingrediente alimentare. Recentemente sono state riportate nuove funzioni degli oligosaccaridi, che hanno la capacità di modulare il sistema immunitario nell'uomo, negli animali e nei pesci [20]. In questo lavoro riportiamo la prima parte dei risultati del programma di ricerca, il frazionamento degli oligosaccaridi totali ottenuti dall'estratto alcalino diC. deserticolamediante una combinazione di ultrafiltrazione e cromatografia a permeazione di gel e l'analisi della loro composizione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC). Inoltre, presentiamo anche le attività immunologiche delC. deserticolaoligosaccaridi. A nostra conoscenza, ci sono pochi rapporti pubblicati sugli studi sull'attività immunostimolatoria diC. deserticola oligosaccaridi.
2. Sperimentale
2.1. Materiali
IlC. deserticola è stato coltivato e raccolto da Alexa League (Mongolia Interna, Cina). I topi Kunming (Grade II, sei settimane) sono stati acquistati dal Centro sperimentale di farmacologia dell'Università della Mongolia interna. Sephadex G-100, Sephadex G-25, acido trifluoroacetico (TFA), 1-fenil-3-metil-5- pirazolone (PMP), D-glucosio, D- galattosio, D-fruttosio, D-xilosio, D-mannosio, acido D-galatturonico, acido D-glucuronico, saccarosio, ramnosio, mannitolo, fucosio, ramnosio, sono stati acquistati da Sigma (St. Louis, MO, USA). RPMI medio-1640 è stato acquistato da Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, USA). Tutte le altre sostanze chimiche erano di grado analitico.
2.2. Estrazione di oligosaccaridi
I corpi essiccati diC. deserticola sono stati tagliati in pezzi più piccoli e ulteriormente macinati in polvere da un mulino sono stati estratti con etanolo anidro (3 × 5000 ml) a 70 gradi per 3 h a pressione atmosferica. Un condensatore a riflusso è stato fissato per rimuovere i lipidi. Il residuo rimasto è stato quindi estratto con alcali (pH=10) a 60 gradi per 3 volte (2 ore ogni volta). Dopo centrifugazione (2000 g per 15 minuti, a 20 gradi), il supernatante è stato concentrato a un decimo del volume in un evaporatore rotante a pressione ridotta a 50 gradi e filtrato. Quindi il filtrato è stato deproteinizzato utilizzando il reagente Sevag [21] e decolorato con carbone attivo.
2.3. Isolamento e purificazione di oligosaccaridi
Gli oligosaccaridi grezzi liofilizzati sono stati sciolti in acqua distillata, centrifugati e quindi il surnatante è stato purificato mediante una colonna Sephadex G-100 (1×50 cm), equilibrata con acqua ultrapura. Dopo aver caricato il campione, la colonna è stata eluita con acqua ultrapura ad una portata di 5 ml/min. Diverse frazioni sono state raccolte utilizzando provette. Il contenuto totale di carboidrati di ciascuna provetta è stato misurato a 490 nm dal fenolo-H2COSÌ4metodo [22]. La soluzione eluita con acqua è stata separata in due frazioni CDOS-1 e CDO-2. Due frazioni sono state rispettivamente ulteriormente purificate su una colonna Sephadex G-25 (2,7 × 85 cm) utilizzando acqua ultrapura (a una portata di 1 ml/min). Dopo aver raccolto la frazione purificata, è stata liofilizzata.
2.4. Analisi del monosaccaride composizione
La composizione monosaccaridica dei CDO è stata ottenuta mediante analisi HPLC. I CDO (2 mg) sono stati prima idrolizzati con metanolo anidro contenente 2 M HCl a 80 gradi per 16 ore in atmosfera di azoto e poi con 2 M TFA a 120 gradi per 1 ora. Dopo che il TFA è stato rimosso per evaporazione, gli idrolizzati sono stati successivamente derivatizzati con PMP secondo il metodo riportato [23] e analizzati mediante HPLC. La separazione HPLC è stata eseguita sul sistema EF-2002 HPLC (azienda KNAUER, Germania). I derivati del PMP sono stati cromatografati utilizzando il volume Sugar-PAK (6,5×300 mm, società di bicchieri d'acqua, America) e l'assorbanza è stata misurata a 245 nm. Il volume di iniezione era di 20 µL e la fase mobile, composta da PBS (solvente A) e acetonitrile (solvente B), è stata utilizzata per l'eluizione isocratica con un rapporto in volume compreso tra l'82 percento (A) e il 18 percento (B). Il tempo di esecuzione totale dell'HPLC è stato di 40 minuti e la velocità di flusso è stata di 0,5 mL/min.
2.5. Immunobiologico Attività
2.5.1. Funzione fagocitica dei monociti-macrofagi
Sessanta topi Kunming (Grade II, sei settimane) sono stati acquistati dal Centro sperimentale di farmacologia dell'Università della Mongolia interna e sono stati acclimatati per 1 settimana prima dell'uso. Tutti i topi sono stati divisi casualmente in quattro gruppi, costituiti da un gruppo di controllo con soluzione salina, un gruppo a dosaggio elevato di CDO, un gruppo a dosaggio moderato e un gruppo a dosaggio di CDO basso. I topi sono stati iniettati per via intraperitoneale con 0.5 ml di soluzione di oligosaccaridi una volta al giorno per 5 giorni. Il gruppo di dosaggio di CDO alto, moderato o basso ha ricevuto rispettivamente 10{{10}}, 50 o 25 mg/kg/PC; e 0,5 ml di soluzione salina è stata iniettata nel gruppo di controllo. Il settimo giorno è stato condotto un esperimento di eliminazione delle particelle di carbonio, secondo Hou [24], e sono stati misurati l'indice di milza e l'indice di timo. In breve, 0,05 mL/10 g/bw di inchiostro di china sono stati iniettati in ciascun topo attraverso la vena caudale, quindi sono stati ottenuti 20μL di sangue dalla vena orbitale posteriore 3 e 7 minuti dopo l'iniezione. I campioni di sangue sono stati posti in provette con 2 ml di Na allo 0,1%.2CO3e i valori di DO sono stati misurati a 600 nm. L'indice di clearance (K), l'indice fagocitico ( ) e l'indice degli organi immunitari sono stati calcolati come segue(1), t2e T1significa rispettivamente 7 minuti e 3 minuti.
2.5.2. La cellula che produce anticorpi proliferazione
Gruppi di topi Kunming (cinque per gruppo) sono stati immunizzati mediante iniezione intraperitoneale di 2 x 107SRBC in 1,0 ml di PBS aggiunto con 50 ug di materiali di prova (nessuno nel controllo). Una settimana dopo, splenociti (106cellule per 2 ml per pozzetto) da topi Kunming sono state coltivate con o senza materiali di prova per 72 ore in terreno RPMI 1640 al 10% sotto il 5% di CO2nell'aria, in triplice copia per ogni cultura. Il numero di PFC contro SRBC per 106splenociti è stato determinato.
2.6. Statistico analisi
I dati sono stati espressi come valori medi ±SD. La differenza tra i gruppi testati e il controllo è stata analizzata dal test t di Student. P < 0.05="" è="" stato="" considerato="">
3. Risultati e Discussione
3.1. Isolamento e purificazione di oligosaccaridi
I CDO sono stati isolati dall'estratto alcalino dei corpi essiccati diC. deserticola con un rendimento del 3.{14}}7 percento . Due frazioni di CDOS-1 e CDOS-2 sono state isolate dall'acqua distillata eluita rispettivamente dalla colonna Sephadex G-100 (Fig.1). Le frazioni purificate di CDOS-1 e CDOS-2 hanno mostrato un singolo picco sulla colonna Sephadex G-25, indicando che nel campione non erano presenti altri oligosaccaridi. I risultati delle composizioni di monosaccaridi hanno mostrato che il CDOS-1 era composto solo da saccarosio (Fig.2) e il CDOS{11}} era composto principalmente da saccarosio, ramnosio e mannitolo (Fig.3), con un rapporto molare di 1:0.73:3.61.
3.2. Attività immunobiologiche dei CDO
Molte prove in vivo e in vitro hanno dimostrato che gli oligosaccaridi naturali mostrano una funzione immunomodulante stimolando le risposte immunitarie sia cellulari che umorali [27], [28]. In questo documento, 100 mg/kg/bw di CDO hanno aumentato l'indice della milza del topo, ma non sono emerse differenze significative nell'indice del timo tra i gruppi trattati e i gruppi di controllo (Tabella 1). I macrofagi sono una componente importante delle difese dell'ospite contro l'infezione virale inibendo la replicazione intracellulare dei virus e uccidendo le cellule infettate dal virus [29]. Quando attivati, una varietà di intermedi e citochine dell'ossigeno o dell'azoto vengono rilasciati dai macrofagi e partecipano a varie importanti funzioni biologiche, come attività antinfiammatorie e antitumorali [30]-[32]. Pertanto, l'attività fagocitica dei macrofagi è un importante indicatore delle funzioni immunitarie dell'organismo. In questo studio, le dosi moderate e alte di CDO hanno aumentato l'attività di fagocitosi dei macrofagi (Tabella 1). La proliferazione delle cellule produttrici di anticorpi indotta dai CDO è stata studiata esaminando l'aumento della PFC emolitica nella milza di topi Kunming che sono stati immunizzati con SRBC più il campione di prova. I risultati hanno indicato che dosi moderate e alte di CDO migliorano significativamente la proliferazione delle cellule che producono anticorpi (Tabella 2). Alte dosi di CDO hanno causato un aumento molto significativo della conta dei PFC (P <>
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